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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos

Published: January 28, 2020 doi: 10.3791/60651
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Molecular and Medical Pharmacology, University of California Los Angeles

Summary

Apresentamos o modelo de membrana chorioallantoico de frango como uma alternativa, transplantável, no modelo vivo para o enenxerto de linhas de células cancerígenas ginecológicas e urológicas e tumores derivados do paciente.

Abstract

Os modelos mouse são os testes de referência para estudos de câncer vivo. No entanto, o custo, o tempo e as considerações éticas levaram a pedidos de alternativas nos modelos de câncer vivo. O modelo de membrana chorioallantoico de frango (CAM) fornece uma alternativa barata e rápida que permite a visualização direta do desenvolvimento do tumor e é adequada para a imagem in vivo. Como tal, buscamos desenvolver um protocolo otimizado para enenxerto de tumores ginecológicos e urológicos nesse modelo, que apresentamos aqui. Aproximadamente 7 dias após a fertilização, a célula do ar é movida para o lado vascularizado do óvulo, onde uma abertura é criada na concha. Tumores de murina e linhas celulares humanas e tecidos primários podem então ser ertados. Estes são tipicamente semeados em uma mistura de matriz extracelular e meio para evitar dispersão celular e fornecer suporte de nutrientes até que as células recrutem um suprimento vascular. Os tumores podem crescer por até 14 dias adicionais antes da eclosão dos ovos. Ao implantar células stably transinduzidas com luciferase firefly, a imagem de bioluminescência pode ser usada para a detecção sensível do crescimento tumoral na membrana e células cancerígenas espalhadas pelo embrião. Esse modelo pode potencialmente ser usado para estudar tumorigenicidade, invasão, metástase e eficácia terapêutica. O modelo CAM de frango requer significativamente menos tempo e recursos financeiros em comparação com os modelos tradicionais de murina. Como os ovos são imunocomprometidos e tolerantes imunes, tecidos de qualquer organismo podem potencialmente ser implantados sem animais transgênicos caros (por exemplo, camundongos) necessários para implantação de tecidos humanos. No entanto, muitas das vantagens deste modelo poderiam potencialmente também ser limitações, incluindo o curto tempo de geração de tumores e o status imunocomprometido/imunocomprometido/tolerante imune. Além disso, embora todos os tipos de tumores apresentados aqui enerram no modelo de membrana chorioallantoico de frango, eles o fazem com diferentes graus de crescimento tumoral.

Introduction

Os camundongos serviram como o organismo modelo clássico para o estudo de doenças humanas, incluindo a malignidade. Como mamíferos, eles compartilham muitas semelhanças com os humanos. Seu alto grau de similaridade genética permitiu que a manipulação transgênica do genoma do camundongo fornecesse uma enorme visão sobre o controle genético das doenças humanas1. A vasta experiência no manuseio e experimentação com camundongos resultou em seu ser o modelo de escolha para pesquisa biomédica. No entanto, além das preocupações éticas e científicas em relação aos modelos de murina, eles também podem ser bastante caros e demorados2,3. O desenvolvimento de tumores pode levar semanas ou até meses. A moradia em uma instituição típica sozinha pode funcionar entre centenas e milhares de dólares enquanto os tumores estão se desenvolvendo. O câncer de ovário é um exemplo dessa desvantagem porque seu crescimento em modelos de urina pode facilmente levar meses. Atrasos no progresso da pesquisa potencialmente afetam a persistente baixa taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário de apenas 47% (ou seja, um aumento na sobrevida de apenas 10% ao longo de 30 anos)4. Da mesma forma, os cânceres urológicos (cânceres de rim, próstata e bexiga) constituem 19% de todos os casos de câncer nos Estados Unidos e 11% das mortes relacionadas ao câncer4. Assim, uma nova abordagem in vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos poderia economizar um tempo, trabalho e dinheiro consideráveis, mesmo que esse modelo seja aplicado apenas a experimentos iniciais de triagem. Além disso, a aceleração resultante dos achados da pesquisa poderia impactar significativamente os 177.000 indivíduos diagnosticados com esses cânceres anualmente.

O modelo CAM de frango oferece muitas vantagens que abordam as questões acima mencionadas. Um modelo popular para estudar angiogênese5,6, invasão celular tumoral7,8, e metástase7,9, o modelo de cam de embrião filhote já foi usado para estudar muitas formas de câncer, incluindo glioma10,11,12, carcinoma celular cabeça e pescoço13,14, leucemia15,16, câncer pancreático17, e câncer colorretal18. Além disso, os modelos CAM foram gerados para neuroblastoma19,linfoma burkitt20,melanoma21e fibrosarcoma felina22. Estudos anteriores também apresentaram enenxerto de câncer de bexiga23 e linhas de células cancerígenas de próstata24,mas com detalhes limitados do protocolo. Não só os ovos são muito mais baratos que os ratos, mas também produzem resultados altamente reprodutíveis25,26. Eles mostram o desenvolvimento rápido da vasculatura, e o enenxerto tumoral pode ocorrer tão rapidamente quanto alguns dias e ser visualizado longitudinalmente pela janela aberta. Com o período de 21 dias entre fertilização de óvulos e eclosão, os experimentos podem ser concluídos dentro de algumas semanas. Além disso, as necessidades de moradia limitadas de baixo custo, e o pequeno tamanho prontamente permitem experimentos em larga escala que seriam proibitivos para estudos de camundongos.

Por isso, buscamos otimizar o modelo CAM para o enenxerto de cânceres ginecológicos e urológicos. Devido ao estado imunocomprometido do embrião de frango27precoce, tanto o rato quanto as células humanas podem ser prontamente implantados. Como tal, temos conseguido enenxertor cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Para cada um desses tipos de tumores, o CAM prontamente aceita linhas estabelecidas de murina e/ou células tumorais humanas. É importante ressaltar que os tecidos tumorais humanos primários recém-colhidos também podem enertar células digeridas ou pedaços de tecido sólido com altas taxas de sucesso. Cada um desses tipos de câncer e fontes celulares requer otimização, que compartilhamos aqui.

