Summary
이 프로토콜은 2개의 인플루엔자 A 긴장에서 봉투 당단백질을 가진 높은 역가 감염성 바이러스성 의사 입자 (pp)를 생성하는 실험 적인 프로세스및 그들의 감염성을 결정하는 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 다른 봉투 당단백질을 가진 봉투바이러스의 그밖 모형의 pps를 개발하기 위하여 높게 적응합니다.
Abstract
고병원성 조류 인플루엔자 A 바이러스 H5N1(HPAI H5N1) 및 H7N9를 인간에게 직접 적으로 전달하는 것은 심각한 공중 보건 문제이며 전염병의 가능성을 시사한다. 그러나, 바이러스의 우리의 분자 이해는 기초적이고, 그것의 봉투 단백질의 생물학 속성을 치료 표적으로 공부하고 감염을 통제하는 전략을 개발하는 것이 필요합니다. 우리는 그것의 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다아제 (NA) 봉투 당단백질, HA 및 NA의 재분류 특성의 기능 분석을 포함하여 조류 인플루엔자 바이러스를 연구하는 고체 바이러스 성 가성 입자 (pp) 플랫폼을 개발했습니다. 수용체, 트로피즘, 중화 항체, 진단, 감염, 약물 개발 및 백신 설계의 목적을 위해. 여기서, 우리는 2개의 인플루엔자 A 균주(HAPI H5N1 및 2013 조류 H7N9)로부터 엔벨로프 당단백질(HA, NA)을 가진 pps를 확립하는 실험 적 절차를 기술한다. 그들의 생성은 pp에 봉투 당단백질을 통합하기 위하여 뮤린 백혈병 바이러스 (MLV)와 같은 몇몇 바이러스의 수용량에 근거를 두었습니다. 또한 이러한 pps가 RT-qPCR로 정량화되는 방법, 그리고 H및 NA의 기원에 따라 네이티브 및 불일치 바이러스 pps의 감염 성 검출방법을 자세히 설명합니다. 이 시스템은 매우 유연하고 적응력이 있으며 봉투 당단백질로 바이러스 pps를 확립하는 데 사용할 수 있으며 다른 유형의 봉투 바이러스에 통합 될 수 있습니다. 따라서, 이러한 바이러스 성 입자 플랫폼은 많은 연구 조사에서 야생 바이러스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
바이러스 입자의 임무는 감염된 숙주 세포로부터 비감염숙주 세포로 게놈을 수송하고 이를 복제 유능한 형태1에서세포질 또는 핵으로 전달하는 것이다. 이 프로세스는 처음에 호스트 세포 수용 체에 바인딩에 의해 트리거됩니다., virion와 세포 막의 융합 다음. 인플루엔자 바이러스와 같은 포위 된 바이러스의 경우, 스파이크 당단백질은 수용체 결합 및 융합1,2를담당합니다. Viral envelope glycoproteins (e.g., pyrogens, antigens), are involved in many important properties and events, such as virus lifecycle initiation (binding and fusion), viral pathogenesis, immunogenicity, host cell apoptosis and cellular tropism, the cellular endocytic pathway, as well as interspecies transmission and reassortment1,3,4,5,6,7. 바이러스 성 봉투 당단백질에 대한 연구는 바이러스 감염 과정의 많은 측면을 이해하는 데 도움이됩니다. 의사형 바이러스 입자(pp)는 또한 의사 입자 또는 의사 입자라고도 하며, 가성 화 기법을 통해 생성될 수 있다8,9,10. 이 기술은 C형 간염11,12형,B형 간염13형,수포성 구내염 바이러스(VSV)14, 15,및 인플루엔자 바이러스16,17,18,19를포함한 많은 바이러스의 가성 입자를 개발하는 데 사용되어 왔다. 이 기술은 렌티바이러스 또는 다른 레트로바이러스의 개그폴 단백질을 기반으로 합니다.
