Summary
Vi presenterer kylling korioallantoisk membran modell som et alternativ, transplanterbar, in vivo modell for engraftment av gynekologiske og urologiske kreft cellelinjer og pasient-avledede svulster.
Abstract
Musemodeller er referansetestene for in vivo kreftstudier. Kostnader, tid og etiske hensyn har imidlertid ført til krav om alternative kreftmodeller. Kylling korioallantoisk membran (CAM) modellen gir et billig, raskt alternativ som tillater direkte visualisering av tumorutvikling og er egnet for in vivo imaging. Som sådan forsøkte vi å utvikle en optimalisert protokoll for å fengsle gynekologiske og urologiske svulster i denne modellen, som vi presenterer her. Omtrent 7 dager etterbefruktning flyttes luftcellen til den vaskualiserte siden av egget, hvor en åpning opprettes i skallet. Svulster fra murine og menneskelige cellelinjer og primærvev kan deretter bli transplantert. Disse er vanligvis seeded i en blanding av ekstracellulær matrise og medium for å unngå cellulær spredning og gi næringsstøtte til cellene rekrutterer en vaskulær forsyning. Svulster kan da vokse i opptil 14 dager før eggene klekkes. Ved å implantere celler som er stabilt transducert med firefly luciferase, kan bioluminescensavbildning brukes til sensitiv påvisning av tumorvekst på membranen og kreftcellen spredt over hele embryoet. Denne modellen kan potensielt brukes til å studere tumorigeniitet, invasjon, metastase og terapeutisk effektivitet. Kylling CAM-modellen krever betydelig mindre tid og økonomiske ressurser sammenlignet med tradisjonelle murine modeller. Fordi eggene er immunkompromitterte og immuntolerante, kan vev fra enhver organisme potensielt implanteres uten kostbare transgene dyr (f.eks. mus) som kreves for implantering av humant vev. Imidlertid kan mange av fordelene med denne modellen potensielt også være begrensninger, inkludert kort tumorgenerasjontid og immunkompromittert / immuntolerant status. I tillegg, selv om alle tumortyper presentert her engraft i kylling chorioallantoic membran modell, gjør de det med varierende grad av tumorvekst.
Introduction
Mus har fungert som den klassiske modellorganismen for studiet av menneskelige sykdommer, inkludert malignitet. Som pattedyr deler de mange likheter med mennesker. Deres høye grad av genetisk likhet har tillatt transgen manipulering av musegenomet for å gi enorm innsikt i den genetiske kontrollen av menneskelige sykdommer1. Lang erfaring i håndteringen av og eksperimentering med mus har resultert i at de er modellen for valg for biomedisinsk forskning. Men i tillegg til de etiske og vitenskapelige bekymringene om murine modeller, kan de også være ganske kostbart og tidkrevende2,3. Utviklingen av svulster kan ta uker eller måneder. Boligen på en typisk institusjon alene kan kjøre i hundrevis til tusenvis av dollar mens svulster utvikler seg. Eggstokkreft er et eksempel på denne ulempen fordi veksten i murine modeller lett kan ta måneder. Forsinkelser i forskningsfremgang påvirker potensielt eggstokkreftpasienters vedvarende lave 5-årige overlevelsesrate på bare 47 % (dvs. en økning i overlevelse på bare 10 % over 30 år)4. Tilsvarende utgjør urologiske kreftformer (nyre-, prostata- og blærekreft) 19% av alle krefttilfeller i USA og 11% av kreftrelaterte dødsfall4. Dermed kan en ny in vivo tilnærming til å studere gynekologiske og urologiske kreftformer spare et laboratorium betydelig tid, arbeidskraft og penger, selv om denne modellen bare brukes til innledende screeningeksperimenter. I tillegg kan den resulterende akselerasjonen av forskningsfunn påvirke de 177.000 personene diagnostisert med disse kreftene årlig.
Kylling CAM modellen tilbyr mange fordeler som løser de nevnte problemene. En populær modell for å studere angiogenese5,6, tumorcelleinvasjon7,8, og metastase7,9, chick embryo CAM modellen har allerede blitt brukt til å studere mange former for kreft, inkludert glioma10,11,12, hode og nakke plateepitelkarsinom13,14, leukemi15,16, bukspyttkjertelkreft17, og kolorektal kreft18. I tillegg har CAM-modeller blitt generert for neuroblastom19, Burkitt lymfom20, melanom21og feline fibrosarcoma22. Tidligere studier har også presentert engraftment av blærekreft23 og prostatakreft cellelinjer24, men med begrensede protokolldetaljer. Ikke bare er egg mye billigere enn mus, men de produserer også svært reproduserbare resultater25,26. De viser rask vaskulaturutvikling, og tumorengraftment kan oppstå så raskt som noen få dager og visualiseres langsgående gjennom det åpne vinduet. Med 21 dagers tidsramme mellom eggbefruktning og klekking, kan eksperimenter fullføres i løpet av få uker. Videre tillater de lave kostnadene, begrensede boligbehov og små størrelse lett store eksperimenter som ville være uoverkommelige for musestudier.
Derfor forsøkte vi å optimalisere CAM-modellen for engraftment av gynekologiske og urologiske kreftformer. På grunn av den immunkompromitterte statusen til det tidlige kyllingembryoet27, kan både mus og menneskelige celler lett implanteres. Som sådan har vi med hell engrafted ovarie-, nyre-, prostata- og blærekreft. For hver av disse tumortypene aksepterer CAM lett etablerte murine- og/eller humane tumorcellelinjer. Viktigere, nyhøstet primære menneskelige tumorvev kan også engraft fra enten fordøyd celler eller biter av solid vev med høye priser på suksess. Hver av disse krefttyper og cellekilder krever optimalisering, som vi deler her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentene som presenteres her ble gjennomgått og godkjent av de riktige etiske komiteene ved University of California, Los Angeles (UCLA). Bruken av avidentifiserte, primære menneskelige svulster er godkjent av UCLA Institutional Review Board (protokollnummer 17-000037, 17-001169 og 11-001363). Ved UCLA er Animal Research Committee gjennomgang ikke nødvendig for eksperimenter ved hjelp av kyllingembryoer; protokollgodkjenning er bare nødvendig når eggene vil bli klekket ut. Imidlertid ble beste praksis, som AVMA Guidelines for euthanasia of Animals, brukt til å håndtere kyllingembryoer etisk og for å unngå smerte så mye som mulig. Forskere oppfordres til å verifisere tilsynskravene ved institusjonen før de initierer studier ved hjelp av CAM-modeller.