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Protocol

Todos os experimentos aqui apresentados foram revisados e aprovados pelos comitês éticos apropriados da Universidade da Califórnia, Los Angeles (UCLA). O uso de tumores humanos primários identificados foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da UCLA (protocolos 17-000037, 17-001169 e 11-001363). Na UCLA, a revisão do Comitê de Pesquisa Animal não é necessária para experimentos usando embriões de frango; aprovação do protocolo só é necessária quando os ovos serão eclodidos. No entanto, as melhores práticas, como as Diretrizes avma para a eutanásia dos animais, foram usadas para lidar com embriões de frango de forma ética e para evitar dor o máximo possível. Os pesquisadores são instados a verificar os requisitos de supervisão em sua instituição antes de iniciar estudos usando modelos CAM.

1. Preparando os ovos

  1. Antes de receber os ovos, monte e equilibre a incubadora de ovos a 37,8 °C (100 °F) com 60-70% de umidade seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: Para minimizar os riscos de contaminação, a água autocelava pode ser usada para controlar a umidade.
  2. Ao receber ovos de frango fertilizados, ovos de frango Vermelho de Rhode Island de um fornecedor de ovos de grau de laboratório certificado, enxugam a superfície das conchas com toalhas de papel. Uma toalha de papel levemente amorcada pode ser usada para remover o material aderido. Seque imediatamente.
    NOTA: O maçagem da casca com líquido abaixo de 43,3 °C pode introduzir bactérias no ovo. Se optar por lavar ou desinfetar os ovos, a temperatura do líquido deve ficar entre 43,3-48,9 °C. Temperaturas mais altas podem ferver os ovos. A escolha do desinfetante deve ser feita com base nos microrganismos que causam preocupação.
  3. Use um lápis ou marcador para rotular a data no ovo. Este é considerado o dia 0 de desenvolvimento.
  4. Coloque os ovos na incubadora de ovos e incuba por pelo menos 7 dias com rotação para permitir o desenvolvimento de CAM. Um rotador automático pode ser usado, ou os ovos podem ser girados 180° 2-3x por dia.

2. Abrindo os ovos

NOTA: A abertura dos ovos deve ser feita quando o CAM tiver se desenvolvido totalmente. Isso é tipicamente no dia 7 ou 8 do desenvolvimento.

  1. Desinfete um armário de biossegurança com 70% de etanol. Da mesma forma desinfetante e coloque no armário de biossegurança um rack de ovos, vela de ovo, marcador, ferramenta rotativa sem fio com uma pedra de moagem de carboneto de silício e roda de corte circular, agulha de 18 G, controlador de tubulação com tubos de 45 cm, fita de embalagem, escritório tesouras, tesouras curvas, fórceps Semken (ou similares), bolas de algodão e 6 x 7 cm de vestido de filme transparente. Sempre que possível, use ferramentas estéreis, descartáveis ou autocelavadas.
  2. Desligue o rotador de ovos. Coloque aproximadamente 1-3 ovos no armário de biossegurança no rack de ovos. Enquanto estiver escuro, coloque o velador de ovos contra a casca de ovo para identificar a célula do ar. Marque a localização da célula aérea.
    NOTA: A intensidade da iluminação do candler de ovo é crucial para visualizar o interior do ovo. Se a célula de ar ou vasculatura for consistentemente difícil de ver, tente substituir as baterias de vela de ovo.
  3. Mova o vela-de-ovo sobre a concha para encontrar uma grande rede de vasos sanguíneos. Gire o ovo se necessário. Uma vasculatura ideal será ramificar-se perto do meio do ovo. Use um marcador para desenhar sobre a vasculatura para ser usado para implantação.
  4. Acenda a luz no capô. Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma pedra de moagem de carboneto de silício, faça um pequeno buraco na concha diretamente sobre o centro da célula do ar. Perfurar até que a maior parte da casca tenha sido removida, mas a membrana interna branca está intacta.
    NOTA: Perfurar sobre a célula de ar antes de mirar a vasculatura permite determinar a espessura dessa casca de ovo particular sobre a célula do ar em vez de sobre a CAM e vasculatura. Se a CAM ou a vasculatura for interrompida, então o ovo não é utilizável para implantação.
  5. Perfurar e abrir outro pequeno buraco onde a janela vascular será aberta como foi feito para a célula aérea (passo 2.4).
  6. Usando uma agulha de 18 G, fure suavemente a membrana branca e interna sobre a célula do ar e vasculatura. Se não conseguir penetrar na casca, então perfurar um pouco mais. Certifique-se de que a membrana branca e interna (mas não a CAM) seja interrompida em toda a área perfurada. A remoção da peça de membrana não é necessária.
    NOTA: Se a CAM ou a vasculatura for interrompida durante esta etapa, descarte o ovo. O dano é evidente se há sangue ou albumina vazando de um buraco perfurado.
  7. Desligue a luz do capô. Usando o candler de ovo, verifique se a célula de ar foi transferida da extremidade do ovo para a área sobre a vasculatura. Se necessário, coloque a tubulação de vácuo inserida em um controlador pipet ao redor do orifício sobre a célula de ar original e aplique suavemente a sucção em rajadas curtas para mover a célula do ar.
  8. Use um marcador para delinear a nova localização da célula aérea aproximadamente 0,5 cm dentro do limite air-CAM. Affix um pedaço de fita adesiva logo acima da nova célula aérea. Se necessário, use a tesoura padrão do escritório para aparar a fita em um tamanho apropriado.
    NOTA: A fita pode interromper o fluxo de ar através da concha e não deve ser maior do que o necessário para cobrir totalmente a célula de ar.
  9. Devolva os ovos à incubadora para aquecer sem rotação com a nova célula de ar virada para cima. Repita as etapas 2.2-2.9 para que os ovos restantes sejam abertos.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Se não tiver certeza da qualidade do desenvolvimento da CAM, um pequeno número de ovos deve prosseguir até a etapa 2.16 antes de abrir os ovos restantes.
  10. Coloque aproximadamente 1-3 ovos com células de ar realocadas no rack de ovos no armário de biossegurança.
    NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar a introdução de contaminação no ovo aberto. Portanto, sempre abra ovos dentro de um armário de biossegurança, e use ferramentas e equipamentos estéreis sempre que possível.
  11. Usando uma ferramenta rotativa sem fio equipada com uma roda de corte circular, corte uma pequena linha sobre o limite da célula de ar desenhada na etapa 2.8. Certifique-se de que isso seja aproximadamente 0,5 cm dentro do limite real de air-CAM para evitar interromper a CAM ou vasculatura. Corte completamente através da concha, mas tenha cuidado para não penetrar profundamente o suficiente para interromper a CAM ou vasculatura.
  12. Usando uma tesoura curvada, corte em torno da célula de ar restante para criar uma janela na concha.
    NOTA: Se o sangue ou a membrana estiver presente na casca removida, então o ovo não é adequado para implantação. Se uma alta proporção dos ovos não for aberta de forma limpa, considere esperar pelo menos 1 dia adicional para abrir os ovos restantes para permitir uma melhor formação cam. Se as conchas dos ovos restantes não tiverem sido perfuradas, a rotação dos ovos dentro da incubadora deve ser retomada.
  13. Verifique a viabilidade do embrião. Embriões viáveis exibirão vasculatura extensa, albumina clara, movimento de embriões ou batimentos cardíacos visíveis.
  14. Usando fórceps Semken, puxe pequenos pedaços de algodão de uma bola de algodão estéril. Apagar suavemente a superfície da CAM para remover a poeira da concha e os detritos.
    NOTA: A remoção dos escombros deve ser realizada no mesmo dia em que os ovos são abertos.
  15. Cubra a abertura da concha com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente.
  16. Devolva os ovos para a incubadora. Certifique-se de que o ovo se sente com a janela aberta virada para cima e a CAM não toque no vestido transparente do filme. Use um pedaço de rack de ovos, a borda do rotador de ovos ou outro item adequado para sustentar quaisquer ovos que continuem rolando.
  17. Repita as etapas 2.10-2.16 para que todos os ovos restantes sejam abertos.
    NOTA: A abertura dos ovos não precisa ser concluída no mesmo dia da implantação. Esperar pelo menos 1 dia pode ajudar a eliminar ovos cuja viabilidade foi comprometida abrindo a concha.