가성형 바이러스 입자는 바이러스 봉투 당단백질 발현 플라스미드, 봉투 env 유전자를 누락한 레트로바이러스 패키징 플라스미드, 및 pp 생산자 세포내로의 별도의 리포터 플라스미드를 교전시킴으로써 3-플라스미드 시스템을 사용하여 수득될 수 있다. 레트로바이러스는 개그 단백질에 의해 조립되고, 바이러스 봉투 단백질1을발현하는 감염된 세포막에서 싹이 나고 있다. 따라서, 레트로바이러스 개그 단백질을 이용하여 고역인플루엔자 pps를 획득하여 인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 세포막상에서 싹을 생성할 수 있다. 우리의 이전 연구에서, 모든 조합의 HA /NA는 기능적이었고 바이러스 성 수명 주기16,17,18,20,21에서해당 기능을 수행 할 수 있었습니다. 이러한 pps는 hemagglutination, neuraminidase 활동, HA 수용체 결합 트로피즘, 및 감염을 포함하는 인플루엔자 생물학적 특성을 조사하기 위해 사용된다. HA와 NA는 바이러스 성 수명 주기에서 중요한 표면 기능성 단백질이기 때문에, 인플루엔자의 다른 변종에서 파생된 불일치하는 HA 및 NA는 부분적으로 그들 사이의 재분류를 입증할 수 있습니다. 여기서, 우리는 2개의 하스와 2개의 NA (HPAI H5N1 긴장 및 H7N9 얼룩에서 파생된)를 결합하여 8가지 유형의 인플루엔자 pps를 생성합니다. pps의 이 8가지 모형은 2개의 네이티브 pps, H5N1pp, H7N9pp를 포함합니다; 두 개의 일치하지 않는 PPS, (H5 + N9)pp, (H7 + N1)pp; 단일 당단백질(HA 또는 NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. H5N1 및 H7N9와 같은 인플루엔자 바이러스에 대한 연구는 생체 안전성 요건에 의해 제한됩니다. 야생 인플루엔자 바이러스 균주에 대한 모든 연구는 생물 안전 수준 3 (BSL-3) 실험실에서 수행되어야합니다. 가성형 바이러스 입자 기술은 생체 안전 도 2(BSL-2) 설정에서 인공 비리온을 패키징하는 데 사용할 수 있습니다. 따라서 pps는 두 가지 주요 당단백질인 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)에 따라 인플루엔자 바이러스 과정을 연구하는 보다 안전하고 유용한 도구를 나타냅니다.
이 프로토콜은 3-plasmid cotransfection 전략(그림 1에서검토됨), pps를 정량화하는 방법 및 감염성 검출을 통해 이러한 pps의 생성을 설명합니다. pp 생산에는 플라스미드의 3가지 종류가 포함됩니다(그림1). 레트로바이러스 개그폴 단백질을 인코딩하는 개그폴 유전자는 레트로바이러스 패키징 키트에서 복제하여 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입하고 PCDNA-Gag-Pol로 명명하였다. 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 향상된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자는 pTRE-EGFP 벡터에서 복제되고 pcDNA 3.1 플라스미드에 삽입되고 pcDNA-GFP라고 합니다. 복제 동안, 패키징 신호(θ) 시퀀스가 프라이머를 통해 첨가되었다. HA 및 NA 유전자는 각각 pVRC-HA 및 pVRC-NA라는 pVRC 플라스미드로 복제되었다. 마지막 플라스미드는 융합 단백질을 인코딩하고 관심 있는 임의의 다른 융합 단백질로 대체할 수 있다. 우리의 의사 티핑 플랫폼은 두 개의 당단백질 발현 플라스미드를 포함합니다: pVRC-HA 및 pVRC-NA. 이 BSL-2 설정에서 다른 바이러스 긴장 사이 재분류에 대 한 연구를 단순화할 수 있습니다.
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Protocol
1일차: 세포 배양 및 시팅
- 인간 배아 신장(HEK) 293T/17 세포를 60mm 접시에 10% 태아 소 혈청(FBS)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신(DMEM Complete Medium) 으로 보충하여 변형된 필수 배지(DMEM)를 사용하여 배양합니다. DCM)을 37°C에서, 5%이산화탄소(CO2)에서약 80% 까지 인큐베이터에 있다.
참고 : HEK 293T / 17 낮은 통로 세포를 권장합니다. - 인산완식염(PBS) 1x 5 mL로 조심스럽게 세포를 세척합니다.