1. Klargjøre eggene
- Før du mottar eggene, må du montere og likere egginkubatoren til 37,8 °C (100 °F) med 60-70 % fuktighet etter produsentens instruksjoner.
MERK: For å minimere forurensningsrisikoen kan autoklaved vann brukes til å kontrollere fuktigheten. - Ved å motta befruktede, Rhode Island Red kyllingegg fra en sertifisert laboratorium-grade egg leverandør, tørk overflaten av skjellene med papirhåndklær. Et lett fuktet papirhåndkle kan brukes til å fjerne det festede materialet. Tørk umiddelbart.
MERK: Fukte skallet med væske under 43,3 °C kan introdusere bakterier i egget. Hvis man velger å vaske eller desinfisere eggene, må temperaturen på væsken være mellom 43,3-48,9 °C. Høyere temperaturer kan koke eggene. Valget av desinfeksjonsmiddel bør gjøres basert på mikroorganismer som forårsaker bekymring. - Bruk en blyant eller markør til å merke datoen på egget. Dette regnes som utviklingsdag 0.
- Plasser eggene i egginkubatoren og inkuber i minst 7 dager med rotasjon for å tillate CAM-utvikling. En automatisk rotator kan brukes, eller eggene kan roteres 180° 2-3x per dag.
2. Åpne eggene
MERK: Åpning av eggene bør gjøres når CAM-en er fullt utviklet. Dette er vanligvis på utviklingsdag 7 eller 8.
- Desinfiser et biosikkerhetsskap med 70% etanol. Tilsvarende desinfisere og plassere i biosikkerhetskabinettet et eggstativ, egg candler, markør, trådløs roterende verktøy med en silisiumkarbid slipe stein og sirkulærskjærehjul, 18 G nål, pipet kontroller med kvart-tommers vakuum rør, pakking tape, kontor saks, buet saks, Semken (eller lignende) tang, bomullballer og 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing. Når det er mulig, bruk sterile, engangs- eller autokluserte verktøy.
- Slå av eggrotatoren. Plasser ca 1-3 egg i biosikkerhetsskapet på eggstativet. Mens du er i mørket, plasser eggcandleren mot eggeskallet for å identifisere luftcellen. Merk plasseringen av luftcellen.
MERK: Intensiteten av belysning fra eggcandleren er avgjørende for å visualisere eggets indre. Hvis luftcellen eller vaskulaturen er konsekvent vanskelig å se, kan du prøve å skifte egglysebatterier. - Flytt eggcandleren over skallet for å finne et stort blodkarnettverk. Roter egget om nødvendig. En ideell vaskulatur vil forgrene seg nær midten av egget. Bruk en markør til å tegne over vaskulaturen som skal brukes til implantasjon.
- Slå på lyset i hetten. Bruk et trådløs roterende verktøy utstyrt med en silisiumkarbidslipestein, bor et lite hull i skallet rett over midten av luftcellen. Bor til det meste av skallet er fjernet, men den hvite, indre membranen er intakt.
MERK: Boring over luftcellen før du målretter mot vaskulaturen tillater å bestemme tykkelsen på det bestemte eggeskallet over luftcellen i stedet for over CAM og vaskulatur. Hvis CAM eller vaskulatur forstyrres, kan ikke egget brukes til implantasjon. - Bor og åpne et annet lite hull hvor det vaskulære vinduet vil bli åpnet som det ble gjort for luftcellen (trinn 2.4).
- Bruk en 18 G nål, stikk forsiktig gjennom den hvite, indre membranen over luftcellen og vaskulaturen. Hvis du ikke klarer å trenge inn i skallet, borer du forsiktig litt mer. Pass på at den hvite, indre membranen (men ikke CAM) forstyrres gjennom hele det borede området. Fjerning av membranstykket er ikke nødvendig.
MERK: Hvis CAM eller vaskulatur forstyrres i løpet av dette trinnet, kast egget. Skade er tydelig hvis det er blod eller albumin lekker fra et boret hull. - Slå av hettelyset. Ved hjelp av eggcandler, kontroller at luftcellen ble overført fra enden av egget til området over vaskulaturen. Om nødvendig plasserer du vakuumslangen som er satt inn i en rørkontroller rundt hullet over den opprinnelige luftcellen og forsiktig påfør suging i korte utbrudd for å flytte luftcellen.
- Bruk en markør til å skissere den nye plasseringen av luftcellen ca. 0,5 cm inne i luft-CAM-grensen. Fest et stykke pakkebånd rett over den nye luftcellen. Bruk om nødvendig standard kontorsaks til å trimme båndet til en passende størrelse.
MERK: Tape kan forstyrre luftstrømmen gjennom skallet og bør ikke være større enn nødvendig for å dekke luftcellen fullt ut. - Returner eggene til inkubatoren for å varme uten rotasjon med den nye luftcellen vendt opp. Gjenta trinn 2.2-2.9 for de resterende eggene som skal åpnes.
MERK: Protokollen kan settes på pause her. Hvis du er usikker på kvaliteten på CAM-utviklingen, bør et lite antall egg gå gjennom trinn 2,16 før de gjenværende eggene åpnes. - Plasser ca 1-3 egg med flyttede luftceller på eggstativet i biosikkerhetsskapet.
MERK: Det bør utvises forsiktighet for å unngå å innføre kontaminering i det åpnede egget. Åpne derfor alltid egg inne i et biosikkerhetsskap, og bruk sterile verktøy og utstyr når det er mulig. - Bruk et trådløs roterende verktøy utstyrt med et sirkulært skjærehjul, kutt en liten linje over luftcellegrensen trukket i trinn 2.8. Kontroller at dette er ca. 0,5 cm innenfor den faktiske luft-CAM-grensen for å unngå å forstyrre CAM eller vaskulatur. Skjær helt gjennom skallet, men vær forsiktig så du ikke trenger dypt nok til å forstyrre CAM eller vaskulatur.
- Bruk buet saks, kutt rundt den gjenværende luftcellen for å lage et vindu i skallet.