3. Preparar a suspensão celular cancerosa para transplante (opção 1)

NOTA: Isso deve ser concluído pouco antes da implantação, que deve ocorrer idealmente entre os dias 7 e 10. Consulte notas no início da etapa 5 ou 6 para obter mais informações sobre a data de implantação. Essa abordagem foi usada para todas as linhas celulares e digerir tumores de câncer de rim cultivados.

  1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo.
  2. Usando digestão mecânica e/ou enzimática, obtenha uma suspensão de uma única célula usando um método apropriado para o tipo de célula que está sendo implantado.
  3. Resuspender o número total de células a serem implantadas em um meio adequado para implantação. Implantes de 1-2 x 106 células por ovo são típicos.
    NOTA: O meio utilizado para a implantação das linhas celulares é tipicamente o meio completo utilizado para o culturing as células, contendo FBS ou substituição de soro. A implantação de digerir tumores normalmente utiliza o meio completo usado para o culturing linhas celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação média podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos sobre o desenvolvimento e o crescimento tumoral precisariam ser empiricamente determinados.
  4. Pelotas as células usando uma velocidade centrífuga e tempo apropriados para as células que estão sendo usadas. As velocidades típicas são de 250-300 x g,e os tempos são de 5-10 min.
  5. Remova o supernatant das células de pelotas canalizando. Resuspender mecanicamente as células no meio residual através de flicking ou pipetting. Coloque no gelo para esfriar. Meça o volume de células e médios usando um tubo de tamanho adequado.
  6. Calcule os volumes de implantação de forma que 1-2 x 106 células são implantadas em um volume de 20-100 μL por ovo com uma concentração final de matriz extracelular de proteína de 2,7-4 mg/mL. Adicione fatores de crescimento médios, quaisquer fatores ou aditivos de crescimento desejados e solução de matriz extracelular de acordo com este cálculo. Mantenha o gelo até estar pronto para implantar.
    NOTA: Para os cálculos nas etapas 3.3 e 3.6, deve ser incorporado um volume extra de pelo menos meio implante de óvulos para garantir um volume adequado para todos os ovos do grupo. Para implantação das linhas celulares cancerosas de ovário (ou seja, SKOV3 e ID8), foram implantadas 106 células por ovo. Para implantação da linha de células renais do carcinoma RENCA, células cultivadas derivadas de carcinoma de células renais humanas primárias digeridas, linhas de células cancerígenas de próstata (ou seja, CWR, C4-2 e MyC-CaP) e linhas de células cancerígenas de bexiga (ou seja, HT-1376 e T24), 2 x 106 células foram implantadas.

4. Preparar peças tumorais para implantação (opção 2)

NOTA: Isso deve ser concluído pouco antes da implantação, que deve ocorrer idealmente entre os dias 7 e 10. Consulte notas no início da etapa 5 ou 6 para obter mais informações sobre a data de implantação. Cânceres primários de ovário e bexiga foram implantados como pedaços de tumor.

  1. Descongele a solução de matriz extracelular no gelo. Diluir a uma concentração de proteína final de 2,7-4 mg/mL em um meio apropriado contendo quaisquer fatores ou aditivos de crescimento desejados. Mantenha no gelo.
    NOTA: A implantação de peças tumorais normalmente utiliza o meio completo usado para o culturing linhas celulares do mesmo tipo de câncer. No entanto, ajustes na formulação média podem ser feitos se necessário experimentalmente. Os efeitos sobre o enenxerto tumoral e o crescimento precisariam ser empiricamente determinados.
  2. Usando um bisturi ou tesoura, excisse pedaços do tumor fresco. Os tamanhos ideais variam de 2-5 mm em cada lado. Mantenha os tecidos imersos no meio até que estejam prontos para implantar.