참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다. - PBS를 제거하고 0.25% 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 용액의 1 mL로 세포를 해리. 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 놓고 세포가 해리될 때까지 5분 이상 동안 배양합니다.
- DCM의 5 mL을 추가하여 트립신을 비활성화합니다. 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.
- 세포 현탁액을 미리 냉각된 15 mL 원심분리기로 옮김을 옮김. 4°C에서 5분 동안 250 x g에서 원심분리에 의해 세포를 수집한다.
- 가능한 한 상급의 많은 장식. DCM 배지의 6 mL로 세포 펠릿을 다시 중단하고 세포를 계산합니다. DCM 배지로 세포를 1 x 106 셀/mL로 희석합니다.
- 세포를 잘 당 1 mL의 세포 현탁액으로 6 웰 플레이트에 시드합니다. 접시를 가볍게 두드려 세포를 고르게 분배합니다. 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.
2. 2일차: 리포페션에 의해 중재된 4-플라스미드 코트랜스펙션
- 반전된 광 현미경의 밑에 세포 형태 및 조밀도를 확인하십시오. 이상적으로, 세포는 형질 전환에 대략 85% 수렴되어야 합니다. 배지를 잘 당 1 mL의 무혈청 DMEM 배지로 교체한 다음 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다.
참고 : HEK 293T / 17 셀의 수동 처리는 쉽게 분리되기 때문에 매우 부드럽습니다. - 배양된 각 웰에 대해 형질전환 시약의 8 μL을 감소된 혈청 배지(튜브 1)로 150 μL의 부피로 희석한다. 부드럽게 섞고 실온(RT, 약 20°C)에서 5분간 배양합니다.
참고: 각 형질감염 샘플에 대해 1.5 mL 미세 원심 분리튜브 2개(번호 1 및 2)를 준비합니다. - 튜브 2에서, 플라스미드 DNA 2.5 μg을 150 μL의 감소된 혈청 배지로 희석한다.
참고: 튜브 2에서 표 1과같이 각 플라스미드 DNA를 희석합니다. VSV가 광범위한 세포를 감염시킬 수 있기 때문에 플라스미드 인코딩 된 혈관 성 질염 바이러스 (VSV) G 당단백질 (플라스미드 pLP-VSVG)은 양성 대조군으로 사용되었습니다. 인플루엔자 봉투 당단백질(Δenv pps)이 부족한 음성 대조군 입자는 pcDNA-개그-폴 및 pcDNA-GFP 플라스미드를 사용하여 생성되었다. - 5 분 배양 후 희석 된 DNA를 희석 된 형질 감염 시약과 결합하십시오. 부드럽게 섞고 RT에서 15분 간 더 배양하세요.
- DNA-지질 복합체를 세포 및 무혈청 배지를 함유하는 상응하는 웰에 첨가한다. 접시를 앞뒤로 흔들어 부드럽게 섞어주세요.
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 배양한 후, 배지를 제거하고, DMEM의 2 mL로 대체하였다. 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 36-48시간 동안 배양한다.
참고: 혈청이 없고 항체가 없는 DMEM으로 교체하십시오. 이 프로토콜에서는 두 개의 하와 2개의 NA를 사용하여 8가지 유형의 pps를 생성할 수 있습니다(표 1에표시됨).
3일차: 세포 파종
- 감염성 분석의 경우, 96웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 세포에서 감염되기 쉬운 세포의 각 유형을 시드합니다.
참고 : 이 기사에서 감염성 분석기를 수행하기 위해 두 가지 유형의 표적 세포를 사용합니다: 폐포 유래 인간 세포주 (A549 세포) 및 Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포. MDCK 세포는 인플루엔자 연구에 널리 사용되며 좋은 대조군이 될 수 있다. 이 단계는 유연합니다. 다른 표적 세포주들은 연구 요건에 따라 사용될 수 있다. - 플레이트를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 밤새 배양(14-16h)한다.
4. 4 일: 가성 형바이러스 입자 수집, 정량화 및 감염성 분석
- 가성형 바이러스 입자 수집
- 매체의 색상을 확인합니다. 이상적으로는 밝은 분홍색 또는 약간 주황색이어야합니다. 440-460 nm 의 거꾸로 형광 생물학적 현미경으로 세포를 검사합니다.