MERK: Hvis blod eller membran er tilstede på det fjernede skallet, er egget ikke egnet for implantasjon. Hvis en høy andel av eggene ikke åpnes rent, bør du vurdere å vente minst 1 ekstra dag for å åpne de resterende eggene for å tillate bedre CAM-dannelse. Hvis skjellene til de gjenværende eggene ikke har blitt gjennomboret, bør rotasjon av eggene i inkubatoren gjenopptas. - Kontroller embryoets levedyktighet. Levedyktige embryoer vil vise omfattende vaskulatur, klart albumin, embryobevegelse eller et synlig hjerteslag.
- Bruk Semken tang til å trekke små biter av bomull fra en steril bomullsdott. Blot CAM-overflaten forsiktig for å fjerne skallet støv og rusk.
MERK: Fjerning av rusk må utføres samme dag som eggene åpnes. - Dekk skallåpningen med en kvart del av 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing.
- Returner eggene til inkubatoren. Sørg for at egget sitter sikkert med det åpnevinduet vendt opp og CAM ikke berører gjennomsiktig filmdressing. Bruk et stykke eggstativ, kanten av eggrotatoren, eller et annet passende element for å støtte egg som fortsetter å rulle.
- Gjenta trinn 2.10-2.16 for alle gjenværende egg som skal åpnes.
MERK: Åpningen av eggene trenger ikke å fullføres samme dag som implantasjon. Venter minst 1 dag kan bidra til å eliminere egg hvis levedyktighet ble kompromittert ved å åpne skallet.
3. Klargjøre kreftcellesuspensjon for transplantasjon (alternativ 1)
MERK: Dette skal fullføres rett før implantasjonen, som ideelt sett skal skje mellom dag 7 og 10. Se merknader i begynnelsen av trinn 5 eller 6 for ytterligere informasjon om implantasjonsdatoen. Denne tilnærmingen ble brukt til alle cellelinjer og kultivert nyrekreft tumor fordøyer.
- Tin den ekstracellulære matriseløsningen på is.
- Bruk av mekanisk og/eller enzymatisk fordøyelse, oppnå en enkelt celle suspensjon ved hjelp av en metode som passer for celletypen blir implantert.
- Resuspender det totale antallet celler som skal implanteres i et passende medium for implantasjon. Implantater på 1-2 x 106 celler per egg er typiske.
MERK: Mediet som brukes til implantasjon av cellelinjene er vanligvis det komplette mediet som brukes til å kulere cellene, som inneholder FBS eller serumerstatning. Implantasjonen av tumorfordøyer bruker vanligvis hele mediet som brukes til å kulere cellelinjer av samme krefttype. Justeringer av mediumformuleringen kan imidlertid gjøres om nødvendig eksperimentelt. Effektene på tumorutvikling og vekst må bestemmes empirisk. - Pellet cellene ved hjelp av en sentrifuge hastighet og tid som passer for cellene som brukes. Typiske hastigheter er 250-300 x g,og tidene er 5-10 min.
- Fjern supernatanten fra pelletedcellene ved å pipettere. Mekanisk resuspendercellene i gjenværende medium via flimring eller pipettering. Plasser på is for å kjøle seg ned. Mål volumet av celler og medium ved hjelp av en passende størrelse pipt.
- Beregn implantasjonsvolumer slik at 1-2 x 106 celler implanteres i et volum på 20-100 μL per egg med en endelig ekstracellulær matrisekonsentrasjon på 2,7-4 mg/ml protein. Legg til medium, eventuelle ønskede vekstfaktorer eller tilsetningsstoffer, og ekstracellulær matriseløsning i henhold til denne beregningen. Hold på is til klar til å implantere.
MERK: For beregningene i trinn 3.3 og 3.6 bør et ekstra volum på minst en halv eggimplantat innlemmes for å sikre et tilstrekkelig volum for alle egg i gruppen. For implantasjon av ovarialkreftcellelinjene (dvs. SKOV3 og ID8), ble 106 celler per egg implantert. For implantasjon av nyrecellekarsinomcellelinjen RENCA ble kultiverte celler avledet fra fordøyd primær humant nyrecellekarsinom, prostatakreftcellelinjer (dvs. CWR, C4-2 og MyC-CaP) og blærekreftcellelinjer (dvs. HT-1376 og T24), 2 x 106 celler implantert.
4. Klargjøre tumorstykker for implantasjon (alternativ 2)
MERK: Dette skal fullføres like før implantasjon, som ideelt sett skal skje mellom dag 7 og 10. Se merknader i begynnelsen av trinn 5 eller 6 for ytterligere informasjon om implantasjonsdatoen. Primær ovarie- og blærekreft ble implantert som tumorstykker.
- Tin ekstracellulær matriseløsning på is. Fortynn til en endelig proteinkonsentrasjon på 2,7-4 mg/ml i et passende medium som inneholder ønskede vekstfaktorer eller tilsetningsstoffer. Hold på is.
MERK: Implantasjon av tumorstykker bruker vanligvis hele mediet som brukes til å kulere cellelinjer av samme krefttype. Justeringer av mediumformuleringen kan imidlertid gjøres om nødvendig eksperimentelt. Effektene på tumorengraftment og vekst må bestemmes empirisk. - Bruk en skalpell eller saks, avgiftsstykker fra den friske svulsten. Ideelle størrelser varierer fra 2-5 mm på hver side. Hold vevet nedsenket i mediet til det er klart til implantering.
5. Implantasjon ved hjelp av en nonstick-ring (alternativ 1)
MERK: Celler kan implanteres fra og med utviklingsdag 7 hvis CAM-en er fullt utviklet. Implantasjon kan oppstå når som helst før klekking som tillater tilstrekkelig tid for tumorutvikling og ønsket eksperiment, men merk at embryoets immunceller begynner å være til stede rundt dag 10 etterbefruktning27. Tumorvekstratevarierer betydelig etter celletype og må empirisk bestemmes for celletypen av interesse. Eggstokkreft og prostatakreftcellene ble implantert ved hjelp av nonstick ringmetoden. Vær oppmerksom på at når en nonstick-ring ikke er tilgjengelig, kan en rørspiss kuttes til en lignende størrelse og brukes.
- Bruk 70% etanol til å desinfisere et biosikkerhetsskap og alle nødvendige verktøy: et eggstativ, buede iristang, nonstick-ringer (1/4 tommers indre diameter), glassrørestang, passende volumrør og tips, 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing, kontorsaks og markør eller blyant. Når det er mulig, bør sterile, disponible eller autoklvede verktøy brukes.