5. Implantação usando um anel antiaderente (opção 1)

NOTA: As células podem ser implantadas a partir do dia 7 de desenvolvimento se o CAM for totalmente desenvolvido. A implantação pode ocorrer a qualquer momento antes da eclosão que permite tempo adequado para o desenvolvimento do tumor e o experimento desejado, mas note que as células imunes do embrião começam a estar presentes por volta do dia 10 após a pósfertilização27. A taxa de crescimento do tumor varia consideravelmente pelo tipo celular e precisa ser empiricamente determinada para o tipo de interesse celular. O câncer de ovário e as células cancerígenas da próstata foram implantados usando o método do anel antiaderente. Observe que quando um anel antiaderente não estiver disponível, uma ponta pipet pode ser cortada para um tamanho semelhante e usada.

  1. Use 70% de etanol para desinfetar um armário de biossegurança e todas as ferramentas necessárias: um rack de ovos, fórceps de íris curvas, anéis antiaderente (diâmetro interno de 1/4 polegada), haste de agitação de vidro, tubos de volume apropriados e pontas, 6 x 7 cm de molho de filme transparente, tesoura de escritório e marcador ou lápis. Sempre que possível, ferramentas estéreis, descartáveis ou autocelavadas devem ser usadas.
  2. Coloque os ovos a serem implantados em um rack de ovos em um armário de biossegurança. Selecione um número gerenciável de ovos. Até seis é típico. Evite permitir que os ovos esfriem substancialmente enquanto trabalham com eles.
  3. Remova o curativo transparente da concha, rolando as bordas em direção à janela aberta para evitar afastar pedaços de concha. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis. Os ovos ideais terão um grande navio no centro da área aberta com embarcações menores ramificando-se dele.
  4. Usando fórceps de íris curvas, coloque um anel estéril e antiaderente na CAM sobre a embarcação, idealmente sobre um ponto de ramo. Use uma haste de vidro estéril para abrajo suavemente o CAM.
  5. Pipet a suspensão celular da etapa 3.6 para o centro do anel antiaderente. Alternativamente, use fórceps para colocar uma peça tumoral da etapa 4.2 no centro do anel antiaderente e cubra com 20-50 μL da solução de matriz extracelular gerada na etapa 4.1.
  6. Selar a abertura com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente. Rotular os ovos com uma designação de implante apropriada.
    NOTA: Numerar os ovos dentro de um grupo facilita observações longitudinal.
  7. Devolva o ovo para a incubadora. Certifique-se de que a abertura da concha fique ereta e que o ovo esteja seguro.
    NOTA: Os ovos podem ser devolvidos a uma incubadora de ovos sem rotação. Alternativamente, a viabilidade pós-implante pode ser obtida utilizando uma incubadora de células 37-38 °C com o CO2 desativado e um hidrômetro para monitorar a umidade, que deve ser de 50%-80%.

6. Implantação sem anel antiaderente (opção 2)

NOTA: As células podem ser implantadas a partir do dia 7 de desenvolvimento se o CAM for totalmente desenvolvido. A implantação pode ocorrer a qualquer momento antes da eclosão que permite tempo adequado para o desenvolvimento do tumor e o experimento desejado, mas note que as células imunes do embrião começam a estar presentes por volta do dia 10 após a pósfertilização27. Este método foi usado para implantar as células cancerígenas das células renais e as células cancerígenas da bexiga.

  1. Use 70% de etanol para desinfetar um armário de biossegurança e todas as ferramentas necessárias: tubos e dicas de volume apropriados, pratos estéreis de cultura de tecido de 10 cm, rack de ovos, 6 x 7 cm de molho de filme transparente, tesoura de escritório e marcador.
  2. Aspirar um volume de inoculação da suspensão celular gerada na etapa 3.6 em uma ponta de tubulação de tamanho apropriado (200 μL é típico). Enquanto segura a porção superior da ponta, ejete cuidadosamente a ponta da pipet e coloque horizontalmente em um prato estéril de cultura de tecido de 10 cm.
  3. Repita o passo 6.2 para todas as amostras dentro de um grupo com um prato para cada grupo.
  4. Coloque dicas em uma incubadora de 37 °C por 15-30 min para permitir que a matriz extracelular polimerize parcialmente.
  5. Após 15 min de incubação, comece a verificar a polimerização. Uma pequena quantidade de líquido normalmente vaza da ponta quando colocado no prato. A polimerização desse líquido pode ser usada para estimar a extensão da polimerização do líquido dentro da ponta.
  6. Coloque os ovos a serem implantados em um rack de ovos em um armário de biossegurança. Selecione um número gerenciável de ovos. Até seis é típico. Evite permitir que os ovos esfriem substancialmente enquanto trabalham com eles.
  7. Remova o curativo transparente da concha rolando as bordas em direção à janela aberta. Isso evita afastar pedaços de concha.
  8. Verifique se os ovos são viáveis e saudáveis. Os ovos ideais terão um grande navio no centro da área aberta com embarcações menores ramificando-se dele.
  9. Coloque uma ponta de pipet em um pipet de tamanho apropriado. Deprimir o êmbolo para forçar a suspensão parcial de células polimerizadas na CAM sobre um vaso grande e bem desenvolvido, idealmente sobre um ponto de ramo.
  10. Selar a abertura com um quarto de peça de 6 x 7 cm de filme transparente.
  11. Rotular o ovo com uma designação de implante apropriada.
    NOTA: Numerar os ovos dentro de um grupo facilita observações longitudinal.
  12. Devolva o ovo para a incubadora. Certifique-se de que a abertura da concha fique ereta e que o ovo esteja seguro.
    NOTA: Os ovos podem ser devolvidos a uma incubadora dedicada de ovos sem rotação. Alternativamente, a viabilidade pós-implante pode ser obtida utilizando uma incubadora de células 37-38 °C com o CO2 desativado e um hidrômetro para monitorar a umidade, que deve ser de 50%-80%.