- 36-48 시간 후 변형에서 0.45 μm 폴리 비닐 리덴 불소 (PVDF) 멤브레인 필터를 통과하여 pps를 수확하여 세포 이물질을 제거합니다.
- pps를 작은 볼륨 aliquots로 나눕니다.
- pps를 -80 °C에 보관하십시오.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 그러나, 이것은 권장되지 않습니다, pps의 감염은 동결 및 해동 후 급격히 감소하기 때문에.
- 가성형 바이러스 입자 정량화
- 정제된 pps 20 μL을 1.5 mL 리보누클리스(RNase)가 없는 미세원심지 튜브로 옮니다.
- 0.24 U/mL 벤조나아제 뉴클레아제 1 μL을 첨가합니다. DNA 및 RNA 오염을 제거하기 위해 1시간 동안 37°C에서 배양합니다.
참고: 표적 RNA, 일반적으로 하향 조절된 사이토메갈로바이러스 (CMV)-GFP RNA는 pps에서 포장되고 벤조나제 뉴클레아제에 의해 저하되는 것을 피할 수 있습니다. - 벤조나아제 뉴클레아제에 대해 -70°C에서 시료를 동결.
- 봉투 단백질을 소화하고 CMV-GFP RNA를 방출하기 위해 30 분 동안 50 °C에서 2 μL의 단백질 분해제 K. 인큐베이터를 추가하십시오. 100°C에서 3분 동안 단백질나제 K를 비활성화한다.
- 범용 프로브 1단계 RT-qPCR 키트를 사용한 실시간 정량적 역전사(qRT)-PCR로 pps를 정량화하고, 전방 프라이머 5'-AACAAAGAGCTGGATTTTTTTTTAA-3', 역방향 프라이머 5'-GGGTCTCCTCAGAGGATTAGAC-3', 프로브 5'-FAM-CCCCCAAAAGACCCCCCGAG-TAM-3', 실시간 PCR 열자전거. 감염 전에 RNA 카피 번호에 대한 pps를 정상화하십시오.
- 감염성 분석
- qRT-PCR 데이터의 관점에서 각 유형의 pps를 4 x 105 복사/mL(pp 정규화)로 희석합니다.
- 토실-페닐알라닌 클로로메틸-케톤(TPCK)-트립신을 H7N9 HA를 수용하는 pps에 40 μg/mL의 최종 농도에 추가합니다. 37°C에서 1시간 동안 배양하여 HA1 및 HA2의 기능적 소단위를 형성한다.
참고: HA1-HA2 절단 부위에 여러 아르기닌과 리신 잔류물이 있기 때문에 H5를 TPCK-트립신으로 취급할 필요가 없습니다. 이 다중 기본 절단 사이트는 유비쿼터스 세포 프로테아제에 의해 절단 될 수있다. - 정규화된 pps를 DMEM 배지(무혈청)와 1:1 비율(부피/부피)으로 혼합합니다.
- 생체 안전성 캐비닛에 영향을 받기 쉬운 세포가 들어있는 접시를 가져옵니다.
- 상월체를 흡인하고 미리 온난화된 PBS의 0.1 mL로 세포를 한 번 세척한다.
- 0.1 mL의 pps-DMEM 혼합물을 하나의 우물에 추가합니다. 각 유형의 pps의 감염성 검사를 하나의 취약한 세포주로 세배로 합니다(그림 2에서간과함).
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 4-6시간 동안 96웰 플레이트를 배양한다.
- 상급을 흡인하고 DCM의 0.1 mL로 교체하십시오.
- 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 또 다른 24-36h에 대한 96웰 플레이트를 배양한다.
5일차 5일 또는 6일: 감염성 검출
- 96 웰 플레이트를 생체 안전 성 캐비닛에 가져옵니다.
- 상월체를 흡인하고 미리 온화한 PBS의 0.2 mL로 세포를 1x 세척한다.
- PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액의 0.1 mL로 세포를 해리시.
- 접시를 37°C, 5%CO2 인큐베이터에 3분 동안 놓고 세포가 해리될 때까지.