- Legg egg som skal implanteres på et eggstativ i et biosikkerhetsskap. Velg et håndterbart antall egg. Opptil seks er typisk. Unngå å la eggene avkjøles betydelig mens du arbeider med dem.
- Fjern gjennomsiktig filmdressing fra skallet ved å rulle kantene mot det åpne vinduet for å unngå å trekke bort biter av skall. Kontroller at eggene er levedyktige og sunne. Ideelle egg vil ha et stort fartøy i midten av det åpne de åpnede området med mindre fartøy forgrening fra den.
- Bruk buede iristang, plasser en steril, nonstick-ring på CAM-en over fartøyet, ideelt sett over et grenpunkt. Bruk en steril rørestang i glass for å slipe CAM-en forsiktig.
- Rør cellesuspensjonen fra trinn 3,6 inn i midten av nonstick-ringen. Alternativt kan du bruke tang til å plassere et tumorstykke fra trinn 4,2 inn i midten av nonstick-ringen og dekke med 20-50 μL av den ekstracellulære matriseløsningen som genereres i trinn 4.1.
- Forsegle åpningen med en kvart stykke 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing. Merk eggene med en passende implantatbetegnelse.
MERK: Nummerering av eggene i en gruppe letter langsgående observasjoner. - Returner egget til inkubatoren. Pass på at åpningen av skallet sitter oppreist og at egget er sikkert.
MERK: Egg kan returneres til en egginkubator uten rotasjon. Alternativt kan høy postimplantatlevedyktighet oppnås ved hjelp av en 37-38 °C celleinkubator med CO2 deaktivert og et hygrometer for å overvåke fuktigheten, som skal være 50%-80%.
6. Implantasjon uten nonstick ring (alternativ 2)
MERK: Celler kan implanteres fra og med utviklingsdag 7 hvis CAM-en er fullt utviklet. Implantasjon kan oppstå når som helst før klekking som tillater tilstrekkelig tid for tumorutvikling og ønsket eksperiment, men merk at embryoets immunceller begynner å være til stede rundt dag 10 etterbefruktning27. Denne metoden ble brukt til å implantere nyrecellekarsinomcellene og blærekreftcellene.
- Bruk 70% etanol til å desinfisere et biosikkerhetsskap og alle nødvendige verktøy: passende volumrør og tips, sterile 10 cm vevkulturretter, eggstativ, 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing, kontorsaks og markør.
- Aspirer et inokulasjonsvolum av cellesuspensjonen som genereres i trinn 3,6 i en rørspiss i riktig størrelse (200 μL er typisk). Mens du holder den øverste delen av spissen, må du forsiktig løse ut rørspissen og plassere horisontalt i en steril, 10 cm vevskulturrett.
- Gjenta trinn 6.2 for alle prøver i en gruppe med én tallerken for hver gruppe.
- Plasser tips i en 37 °C inkubator i 15-30 min for å la den ekstracellulære matrisen delvis polymerisere.
- Etter 15 min inkubasjon, begynn å se etter polymerisering. En liten mengde væske lekker vanligvis ut av spissen når den plasseres på fatet. Polymerisering av denne væsken kan brukes til å estimere omfanget av polymerisering av væsken i spissen.
- Legg eggene som skal implanteres på et eggstativ i et biosikkerhetsskap. Velg et håndterbart antall egg. Opptil seks er typisk. Unngå å la eggene avkjøles betydelig mens du arbeider med dem.
- Fjern den gjennomsiktige filmdressingen fra skallet ved å rulle kantene mot det åpne vinduet. Dette unngår å trekke bort biter av skall.
- Kontroller at eggene er levedyktige og sunne. Ideelle egg vil ha et stort fartøy i midten av det åpne de åpnede området med mindre fartøy forgrening fra den.
- Plasser en rørspiss på en rørt i riktig størrelse. Trykk av stempelet for å tvinge den delvis polymeriserte cellesuspensjonen på CAM over et stort, godt utviklet fartøy, ideelt sett over et grenpunkt.
- Forsegle åpningen med en kvart stykke 6 x 7 cm gjennomsiktig filmdressing.
- Merk egget med en passende implantatbetegnelse.
MERK: Nummerering av eggene i en gruppe letter langsgående observasjoner. - Returner egget til inkubatoren. Pass på at åpningen av skallet sitter oppreist og at egget er sikkert.
MERK: Egg kan returneres til en dedikert egginkubator uten rotasjon. Alternativt kan høy postimplantatlevedyktighet oppnås ved hjelp av en 37-38 °C celleinkubator med CO2 deaktivert og et hygrometer for å overvåke fuktigheten, som skal være 50%-80%.
7. Bioluminescence avbildning av firefly luciferase merkede svulster
MERK: Hvis de implanterte cellene ble stabilt transducert med genet koding firefly luciferase eller andre bildefaktorer, kan de resulterende svulstene visualiseres ved hjelp av bioluminescensavbildning. Fluorescensavbildning anbefales ikke på intakte egg på grunn av høy bakgrunn fra eggeskallet. Dette er endepunktsanalyse, da åpningen av skallet drastisk reduserer overlevelsen. Svulster kan avbildet når som helst som passer for eksperimentelle behov og hastigheten på tumorvekst. Men i gjennomsnitt egg luke 21 dager etterfertilisering. Derfor er utviklingsdag 18 et passende endepunkt for å unngå uønsket klekking.
- Om nødvendig transporter egg til bildebehandlingsanlegget. Tape egg på 10 cm vev kultur retter. Returner dem til en egginkubator på 37,8 °C (100 °F) med rotasjonsmekanismen fjernet eller deaktivert. Fuktighet er ikke avgjørende for transport og bildebehandling.
- Bruk buede iristang, skyv CAM-en forsiktig bort fra skallet til CAM-en er i flukt med albumin og embryo. Bruk bredtippet prøvetang, bryte bort biter av skallet for å utvide skallåpningen tilstrekkelig for tumorvisualisering.
- Injiser minst 50 μL 30 mg/ml D-luciferin i eggalbuminet. Et lignende volum av D-luciferin kan også pipetted inn i nonstick ringen eller på overflaten av CAM i området som inneholder de implanterte cellene. Dette sikrer optimal bioluminescens i fravær av en ideell vaskulær forsyning. Inkuber i 8 min.