7. Imagens de bioluminescência da luciferase firefly marcaram tumores

NOTA: Se as células implantadas foram transinduzidas com a luciferase de codificação genética ou outros fatores de imagem, os tumores resultantes podem ser visualizados usando imagens de bioluminescência. A imagem de fluorescência não é recomendada em ovos intactos devido ao alto fundo da casca de ovo. Esta é a análise do ponto final, pois a abertura da concha reduz drasticamente a sobrevivência. Tumores podem ser imagens a qualquer momento que seja apropriada para necessidades experimentais e a velocidade do crescimento tumoral. No entanto, em média, os ovos eclodem 21 dias após a fertilização. Portanto, o dia 18 de desenvolvimento é um ponto final apropriado para evitar a eclosão indesejada.

  1. Se necessário, transporte de ovos para a instalação de imagens. Fita ovos em pratos de cultura de tecido de 10 cm. Devolvê-los a uma incubadora de ovos de 37,8 °C com o mecanismo de rotação removido ou desativado. A umidade não é crucial para o transporte e a imagem.
  2. Usando fórceps de íris curvas, empurre suavemente o CAM para longe da concha até que o CAM esteja alinhado com a albumina e embrião. Usando fórceps de espécimes de ponta larga, quebre pedaços da concha para expandir adequadamente a abertura da concha para visualização tumoral.
  3. Injete um mínimo de 50 μL de 30 mg/mL D-luciferin a albumina de ovos. Um volume semelhante de D-luciferina também pode ser canalizado no anel antiaderente ou na superfície da CAM na área contendo as células implantadas. Isso garante a bioluminescência ideal na ausência de um suprimento vascular ideal. Incubar por 8 min.
  4. Injete 20-50 μL de isoflurano na albumina do ovo para anestesiar o ovo. Incubar por mais 2 min. Alternativamente, o ovo pode ser colocado em uma câmara de indução contendo isoflurane vaporizada de 2-2,5%. Profundidade adequada de anestesia é obtida quando o movimento embrionário cessa.
    NOTA: Maiores volumes de isoflurano (100 μL) podem ser usados para eutanásia do ovo.
  5. Coloque os ovos em um dispositivo de imagem de bioluminescência e imagem usando configurações apropriadas conforme determinado pelas instruções do fabricante. Para este estudo, foi utilizado um tempo de exposição de 1 min.
  6. Para imaginar o restante cam e embrião, abra o ovo em um prato de cultura de tecido de 10 cm.
    1. Segure o ovo com os dedos de ambas as mãos na parte inferior do ovo perto do meio do ovo e os polegares de ambos os lados da abertura da concha.
    2. Retire delicadamente as duas metades do ovo com os polegares enquanto pressiona suavemente o ovo com os dedos.
    3. Quando a casca estiver aproximadamente meio separada do CAM e embrião, vire o ovo de cabeça para baixo sobre um prato de cultura de tecido de 10 cm.
    4. Continue separando as metades da concha. Se o CAM gruda no interior da concha, use suavemente os dedos para afastar o CAM da concha.
    5. O embrião pode ser transformado em outro prato, se desejar.
    6. Se necessário, isoflurano adicional pode ser administrado como na etapa 7.4.

8. Colheita de tumores

NOTA: Os tumores podem ser colhidos a qualquer momento que seja apropriado para as necessidades experimentais e a velocidade do crescimento do tumor. No entanto, em média, os ovos eclodem 21 dias após a fertilização. Portanto, o dia 18 de desenvolvimento é um ponto final apropriado para evitar a eclosão indesejada.

  1. Compreenda o tumor com fórceps. Usando tesouras (tesoura de mola funciona bem) ou um bisturi, cuidadosamente excisse tumor de CAM.
  2. Se o tumor foi transacionado com o gene da luciferase firefly, a reimagem pode ser realizada para verificar a remoção bem sucedida de tumores difíceis de visualizar.
    NOTA: Tumores excidados podem ser analisados por qualquer método apropriado para um experimento específico. Tumores também podem ser reimplantados em CAM ou camundongos. Para confirmar a identidade do tumor, os tumores podem ser fixos, parafina embutidas e examinados com hematoxilina e eosina ou coloração imunohistoquímica.

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Representative Results

Até agora, descobrimos que esse método de implantação foi bem sucedido para cânceres de ovário, rim, próstata e bexiga. Cada um foi otimizado para identificar condições específicas para implantação, embora possa haver flexibilidade. Dos tipos de tumores testados, o crescimento do câncer de ovário foi muito menos pronunciado e tipicamente não visível sem a ajuda da imagem de bioluminescência(Figura 1). No entanto, um endurecimento da CAM poderia ser sentido com fórceps na área de implantação. Isso pode ajudar a identificar possível crescimento tumoral na ausência de imagens de bioluminescência, embora uma validação adicional seja necessária através de histologia ou outro método adequado. Conseguimos enenxerto bem sucedido de linhas de células humanas e murina que mostram morfologias consistentes com as vistas em outros modelos vivos (Figura 1A e 1B). Além disso, foi possível a implantação de pedaços tumorais (Figura1C,a seta azul indica tumor). O tumor implantado neste caso veio de um paciente com carcinoma soroso de alto grau, metastático e ovariano. Os tumores resultantes se assemelhavam morfologicamente aos seus tumores de origem e expressavam proteínas específicas do homem, como a citoqueratina 8/18, que prontamente permitem sua diferenciação dos tecidos embrionários cam e frango.

Ao otimizar o enenxerto e o crescimento do tumor, fatores ou hormônios de crescimento apropriados podem ser adicionados no momento da implantação. Por exemplo, observou-se um aumento sutil e não significativo no tamanho do tumor (medido pelo fluxo total de radiância) em células ID8 quando complementado com três unidades (U) de hormônio estimulante do folículo humano (FSH) no momento da implantação(Figura 1D). A seleção de FSH para o crescimento do câncer de ovário decorreu da expressão do receptor FSH nas células ID8 e dos altos níveis de FSH normalmente encontrados em mulheres pós-menopausa, que constituem a maioria dos casos de câncer de ovário. Abordagens semelhantes podem ser adotadas para outros tipos de câncer de difícil crescimento para melhorar a utilidade do modelo CAM. Além disso, o FSH só foi adicionado no momento da implantação celular. A reposição do fator de crescimento ou hormônio poderia ser realizada encantendo uma quantidade apropriada do aditivo no meio no anel antiaderente em intervalos apropriados, o que poderia melhorar o efeito.