참고 : 이것은 세포 응집으로 이어질 수 있기 때문에 5 분 이상 배양하지 마십시오. - DCM의 0.4 mL를 추가하여 트립신을 비활성화합니다.
- 여러 번 위아래로 파이펫팅하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 분산시다.
- 세포 현탁액을 냉각된 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 옮니다.
- 형광 활성화 세포 선별 (FACS)로 GFP 리포터 양성 세포를 결정합니다.
참고: GFP 리포터 양성 표적 세포의 비율을 결정하기 위해, 대조군 샘플(pps-처리되지 않은 A549 세포 또는 MDCK 세포)을 사용하여 유동 세포측계 게이트를 설정한 다음 샘플당 10,000개의 GFP 리포터 양성 세포를 계산합니다.
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Representative Results
위에서 설명한 일반적인 절차에 따라, 우리는 2개의 그룹 HA/NA 또는 VSV-G 당단백질 또는 무엔벨로프 당단백질을 결합한 10가지 종류의 pps를 생성하였다(표 1에나타낸). 그 중 7명은 전염성이 있습니다. 무엔벨로프 당단백질 또는 NA만 항구하는 pps는 여기에서 어떤 감염도 보여주지 않았습니다. 인플루엔자 pp 생산 절차는 그림 1에서검토됩니다. pps의 전송 전자 현미경 그래프 (예를 들어, H5N1pp)는 그림 3에도시되어 있습니다. 이 pps의 감염성 검사의 결과는 그림 4에도시됩니다. 7가지 유형의 pps의 감염도는 세포당 게놈 사본(GCP)[감염의 복합성(MOI)]값 20에서 평가되었다. H5를 품고 있는 pps 그룹에서, H5N1, (H5+N9) 및 H5의 감염도는 90.05±4.05%, 17.78±1.58%, 세포주 A549 및 40.37±4.92%, 5.24±1.32%, 4.88±0.27% 각각 MD에 대해 10.15±2.85%였다. H7을 항하는 pps 군에서, H7N9, (H7+N1) 및 H7의 감염율은 각각 10.45±2.35%, 6.75±1.37%, 1.23±0.33% 세포주 A549 및 7.61±1.04%, 4.12±1.29%, 1.08±0.08% 각각이었다. pps의 감염성, 특히 HApp(H5pp, H7pp)의 경우 외인성 뉴라미니다아제가 첨가되지 않았다. 이러한 감염성 분석에서, MDCK 세포는 또한 pps 감염성을 테스트하기 위한 대조군 세포주로서 사용되었다. VSVGpp의 감염도는 A549에 대해 20.9±2.00%, MDCK 세포에 대해 16.02±2.41%였다. 델타-엔벨로프 당단백질 pp (Δenv pp)는 우리의 연구에서 감염증을 나타내지 않았다. 이 데이터는 또한 다양한 바이러스 긴장에서 HA/NA가 성공적으로 전염하는 바이러스 성 입자를 생성할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 종합하면, 우리의 의사 티핑 플랫폼은 인플루엔자 연구에 사용되는 전염성 의사 형 바이러스 입자를 개발할 수 있습니다.