- Injiser 20-50 μL isofluran ei albumin av egget for å bedøve egget. Inkubat i ytterligere 2 min. Alternativt kan egget plasseres i et induksjonskammer som inneholder 2-2,5% fordampet isoflurane. Adekvat anestesidybde oppnås når embryonisk bevegelse opphører.
MERK: Større volumer av isofluran (100 μL) kan brukes til å euthanize egget. - Plasser egg i en bioluminescence bildeenhet og bilde ved hjelp av passende innstillinger som bestemmes av produsentens instruksjoner. For denne studien ble en eksponeringstid på 1 min brukt.
- For å bilde resten av CAM og embryo, åpne egget i en 10-cm vevkulturrett.
- Grip egget med fingrene på begge hender på undersiden av egget nær midten av egget og tommelen på hver side av skallåpningen.
- Trekk forsiktig fra hverandre de to halvdelene av egget med tomlene mens du forsiktig trykker inn i egget med fingrene.
- Når skallet er omtrent halvseparert fra CAM og embryo, snu egget opp ned over en 10 cm vev kultur parabolen.
- Fortsett å skille skallhalvdelene. Hvis CAM-en holder seg til innsiden av skallet, bruk fingrene forsiktig til å skyve CAM-en bort fra skallet.
- Embryoet kan vendes inn i en annen tallerken hvis ønskelig.
- Om nødvendig kan ytterligere isofluran administreres som i trinn 7.4.
8. Tumor høsting
MERK: Svulster kan høstes når som helst som passer for de eksperimentelle behovene og hastigheten på tumorvekst. Men i gjennomsnitt egg luke 21 dager etterfertilisering. Derfor er utviklingsdag 18 et passende endepunkt for å unngå uønsket klekking.
- Ta tak i svulsten med tang. Bruk av saks (våririssaks fungerer bra) eller en skalpell, forsiktig avgiftsbehandling svulst fra CAM.
- Hvis svulsten har blitt transduced med firefly luciferase genet, reimaging kan utføres for å verifisere vellykket fjerning av vanskelig å visualisere svulster.
MERK: Utskårne svulster kan analyseres ved hjelp av en hvilken som helst metode som passer for et bestemt eksperiment. Svulster kan også reimplanteres til CAM eller mus. For å bekrefte tumoridentitet kan svulster festes, parafin innebygd og undersøkes med hematoksylin og eosin eller immunohistokjemisk farging.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Så langt har vi funnet denne metoden for implantasjon for å lykkes for ovarie-, nyre-, prostata- og blærekreft. Hver ble optimalisert for å identifisere spesifikke forhold for implantasjon, selv om det kan være fleksibilitet. Av de testede tumortypene var ovariekreftveksten mye mindre uttalt og vanligvis ikke synlig uten hjelp av bioluminescensavbildning (figur 1). Imidlertid kan en stivning av CAM merkes med tang innen implantasjon. Dette kan bidra til å identifisere mulig tumorvekst i fravær av bioluminescensavbildning, selv om ytterligere validering ville være nødvendig via histologi eller en annen passende metode. Vi oppnådde vellykket engraftment av både menneskelige og murine cellelinjer som viser morfologier i samsvar med de sett i andre in vivo modeller (Figur 1A og 1B). I tillegg var implantasjon av tumorstykker mulig (Figur 1C, blå pil indikerer svulst). Den implanterte svulsten i dette tilfellet kom fra en pasient med høyverdig, metastatisk, ovarieserøst karsinom. De resulterende svulstene morfologisk lignet sine svulster av opprinnelse og uttrykte menneskespesifikke proteiner, som cytokeratin 8/ 18, som lett tillater deres differensiering fra CAM og kylling embryonale vev.
Når optimalisere tumor engraftment og vekst, passende vekstfaktorer eller hormoner kan legges på tidspunktet for implantasjon. For eksempel ble en subtil, ubetydelig økning i tumorstørrelse (målt ved total utstrålingsfluks) observert i ID8-celler når det ble supplert med tre enheter (U) av humant follikkelstimulerende hormon (FSH) på implantasjonstidspunktet (figur 1D). Valget av FSH for ovariekreftvekst stammet fra uttrykket av FSH reseptoren i ID8-celler og de høye nivåene av FSH vanligvis funnet hos postmenopausale kvinner, som utgjør flertallet av eggstokkreft tilfeller. Lignende tilnærminger kan bli vedtatt for andre vanskelig å vokse krefttyper for å forbedre nytten av CAM-modellen. Videre ble FSH bare lagt til på tidspunktet for celleimplantasjon. Etterfylle vekstfaktor eller hormon kan oppnås ved pipettering av en passende mengde av tilsetningsstoffet i mediet inn i nonstick ringen med passende intervaller, noe som kan forbedre effekten.
For nyrekreft, implantasjon av 2 x 106 klare celle nyrecellekarsinomceller fra etablerte cellelinjer, som RENCA, produsert rask, robust tumordannelse, selv om lavere celledoser også kan brukes(Figur 2A,10 dager etterimplantasjon). Resulterende svulster morfologisk lignet de oppnådd gjennom standard mus in vivo modeller28. Implantasjon av RENCA-celler merket med firefly luciferase tillatt bioluminescence imaging. Primære menneskelige svulster kan også implanteres. Svulstbitene vedvarte og rekrutterte vaskulatur uten å vise betydelig vekst. Implantasjon av fordøydceller som stammer fra en primær, klar celle nyrecellekarsinom som ble utvidet in vitro, vokste imidlertid på samme måte som de etablerte cellelinjene (Figur 2B). Nyrecellekarsinomceller kan seedes ved hjelp av enten nonstick ringmetoden eller metoden uten nonstick-ringen.
Flere cellelinjer for human og murine prostatakreft ble testet for CAM-engraftment (figur 3). Hver vokste godt når 2 x 106 celler ble implantert ved hjelp av nonstick ringen. Histologisk evaluering av de resulterende svulstene var i samsvar med forventningene til hver cellelinje. I tillegg, implantasjon av celler stabilt merket med firefly luciferase tillatt tumoridentifikasjon med bioluminescens avbildning (Figur 3A).