Para câncer renal, a implantação de 2 x 106 células cancerígenas de células renais de células de células estabelecidas, como a RENCA, produziu formação rápida e robusta do tumor, embora doses celulares mais baixas também possam ser utilizadas (Figura 2A,10 dias após a implantação). Tumores resultantes morphologicamente se assemelhavam aos obtidos através do mouse padrão nos modelos vivo28. A implantação de células RENCA marcadas com luciferase firefly permitiu imagens de bioluminescência. Tumores humanos primários também podem ser implantados. Os pedaços de tumor persistiram e recrutaram vasculatura sem mostrar crescimento significativo. A implantação de células digeridas originárias de um carcinoma de células renais de células claras que foram expandidas in vitro, no entanto, cresceu de forma semelhante às linhas celulares estabelecidas(Figura 2B). As células de carcinoma de células renais podem ser semeadas usando o método do anel antiaderente ou o método sem o anel antiaderente.

Várias linhas celulares de câncer de próstata humana e murina foram testadas para enenxerto CAM(Figura 3). Cada uma cresceu bem quando 2 x 106 células foram implantadas usando o anel antiaderente. A avaliação histológica dos tumores resultantes foi consistente com as expectativas para cada linha celular. Além disso, a implantação de células marcadas com luciferase firefly permitiu identificação tumoral com imagens de bioluminescência (Figura 3A).

O câncer de bexiga foi estabelecido no modelo CAM a partir de linhas celulares estabelecidas e pedaços de tecido humano primário (Figura 4). As linhas celulares cresceram bem quando implantadas com 2 x 106 células sem o anel antiaderente (Figura 4A e 4B),embora a implantação com o anel tenha sido bem sucedida. Tumor humano primário pode ser implantado a partir de pedaços de tecido (Figura 4C). O caso apresentado teve origem em um paciente com alto grau, carcinoma urotelolial. A implantação de células digeridas ainda não foi tentada devido à otimização contínua da digestão tumoral. Células cancerígenas dos tumores CAM resultantes mantiveram a morfologia do tumor original, mas com um componente estrônio alterado. O crescimento tumoral foi menor do que para carcinoma de células renais e câncer de próstata, embora ainda facilmente visível.

Para garantir um alto número de ovos viáveis e respeitáveis no ponto final, deve-se tomar cuidado ao incubar e abrir os ovos. Se as condições da incubadora forem subótimas antes ou depois da implantação, então a viabilidade do embrião pode ser comprometida. Se ocorrer morte embrionária significativa, solucionar problemas nas condições da incubadora de acordo com as instruções do fabricante. Em nossa experiência, a estabilidade da temperatura e da umidade parecem ser mais cruciais do que seus valores exatos. Por isso, descobrimos que a incubação dos ovos inoculados em uma incubadora de CO2 modificada e de cultura celular alcançou uma viabilidade superior sobre a retenção dos ovos em pequenas incubadoras de ovos dedicados que requerem abertura mais frequente para repor a água que controla a umidade. Minimizar a frequência com que os óvulos inoculados são removidos para exame tumoral também pode aumentar a viabilidade do embrião.

Uma preocupação adicional com a implantação da CAM é a integridade da CAM na inoculação. Se o CAM não estiver intacto após a abertura da concha, então o anel antiaderente e as células implantadas afundarão na albumina do embrião (veja a nota após a etapa 2.12). Isso causa dispersão de células cancerígenas. Alguns tumores ainda podem se formar, mas os cânceres que recebem crescimento significativo e sinalização de sobrevivência de células cancerígenas vizinhas, como o câncer de ovário, não formarão tumores de forma confiável nessas condições. Se os anéis antiaderente forem usados para implantação, a falha do CAM pode ser identificada pelo naufrágio do anel na albumina. Isso deve ser distinguido dos casos em que o anel e as células implantadas foram movidos para o fundo do óvulo por movimento embrionário. Nesses casos, o anel será encontrado entre o CAM e a parte inferior da concha. O movimento embrionário não pode ser controlado. No entanto, a colocação do anel pode tornar mais difícil para o embrião interromper as células implantadas. Anéis colocados nas bordas do bolso de ar gerados na etapa 2.7 são mais propensos a serem movidos pelo embrião do que aqueles colocados no centro do campo.

Figure 1
Figura 1: Desenvolvimento representativo do tumor do câncer de ovário. As células cancerígenas ovarianas implantadas com sucesso incluem: (A) a linha celular SKOV3 humana,(B)a linha celular Murine ID8 e(C)tumores primários. A coloração de hematoxilina e eosina representativa é apresentada juntamente com imagens de bioluminescência, conforme apropriado. Para o tumor CAM resultante da implantação de uma peça tumoral primária (C)a coloração hematoxilina e eosina do tumor CAM e do tumor primário estão incluídos, juntamente com a coloração de citoquercina 8/18 (CK 8/18) do tumor CAM resultante. A seta azul no primeiro painel indica o tumor. (D) Tamanho tumoral de implantes ID8 com e sem 3U FSH, calculado como o fluxo total resultante da imagem de bioluminescência (n = 3 para não tratadoe n = 4 para fsh-suplementoed). Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Desenvolvimento representativo do tumor a partir de carcinoma de células renais de células claras. Tumores resultantes da implantação de (A) a linha celular renal murina carcinoma linha, RENCA, ou (B) células cultivadas derivadas de um tumor primário humano digerido. A escala de medição adjacente ao tumor excisado em(B)mostra marcas de 1 mm. Histologia correspondente em (A) e (B) mostra hematoxilina e coloração de eosina. No(A),também é mostrada a imagem representativa de bioluminescência das células RENCA marcadas por vagalume-luciferase. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Desenvolvimento representativo do tumor a partir de linhas celulares de câncer de próstata. Tumores representativos e manchas de hematoxilina e eosina resultantes da implantação das linhas celulares cancerígenos de próstata humana(A)CWR e (B)C4-2 juntamente com a linha celular murina(C)MyC-CaP. A imagem de bioluminescência dos tumores resultantes das células CWR marcadas por fogo é mostrada em (A). A escala de medição adjacente aos tumores excidados mostra marcas de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Desenvolvimento representativo do tumor do câncer de bexiga. Tumores representativos resultantes da implantação das linhas de células cancerígenas da bexiga humana estabelecida(A)HT-1376,(B)T24 e (C)tumor primário da bexiga humana. Na(C),são mostradas a coloração hematoxilina e eosina do tumor CAM resultante e do tumor primário. A escala de medição adjacente aos tumores excidados mostra marcas de 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