그림 1: 인플루엔자 pp 생산 절차 개요. (a)패키징 플라스미드 pcDNA-Gag-pol, 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP, 및 봉투 당단백질 발현 플라스미드 pVRC-HA 및 pVRC-NA는 pp-생산 HEK 293/17 세포로 균등감염된다. (B)HEK 293/17 세포에서, 개그 폴 폴리 단백질은 세포막에 알려지지 않은 메커니즘에 의해 합성및 수송된다. 당단백질 HA 및 NA는 분비 경로를 통해 세포막상에 운반및 고정됩니다. 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP는 단일 가닥의 θ-GFP 게놈 RNA로 전사된다. (C)수송 도중 또는 후에, 개그폴 단백질은 psi-RNA 패키징 신호를 통해 단일 가닥 θ-GFP 게놈 RNA를 모집하고, 이에 의하여 사전 신진 복합체를 형성한다. (D)조립된 개그-폴-θ-RNA 복합체는 막 곡률을 유도하여 싹의 형성을 유도한다. 신진 하는 동안, 바이러스 성 봉투 당단백질 HA/NA는 초기 입자에 통합 됩니다. 입자가 세포막에서 꼬이면서 신진이 완성됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 감염성 분석에서 전반적인 배열. 1개의 영향을 받기 쉬운 세포주에게 pps의 각 모형의 감염성 시험은 삼중으로 측정되었습니다. 폐포 유래 인간 세포 A549 및 MDCK는 감수성 세포로서 사용된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: pps의 전송 전자 현미경. 미농축(왼쪽) 및 농축(오른쪽) 상급. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 정규화 된 PPS의 감염. 감염성은 감염된 세포의 평균 ± 표준 편차(SD) 백분율로 제시된다(n=3). pps의 감염성은 2개의 세포주, A549 및 MDCK 세포에서 평가되었다. pps의 7가지 모형은 2개의 표적 세포에 있는 각종 감염 성 단면도를 표시했습니다. 그들은 어떤 감염을 명시하지 않았기 때문에 만 항구 NA는 여기에 표시되지 않습니다 Pps. 봉투가 없는 당단백질(Δenv)을 품고 있는 Pps는 또한 우리의 연구에서 감염증을 보이지 않았습니다. 감염률의 백분율은 견본 당 10,000개의 세포에 있는 GFP 기자 양성 세포의 비율을 표시했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 플라스미드 제제 | ||||||||||
| 플라스미드(μL, 0.1 μg/μL) | H5N1 | (H5+N9) | H7N9 | (H7+N1) | H5 | N1 | H7 | N9 | VSVG | 켄텐프 |
| pcDNA-개그 폴 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pcDNA-GFP | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 10.53 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 11.43 | 12.5 |
| pVRC-HA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 2.14 | - | 2.14 | - | - | - |
| pVRC-NA | 1.98 | 1.98 | 1.98 | 1.98 | - | 2.14 | - | 2.14 | - | - |
| pcDNA-VSVG | - | - | - | - | - | - | - | - | 2.14 | - |
표 1: H5N1 및 H7N9 바이러스로부터 유래된 HA 및 NA 단백질의 조합 및 6웰 플레이트의 1웰 트랜스펙션을 위한 플라스미드 DNA의 필요한 양(volume). 플라스미드 제제의 농도에 따라 각 플라스미드 DNA의 필요한 부피를 계산합니다. 1웰의 트랜페션을 위한 플라스미드 DNA의 총량은 2.5 μg이다. 가장 높은 형질 감염 효율과 가장 낮은 비특이적 효과를 얻기 위해 플라스미드 DNA 및 트랜페션 시약 농도를 변화시켜 형질감염 조건을 최적화했습니다. 최적화 후, 4개의 플라스미드 수량의 비율은 16:16:1:1로 설정되었습니다. 6 웰 플레이트의 하나의 웰 트랜스펙션에 사용되는 형질감염 시약의 부피는 8 μL이다(표에 도시되지 않음). H5N1 및 H7N9 바이러스로부터 2개의 하와 2개의 나스는 8가지 유형의 pps를 생성하는데 사용될 수 있습니다: H5N1pp, (H5 + N9)pp, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1)pp, H7pp 및 N9pp. 무엔벨 당단백질 (Δenv) 또는 NA 당단백질만 을 수용하는 pps는 우리의 연구 결과에서 아무 감염도 보여주지 않았습니다.
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Discussion
이 프로토콜에서, 우리는 BSL-2 설정에서 인플루엔자 바이러스 가성 입자(pp)를 생성하는 방법을 설명한다. 리포터 플라스미드 pcDNA-GFP는 pps에 통합되고 감염성 분석에서 FACS에 의해 pps를 정량화하는데 사용될 수 있다. 우리는 인플루엔자 연구에 널리 사용되기 때문에 두 가지 유형의 영향을 받기 쉬운 세포주를 선택했습니다. MDCK 세포는 이러한 연구에서 사용되는 가변 불멸의 인간 세포에 좋은 대조군을 제공할 것이다.