Blærekreft ble etablert i CAM-modellen fra etablerte cellelinjer og biter av primærmenneskelig vev (figur 4). Cellelinjer vokste godt når implantert med 2 x 106 celler uten nonstick ring (Figur 4A og 4B), selv om implantasjon med ringen var vellykket. Primær menneskelig svulst kan implanteres fra biter av vev (Figur 4C). Den presenterte saken stammer fra en pasient med høy verdig, ikke-muskel-invasiv, urothelial karsinom. Implantasjon av fordøyde celler har ennå ikke blitt forsøkt på grunn av pågående tumorfordøyelseoptimalisering. Kreftceller i de resulterende CAM-svulstene beholdt morfologien til den opprinnelige svulsten, men med en endret stromalkomponent. Tumorvekst var mindre enn for nyrecellekarsinom og prostatakreft, men fortsatt lett synlig.
For å sikre et høyt antall levedyktige, analysebare egg på endepunktet, må det tas forsiktighet ved inkubering og åpning av eggene. Hvis inkubatorforholdene er suboptimale enten før eller etter implantasjon, kan embryolevedyktighet bli kompromittert. Hvis det oppstår signifikant embryonal død, feilsøker du inkubatorforholdene i henhold til produsentens instruksjoner. Etter vår erfaring ser temperatur- og fuktighetsstabilitet ut til å være viktigere enn deres eksakte verdier. Derfor fant vi at inkubering av de inokulerte eggene i en modifisert cellekultur oppnådde CO 2-inkubator overlegen levedyktighet over å beholde eggene i små, dedikerte egginkubatorer som krever hyppigere åpning for å fylle opp vannet som styrer fuktigheten. Minimere frekvensen som de inokulerte eggene fjernes for tumorundersøkelse, kan også forbedre embryolevedyktigheten.
En ekstra bekymring for CAM implantasjon er integriteten til CAM ved inokulasjon. Hvis CAM-modulen ikke er intakt etter åpning av skallet, vil nonstick-ringen og implanterte celler synke inn i embryoets albumin (se notatet etter trinn 2.12). Dette forårsaker kreftcellespredning. Noen svulster kan fortsatt danne, men kreft som får betydelig vekst og overlevelse signaliserer fra nærliggende kreftceller, som eggstokkreft, vil ikke pålitelig danne svulster under slike forhold. Hvis nonstick ringer brukes til implantasjon, kan feilen i CAM identifiseres ved senking av ringen inn i albumin. Dette må skilles fra tilfeller der ringen og implanterte celler ble flyttet til bunnen av egget ved embryonisk bevegelse. I slike tilfeller vil ringen bli funnet mellom CAM og undersiden av skallet. Embryonisk bevegelse kan ikke kontrolleres. Ringplassering kan imidlertid gjøre det vanskeligere for embryoet å forstyrre de implanterte cellene. Ringer plassert på kantene av luftlommen generert i trinn 2.7 er mer sannsynlig å bli flyttet av embryoet enn de som er plassert i midten av feltet.
Figur 1: Representativ tumorutvikling fra eggstokkreft. Ovariekreftceller med hell implantert inkluderer: (A) den menneskelige SKOV3 cellelinjen, (B) murine ID8 cellelinjen, og (C) primære svulster. Representativ hematoksylin og eosinfarging presenteres sammen med bioluminescensavbildning, etter behov. For CAM-svulsten som følge av implantasjon av et primært tumorstykke (C) er hematoksyslin og eosinfarging av både CAM-svulsten og primærsvulstinkludert, sammen med cytokeratin 8/18 (CK 8/18) farging av den resulterende CAM-svulsten. Den blå pilen i det første panelet indikerer svulsten. (D) Tumorstørrelse på ID8-implantater med og uten 3U FSH, beregnet som total fluks som følge av bioluminescensavbildning (n = 3 for ubehandlet og n = 4 for FSH-supplert). Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representativ tumorutvikling fra klart celle nyrecellekarsinom. Svulster som følge av implantasjon av (A) murine nyrecellekarsinomcellelinjen, RENCA, eller (B) kultiverte celler avledet fra en fordøyd menneskelig primærtumor. Måleskalaen ved siden av den utskårne svulsten i (B) viser 1 mm markeringer. Tilsvarende histologi i (A) og (B) viser hematoksylin og eosin farging. I (A)vises også den representative bioluminescensavbildningen av firefly-luciferase-merkede RENCA-celler. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representativ tumorutvikling fra prostatakreftcellelinjer. Representative svulster og hematoksylin og eosin farging som følge av implantasjon av humanprostatakreft cellelinjer (A) CWR og (B) C4-2 sammen med murine cellelinjen (C) MyC-CaP. Bioluminescence avbildning av de resulterende svulster fra firefly luciferase merket CWR celler er vist i (A). Måleskalaen ved siden av de utskårne svulstene viser 1 mm markeringer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representativ tumorutvikling fra blærekreft. Representative svulster som følge av implantasjon av de etablerte humanblære kreftcellelinjene (A) HT-1376, (B) T24, og (C) primær human blæretumor. I (C)vises hematoksylin og eosinfarging av den resulterende CAM-svulsten og den primære svulsten. Måleskalaen ved siden av de utskårne svulstene viser 1 mm markeringer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorutvidelse og engraftment ved hjelp av CAM-modellen tillater raskere og direkte observerbar tumorvekst enn eksisterende in vivo dyremodeller. I tillegg er kostnadene betydelig lavere når det første kjøpet av utstyr er fullført, spesielt sammenlignet med kostnadene for immunkompromitterte mus. Den første, immunkompromitterte tilstanden av kyllingembryoer tillater lett engraftment av humant og mininvev. Selv med disse styrkene har CAM-modellen begrensninger. Den korte tiden som kan være en fordel kan også være en skade hvis langsiktige behandlingsstudier er berettiget. Den immunkompromitterte/immuntolerante statusen til CAM-modellen kan komplisere studier av tumor-immuninteraksjoner. For disse studiene kan det være nødvendig med implantering av immunceller av interesse, muligens med påfylling av immunrommet. Videre, selv om alle tumortyper vi presenterte engraft i CAM-modellen, gjør de det med varierende grad av vekst. For eksempel danner nyrecellekarsinom raskt store svulster, men ovariekreftsvulster er vanskelige å visualisere uten hjelp av bioluminescensavbildning. Tumorvekst og hastighet må vurderes for en bestemt tumortype for å avgjøre om CAM ville være en passende eksperimentell modell.