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Discussion

A expansão e o enenxerto tumoral usando o modelo CAM permite um crescimento tumoral mais rápido e diretamente observável do que o existente nos modelos animais vivos. Além disso, os custos são significativamente menores uma vez que a compra inicial de equipamentos é concluída, especialmente quando comparada com o custo de camundongos imunocomprometidos. O estado inicial, imunocomprometido de embriões de frango prontamente permite enenxerto de tecido humano e murina. Mesmo com esses pontos fortes, o modelo CAM tem limitações. O curto prazo que pode ser um benefício também pode ser um prejuízo se os estudos de tratamento de longo prazo forem justificados. O estado imunocomprometido/tolerante imune do modelo CAM pode complicar os estudos de interações tumorais-imunes. Para esses estudos, pode ser necessária a coimplantação de células imunes de interesse, possivelmente com reposição do compartimento imunológico. Além disso, embora todos os tipos de tumores que apresentamos enenxerto no modelo CAM, eles o fazem com diferentes graus de crescimento. Por exemplo, o carcinoma de células renais forma rapidamente tumores grandes, mas tumores de câncer de ovário são difíceis de visualizar sem a ajuda de imagens de bioluminescência. O crescimento e a velocidade do tumor precisariam ser avaliados para um tipo de tumor específico para determinar se a CAM seria um modelo experimental adequado.

O enenxerto tumoral bem sucedido requer a conclusão cuidadosa de etapas específicas do protocolo. Primeiro, os ovos precisam ser incubados em condições ideais para ter a sobrevivência ideal do embrião e a formação cam antes do enenxerto. Devido à variabilidade natural em lotes, sugerimos a obtenção de ovos em excesso do fornecedor específico de ovos. Também descobrimos que o tempo mais frio e chuvoso pode levar ao crescimento fúngico nos ovos. Durante o tempo mais úmido, mais ovos podem precisar ser enenxertoados para obter rendimentos adequados no ponto final. Essa variação sazonal provavelmente será específica da região. A formação adequada da CAM é essencial para o enenxerto tumoral bem sucedido. Quaisquer indícios da CAM permanecendo anexada à concha na abertura não devem ser ignoradas. Se vários ovos não tiverem CAM intacto ao abrir o primeiro lote, recomendamos adiar a abertura dos ovos restantes por pelo menos 1 dia adicional.

Se forem obtidas má viabilidade ou enenxerto, vários passos podem ser culpados. Primeiro, a viabilidade embrionária do fornecedor pode ser pobre. Ausência de célula de ar e vasculatura visível indica um ovo inviável. Às vezes, o movimento dos embriões pode ser visualizado para confirmar a viabilidade. Primeiro, porém, certifique-se de que as baterias frescas estão no candler de ovos, porque uma luz forte é necessária para visualização. O teste de flutuação também pode ser feito para avaliar a viabilidade (uma variedade de instruções e vídeos estão disponíveis online). Outra possível explicação para a má viabilidade é a incubadora. Usando um hidrômetro independente e um termômetro, certifique-se de que as configurações sejam precisas e estáveis. As instruções do fabricante para a incubadora devem conter instruções detalhadas de solução de problemas para avaliar as configurações adequadas. Configurações inadequadas da incubadora também podem comprometer o desenvolvimento de CAM. Usando fita e/ou um marcador, determine se o rotador de ovos está realmente girando os ovos. Se os anéis antiaderente afundarem na albumina em uma alta proporção dos ovos enenxertodos, então o CAM não se desenvolveu adequadamente. Finalmente, descobrimos que a verificação frequente do ovo enenxertou, levando a flutuações de temperatura e umidade, pode diminuir a viabilidade pós-implante. Se os ovos implantados são inicialmente viáveis, mas a viabilidade diminui durante todo o período de enenxerto, os ovos devem ser verificados com menos frequência. Essa diminuição na viabilidade também pode ser devido a configurações imprecisas ou inadequadas da incubadora após a implantação.

Ao otimizar esse método para um novo tipo de célula, vários fatores podem ser controlados. O primeiro é o número da célula. Normalmente implantamos 5 x 105-2x 106 células das linhas celulares. As peças de tumor implantadas são tipicamente de 2-5 mm em cada lado. Essas quantidades podem ser ajustadas para melhorar o enenxerto ou o tamanho. No entanto, descobrimos que o crescimento do tumor diminui acima de um certo limiar, que é dependente do tipo celular. Parâmetros adicionais de enenxerto incluem a presença ou ausência de um anel antiaderente. Essa escolha é tipicamente feita com base em se o anel vai dificultar a análise do ponto final, embora também possa influenciar o enenxerto bem sucedido. A presença do anel antiaderente também pode permitir cobrir o enxerto nascente com intervalos médios desejados para melhorar a sobrevivência antes do recrutamento vascular, se assim desejar. A escolha do tipo de matriz extracelular, concentração e meio em que a matriz é diluída também pode impactar o enenxerto. A adição de fatores ou hormônios de crescimento pode melhorar ainda mais a taxa ou o tamanho do tumor. A seleção de aditivos e concentrações precisaria ser feita com base no que seria apropriado para o tipo específico de célula e não interferir no experimento. Estes também teriam o potencial de ser reabastecido em intervalos se um anel antiaderente for usado.