이 프로토콜은 GFP 리포터를 통합하고 세포막에 싹을 생성 할 수있는 레트로 바이러스 MLV를 기반으로합니다. 이 기술은 널리 패키징 인플루엔자바이러스 입자4,22,23,24를위해 개발되었습니다. 일부 다른 시스템은 렌티바이러스 HIV-1 가성화 시스템19,25,26 또는 바쿨로바이러스-곤충 세포 발현시스템(27,28,29)을기반으로 한다. 다른 많은 리포터 유전자는 또한 루시퍼라제(발광)30,31,32,33,β-gal/LacZ(색소측정에 의한)34,35,및 분비알칼리성 인산염36,37과같은 의사입자 생산에도 사용되어 왔다. 밀레 외는 코로나바이러스 가성입자(33)의감염성을 정량화하기 위해 루시퍼라제 분석기를 사용했다. 루시퍼라제와 비교하여, GFP의 녹색 형광은 거꾸로 된 형광 생물학적 현미경으로 쉽게 관찰됩니다. 이것은 형혈 및 감염 효율성을 확인하는 편리한 방법입니다. 본 연구에서, 감염은 FACS를 가진 GFP 양성 세포를 검출함으로써 직접 결정될 수 있다.
이 방법에서는 여러 단계가 결과에 심각한 영향을 미칩니다. 최적화된 셀 밀도는 성공적인 형질감염에 중요한 요소입니다. 이 프로토콜에서, 80-90% 컨플루통 범위의 세포 밀도는 인플루엔자 바이러스 pp 생산에 최적인 것으로 나타났다. 세포 밀도가 높거나 낮으면 형질전환 효율이 낮아집니다. 생산자 세포의 좋은 생리적 상태는 또한 높은 입자 생산에 매우 중요하다. 이것이 하부 세포 통로 HEK 293T/17 세포가 이 프로토콜에서 pps를 생성하는 것이 권장되는 이유입니다. 또한, 형질감염 시약의 부피 및 4개의 플라스미드 수량의 비율은 또한 형질감염 효율에 영향을 미칠 수 있다. 가장 높은 형질 감염 효율을 얻으려면 양을 다양하게 테스트하여 이러한 요인을 최적화하는 것이 좋습니다. 우리는 4 개의 플라스미드 수량의 비율을 16:16:1:1로 설정하고 6 웰 플레이트에서 1 개의 웰 트랜지션에 대해 형질감염 시약의 부피를 8 μL로 설정했습니다. 또 다른 문제는 셀 의 처리입니다. HEK 293T/17producer 셀은 접착력이 낮기 때문에 셀의 수동 처리는 매우 부드럽습니다. Lipofection세포 투과성 증가로 이어질 수 있고, 배지내의 혈청 및 항체는 세포독성을 증가시킬 수 있다. 혈청이 없고 항체가 없는 DMEM을 사용하여 형질 감염된 HEK 293T/17 세포를 배양하는 것이 가장 좋습니다. 또한 수집 시간이 중요합니다. 36-48 h 후 형질 전환에서, 세포 상층의 색상은 pp 컬렉션 전에 분홍색 또는 오렌지 핑크 있는지 확인해야합니다. 황색 상판은 배지가 세포 성장을 지원하기에는 너무 산성이며 일반적으로 pp 수율이 좋지 않은 것을 나타냅니다.
우리는 6 웰 플레이트에서 형질전환 분석술을 수행했습니다. 더 많은 pp 부피를 얻기 위해 형질전환 웰의 수를 증가시킬 수 있고 동일한 pps를 포함하는 주식은 함께 풀레이션될 수 있다. 대안적으로, 일부 다른 종류의 용기는 pp 수율을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 18 μL의 형질감염 시약과 5.5 μg의 플라스미드 DNA는 60 mm 접시에 2.2 x 106 세포로 형질 감염을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 유사하게, 감염성 분석제는 24 웰 플레이트에서 수행될 수 있다.
이 기술의 성공은 여러 가지 요인에 의해 영향을받을 수 있습니다. 따라서 절차는 다양한 종류의 바이러스의 입자 패키징에 최적화되어야 합니다.