Vellykket tumorengraftment krever nøye gjennomføring av bestemte trinn i protokollen. For det første må egg inkubert under ideelle forhold for å ha optimal embryooverlevelse og CAM-dannelse før engraftment. På grunn av den naturlige variasjonen i grupper, foreslår vi å skaffe overflødige egg fra den spesifikke eggleverandøren. Vi har også funnet ut at kjøligere, rainier vær kan føre til soppvekst i eggene. Under våtere vær kan det hende at flere egg må innpodes for å oppnå tilstrekkelige utbytter ved endepunktet. Denne sesongvariasjonen vil trolig være regionspesifikk. Tilstrekkelig CAM-dannelse er avgjørende for vellykket tumorengraftment. Eventuelle indikasjoner på CAM gjenværende festet til skallet når åpningen ikke skal ignoreres. Hvis flere egg ikke klarer å ha intakt CAM når du åpner den første batchen, anbefaler vi å forsinke åpningen av de resterende eggene i minst 1 ekstra dag.
Hvis dårlig levedyktighet eller engraftment oppnås, kan flere trinn være feil. For det første kan embryolevedyktigheten fra leverandøren være dårlig. Fravær av en luftcelle og synlig vaskulatur indikerer et ikke-levedyktig egg. Noen ganger kan embryobevegelse visualiseres for å bekrefte levedyktighet. Først må du imidlertid sørge for at friske batterier er i egglyseren, fordi et sterkt lys er nødvendig for visualisering. Flytetesten kan også gjøres for å vurdere levedyktighet (en rekke instruksjoner og videoer er tilgjengelige på nettet). En annen mulig forklaring på dårlig levedyktighet er inkubatoren. Bruk et uavhengig hygrometer og termometer, sørg for at innstillingene er nøyaktige og stabile. Produsentens instruksjoner for inkubatoren bør inneholde detaljerte feilsøkingsinstruksjoner for å vurdere riktige innstillinger. Feil inkubatorinnstillinger kan også kompromittere CAM-utvikling. Bruk tape og/eller markør, bestem om eggrotatoren faktisk spinner eggene. Hvis nonstick ringer synke inn i albumin i en høy andel av de engrafted egg, da CAM ikke tilstrekkelig utvikle. Til slutt har vi funnet ut at hyppig kontroll av det engrafted egg, som fører til temperatur og fuktighetsvingninger, kan redusere postimplant levedyktighet. Hvis implanterte egg i utgangspunktet er levedyktige, men levedyktigheten minker gjennom engraftmentperioden, bør eggene kontrolleres sjeldnere. Denne reduksjonen i levedyktighet kan også skyldes unøyaktige eller upassende inkubatorinnstillinger etter implantasjon.
Når du optimaliserer denne metoden for en ny celletype, kan flere faktorer kontrolleres. Den første er cellenummer. Vi implanterer vanligvis 5 x 105-2 x 106 celler fra cellelinjer. Implanterte tumorstykker er vanligvis 2-5 mm på hver side. Disse beløpene kan justeres for å forbedre engraftment eller størrelse. Vi har imidlertid funnet ut at tumorveksten minsker over en viss terskel, som er celletype avhengig. Ytterligere engraftment parametere inkluderer tilstedeværelse eller fravær av en nonstick ring. Dette valget er vanligvis gjort basert på om ringen vil hindre endepunktsanalysen, selv om det også kan påvirke vellykket engraftment. Tilstedeværelsen av nonstick ringen kan også tillate dekker den gryende graft med middels med ønskede intervaller for å forbedre overlevelse før vaskulær rekruttering, hvis ønskelig. Valget av ekstracellulær matrisetype, konsentrasjon og medium der matrisen fortynnes, kan også påvirke engraftment. Tillegg av vekstfaktorer eller hormoner kan ytterligere forbedre tumor ta rate eller størrelse. Valget av tilsetningsstoffer og konsentrasjoner må gjøres basert på hva som ville være hensiktsmessig for den spesifikke celletypen og ikke forstyrre eksperimentet. Disse vil også ha potensial til å bli etterfylt med intervaller hvis en nonstick ring brukes.
Fremtidige anvendelser av dette modellsystemet avhenger av hypotesen som skal testes. For eksempel kan disse tumortransplantatene brukes til å teste nye terapeutiske tilnærminger for å redusere tumorstørrelse eller tømme en underpopulasjon av svulsten. Samtidig implantasjon med celler fra vertstumormikromiljøet kan tillate studier av påvirkning av disse cellene på en rekke parametere, inkludert tumorvekst og behandlingsresistens. Denne modellen kan også tjene som en mulighet til å gradvis utvide primære menneskelige svulster før etablering av xenografts i immunkompromitterte dyremodeller. Den første tilpasningen til CAM-engraftment kan kanskje lette tumortahastighet i murine-modeller. Disse søknadene er ennå ikke testet, men garanterer videre leting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Dr. Fuyuhiko Tamanoi og Binh Vu for den første treningen på denne metoden. Diskusjoner med Dr. Eva Koziolek har vært medvirkende til å optimalisere denne tilnærmingen og har blitt veldig verdsatt. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten finansiering fra følgende kilder: Tobakksrelatert sykdomsforskningsprogram Postdoktorfellesskap (27FT-0023, til ACS), Department of Defense (DoD) Ovarian Cancer Research Program (W81XWH-17-1-0160), NCI / NIH (1R21CA216770), Tobakksrelatert sykdom Research Program High Impact Pilot Award (27IR-0016), og UCLA institusjonell støtte, inkludert en JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) og et 3R Grant fra Office of the Vice Chancellor for Research til LW.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings | The O-Ring Store | TEF010 | Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE). |
| C4-2 | ATCC | CRL-3314 | Human prostate cancer cell line. |
| CWR22Rv1 | CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California) | ||
| Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) | Novus Biologicals | NBP2-44929-0.02mg | Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors. |
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Goldbio | LUCK-1G | |
| Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length | Roboz Surgical | RS6703 | This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well. |
| Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit | Dremel | 8050-N/18 | This kit contains all necessary tools. |
| Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) | AA Lab Eggs Inc. | N/A | A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally. |
| HT-1376 | ATCC | CRL-1472 | Human bladder cancer cell line. |
| Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit | Incubator Warehouse | HB1588D-NONE-1102-1588-1357 | Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used. |
| ID8 | Not commercially available, please see PMID: 10753190. | ||
| Incu-Bright Cool Light Egg Candler | Incubator Warehouse | 1102 | Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit. |
| Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips | World Precision Instrument | 15915 | This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method. |
| Isoflurane | Clipper Distributing | 0010250 | |
| IVIS Lumina II In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | ||
| Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free | Corning | 354248 | Extracellular matrix solution |
| MyC-CaP | ATCC | CRL-3255 | Murine prostate cancer cell line. |
| Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | Any similar pipet controller would be appropriate. |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | BD | 305196 | This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly. |
| RENCA | ATCC | CRL-2947 | |
| Semken Forceps | Fine Science Tools | 11008-13 | This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate. |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Human ovarian cancer cell line. |
| Specimen forceps | Electron Microscopy Sciences | 72914 | This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips. |
| Sterile Cotton Balls | Fisherbrand | 22-456-885 | This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice. |
| Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length | United Scientific Supplies | GRPL06 | This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well. |
| T24 | ATCC | HTB-4 | Human bladder cancer cell line. |
| Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" | Moore Medical | 21272 | |
| Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter | Corning | 353803 | This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary. |
| Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) | Tygon | AACUN017 | This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well. |
References
- Kersten, K., de Visser, K. E., van Miltenburg, M. H., Jonkers, J. Genetically engineered mouse models in oncology research and cancer medicine. EMBO Molecular Medicine. 9 (2), 137-153 (2017).