Aplicações futuras deste sistema modelo dependem da hipótese a ser testada. Por exemplo, esses enxertos tumorais poderiam ser usados para testar novas abordagens terapêuticas para reduzir o tamanho do tumor ou esgotar uma subpopulação do tumor. A coimplantação com células do microambiente tumoral hospedeiro poderia permitir estudos sobre a influência dessas células em uma variedade de parâmetros, incluindo crescimento tumoral e resistência ao tratamento. Este modelo também poderia servir como uma oportunidade para expandir gradualmente tumores humanos primários antes de estabelecer xenoenxertos em modelos animais imunocomprometidos. A adaptação inicial ao enenxerto cam poderia talvez facilitar a taxa de tomada de tumor em modelos de murina. Essas aplicações ainda não foram testadas, mas justificam uma exploração adicional.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores desejam agradecer ao Dr. Fuyuhiko Tamanoi e Binh Vu pelo treinamento inicial sobre este método. As discussões com a Dra. Este trabalho não teria sido possível sem financiamento das seguintes fontes: o Programa de Pesquisa sobre Doenças Relacionadas ao Tabaco Bolsa de Pós-Doutorado (27FT-0023, à ACS), o Departamento de Defesa (DoD) Programa de Pesquisa do Câncer de Ovário (W81XWH-17-1-0160), NCI/NIH (1R21CA216770), Programa de Pesquisa de Doenças Relacionadas ao Tabaco Prêmio Piloto de Alto Impacto (27IR-0016) e apoio institucional da UCLA, incluindo um JCCC Seed Grant (NCI/NIH P30CA016042) e um 3R Grant do Escritório do Vice-Chanceler para Pesquisa para LW.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
-010 Teflon (PTFE) White 55 Duro Shore D O-Rings The O-Ring Store TEF010 Nonstick ring for cell seeding. 1/4"ID X 3/8"OD X 1/16"CS Polytetrafluoroethylene (PTFE).
C4-2 ATCC CRL-3314 Human prostate cancer cell line.
CWR22Rv1 CWR cells were the kind gift of Dr. David Agus (Keck Medicine of University of Southern California)
Cytokeratin 8/18 Antibody (C-51) Novus Biologicals NBP2-44929-0.02mg Used at a dilution of 1:100 for immunohistochemical analysis of human ovarian CAM tumors.
D-Luciferin Firefly, potassium salt Goldbio LUCK-1G
Delicate Operating Scissors; Curved; Sharp-Sharp; 30mm Blade Length; 4-3/4 in. Overall Length Roboz Surgical RS6703 This is provided as an example. Any similar curved scissors would work as well.
Dremel 8050-N/18 Micro 8V Max Tool Kit Dremel 8050-N/18 This kit contains all necessary tools.
Fertilized chicken eggs (Rhode Island Red - Brown, Lab Grade) AA Lab Eggs Inc. N/A A local egg supplier would need to be identified, as this supplier only delivers regionally.
HT-1376 ATCC CRL-1472 Human bladder cancer cell line.
Hovabator Genesis 1588 Deluxe Egg Incubator Combo Kit Incubator Warehouse HB1588D-NONE-1102-1588-1357 Other egg incubators may be used, but their reliability would need to be verified. After implantation, a cell incubator with the CO2 disabled may also be used.
ID8 Not commercially available, please see PMID: 10753190.
Incu-Bright Cool Light Egg Candler Incubator Warehouse 1102 Other candlers may be used; however, this is preferred among those that we have tested. This candler is included in the aforementioned incubator kit.
Iris Forceps, 10cm, Curved, Serrated, 0.8mm tips World Precision Instrument 15915 This is provided as an example. Any similar curved forceps would work as well. Multiple brands have been used for this method.
Isoflurane Clipper Distributing 0010250
IVIS Lumina II In Vivo Imaging System Perkin Elmer
Matrigel Membrane Matrix HC; LDEV-Free Corning 354248 Extracellular matrix solution
MyC-CaP ATCC CRL-3255 Murine prostate cancer cell line.
Portable Pipet-Aid XP Pipette Controller Drummond Scientific 4-000-101 Any similar pipet controller would be appropriate.
PrecisionGlide Hypodermic Needles BD 305196 This is provided as an example. Any 18G needle would work similarly.
RENCA ATCC CRL-2947
Semken Forceps Fine Science Tools 11008-13 This is provided as an example. Any similar forceps or another style that suits researcher preference would be appropriate.
SKOV3 ATCC HTB-77 Human ovarian cancer cell line.
Specimen forceps Electron Microscopy Sciences 72914 This is provided as an example. The forceps used for pulling away the shell for bioluminescence imaging are approximately 12.8 cm long with 3 mm-wide tips.
Sterile Cotton Balls Fisherbrand 22-456-885 This is provided as an example. Any sterile cotton balls would suffice.
Stirring Rods with Rubber Policeman; 5mm diameter, 6 in. length United Scientific Supplies GRPL06 This is provided as an example. Any similar glass stir rods would work as well.
T24 ATCC HTB-4 Human bladder cancer cell line.
Tegaderm Transparent Dressing Original Frame Style 2 3/8" x 2 3/4" Moore Medical 21272
Tissue Culture Dishes, 10 cm diameter Corning 353803 This is provided as an example. Any similar, sterile 10-cm dish may be used. Tissue culture treatment is not necessary.
Tygon Clear Laboratory Tubing - 1/4 x 3/8 x 1/16 wall (50 feet) Tygon AACUN017 This is provided as an example. Any similarly sized tubing would work as well.

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References

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Utilização da membrana chorioallantoico de frango em modelo vivo para estudar cânceres ginecológicos e urológicos
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Sharrow, A. C., Ishihara, M., Hu, J., Kim, I. H., Wu, L. Using the Chicken Chorioallantoic Membrane In Vivo Model to Study Gynecological and Urological Cancers. J. Vis. Exp. (155), e60651, doi:10.3791/60651 (2020).

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