- Jackson, S. J., Thomas, G. J. Human tissue models in cancer research: looking beyond the mouse. Disease Models & Mechanisms. 10 (8), 939-942 (2017).
- Cheon, D. J., Orsulic, S. Mouse Models of Cancer. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 6 (1), 95-119 (2011).
- Howlader, N., et al. SEER Cancer Statistics Review, 1975-2016. , National Cancer Institute. Bethesda, MD. https://seer.cancer.gov/csr/1975_2016/ (2018).
- Ribatti, D. Chicken chorioallantoic membrane angiogenesis model. Methods Molecular Biology. 843, 47-57 (2012).
- Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering. Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).
- Lokman, N. A., Elder, A. S., Ricciardelli, C., Oehler, M. K. Chick chorioallantoic membrane (CAM) assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Science. 13 (8), 9959-9970 (2012).
- Xiao, X., et al. Chick Chorioallantoic Membrane Assay: A 3D Animal Model for Study of Human Nasopharyngeal Carcinoma. PLoS ONE. 10 (6), e0130935 (2015).
- Deryugina, E. I., Quigley, J. P. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1119-1130 (2008).
- Shoin, K., et al. Chick Embryo Assay as Chemosensitivity Test for Malignant Glioma. Japanese Journal of Cancer Research. 82 (10), 1165-1170 (1991).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Kavaliauskaitė, D., et al. The Effect of Sodium Valproate on the Glioblastoma U87 Cell Line Tumor Development on the Chicken Embryo Chorioallantoic Membrane and on EZH2 and p53 Expression. BioMed Research International. 2017, 12 (2017).
- Liu, M., et al. The Histone Methyltransferase EZH2 Mediates Tumor Progression on the Chick Chorioallantoic Membrane Assay, a Novel Model of Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Rudy, S. F., et al. In vivo Wnt pathway inhibition of human squamous cell carcinoma growth and metastasis in the chick chorioallantoic model. Journal of Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 45 (1), 26 (2016).
- Canale, S., et al. Interleukin-27 inhibits pediatric B-acute lymphoblastic leukemia cell spreading in a preclinical model. Leukemia. 25, 1815 (2011).
- Loos, C., et al. Amino-functionalized nanoparticles as inhibitors of mTOR and inducers of cell cycle arrest in leukemia cells. Biomaterials. 35 (6), 1944-1953 (2014).
- Rovithi, M., et al. Development of bioluminescent chick chorioallantoic membrane (CAM) models for primary pancreatic cancer cells: a platform for drug testing. Scientific Reports. 7, 44686 (2017).
- Majerník, M., et al. Novel Insights into the Effect of Hyperforin and Photodynamic Therapy with Hypericin on Chosen Angiogenic Factors in Colorectal Micro-Tumors Created on Chorioallantoic Membrane. International Journal of Molecular Science. 20 (12), 3004 (2019).
- Swadi, R., et al. Optimising the chick chorioallantoic membrane xenograft model of neuroblastoma for drug delivery. BMC Cancer. 18 (1), 28 (2018).
- Klingenberg, M., Becker, J., Eberth, S., Kube, D., Wilting, J. The chick chorioallantoic membrane as an in vivo xenograft model for Burkitt lymphoma. BMC Cancer. 14 (1), 339 (2014).
- Avram, S., et al. Standardization of A375 human melanoma models on chicken embryo chorioallantoic membrane and Balb/c nude mice. Oncology Reports. 38 (1), 89-99 (2017).
- Zabielska-Koczywas, K., et al. 3D chick embryo chorioallantoic membrane model as an in vivo model to study morphological and histopathological features of feline fibrosarcomas. BMC Veterinary Research. 13 (1), 201 (2017).
- Skowron, M. A., et al. Applying the chicken embryo chorioallantoic membrane assay to study treatment approaches in urothelial carcinoma. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 35 (9), e511-e523 (2017).
- Jefferies, B., et al. Non-invasive imaging of engineered human tumors in the living chicken embryo. Scientific Reports. 7 (1), 4991 (2017).
- Taizi, M., Deutsch, V. R., Leitner, A., Ohana, A., Goldstein, R. S. A novel and rapid in vivo system for testing therapeutics on human leukemias. Experimental Hematology. 34 (12), 1698-1708 (2006).
- Strojnik, T., Kavalar, R., Barone, T. A., Plunkett, R. J. Experimental model and immunohistochemical comparison of U87 human glioblastoma cell xenografts on the chicken chorioallantoic membrane and in rat brains. Anticancer Research. 30 (12), 4851-4860 (2010).
- Ribatti, D. The chick embryo chorioallantoic membrane as a model for tumor biology. Experimental Cell Research. 328 (2), 314-324 (2014).
- Hu, J., et al. A Non-integrating Lentiviral Approach Overcomes Cas9-Induced Immune Rejection to Establish an Immunocompetent Metastatic Renal Cancer Model. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 9, 203-210 (2018).