이 프로토콜에서는 HPAI H5N1 및 H7N9의 가성형 바이러스 입자와 이들의 재분류제가 생성되었습니다. 이 방법에서, 우리는 조직 배양 감염용량 50(TCID50)또는 전통적인 MOI23,38,39대신에 단일 세포 수준(세포당 게놈 사본)에서 감염성 분석법에서 GFP-RNA의 qRT-PCR을 사용한다. 바이러스 감염 적정 방법은 시간이 많이 걸리고 노동 집약적인 플라크 어세이 또는 TCID50 계산법을 기반으로합니다. 두 검사결과 모두 세포주에서 바이러스 감염으로 인한 가시적인 세포병증 효과(CPE)의 측정에 의존하므로 낮은 감염성의 바이러스를 적정하기 어려울 수 있습니다(즉, 본 연구에서 H7pp). 우리는 인플루엔자 pps에 포함된 GFP RNA의 qRT-PCR로 pps를 정상화하는 것이 편리하고 효과적이며 신속한 방법이라고 생각합니다.
종합하면, 우리의 기술은 안전하고 적응력이 뛰어나며, 수용체, 트로피즘, 엔벨로프 당단백질 기능, 중화 항체, 바이러스 약물 개발, 진단 및 백신 설계를 포함한 포위된 바이러스를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 평가.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
이 작품은 절강 성 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, 2017KY538), 항저우 시 의학 및 건강 과학 기술 계획 (보조금 번호, OO20190070), 항저우 의학 및 항저우 의학 및 기술 계획에서 보조금에 의해 지원되었다 기술 핵심 프로젝트 (그랜트 번호, 2014Z11) 및 사회 개발 및 과학 연구의 항저우 시 자치 응용 프로그램 프로젝트 (그랜트 번호, 20191203B134).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benzonase Nuclease | Millipore | 70664 | Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions |
| Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) | Corning | 3599 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic Individual alphanumeric codes for well identification |
| Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) | Costar | 3516 | Individual alphanumerical codes for well identification Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma irradiation |
| Dulbecco's modified essential medium (DMEM) | Gibco | 11965092 | A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells |
| Fetal bovine serum | Excell | FND500 | fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays |
| Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) | Beckman coulter | cytoflex | |
| Human alveolar adenocarcinoma A549 cells | ATCC | CRM-CCL-185 | |
| Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells | ATCC | CRL-11268 | A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines |
| Inverted fluorescent biological microscope | Olympus | BX51-32P01-FLB3 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX31-12PHP | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668019 | Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets. |
| Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit | NEB | E3006L | Will withstand up to 14,000 RCF RNase-/DNase-free Nonpyrogenic |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells | ATCC | CCL-34 | |
| MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Axygen | MCT-150-C | 33 mm, gamma sterilized |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF | Millipore | SLHV033RS | an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Gibco | 11058021 | The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria. |
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | Maximum RCF is 12,500 xg Temperature range from -80 °C to 120 °C RNase-/DNase-free Sterile |
| PP Centrifuge Tubes (15 mL) | Corning | 430791 | a stable and highly reactive serine protease |
| Proteinase K | Beyotime | ST532 | Treated for optimal cell attachment Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic |
| TC-treated Culture Dish (60mm) | Corning | 430166 | Trypsin from bovine pancreas TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein |
| TPCK-trypsin | Sigma | T1426 | This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements. |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 |
References
- Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). , Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
- White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43 (3), 189-219 (2008).
- Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3 (1), 1501 (2008).
- Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9 (12), 113629 (2014).
- Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280 (5371), 1884-1888 (1998).
- Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72 (5), 3935-3943 (1998).
- Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17 (1), 21-39 (2016).
- Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252 (5485), 743-745 (1974).
- Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
- Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16 (1), 47-55 (2016).
- Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197 (5), 633-642 (2003).
- Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (1), 118-122 (2009).
- Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81 (8), 4343-4347 (2007).
- Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232 (2), 379-382 (1997).
- Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (17), 8033-8037 (1993).
- Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
- Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
- Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5 (12), 15825 (2010).
- Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39 (1), 27-33 (2007).
- Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 405-408 (2009).
- Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390 (4), 1305-1308 (2009).
- McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13 (8), 715-724 (2006).
- Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (2), 183-195 (2014).
- Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
- Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47 (1), 29-33 (2010).
- Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9 (4), 443-455 (2011).
- Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27 (4), 530-541 (2009).
- Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30 (23), 3413-3422 (2012).
- Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29 (38), 6606-6613 (2011).
- Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8 (9), 254 (2016).
- Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429 (24), 3875-3892 (2017).
- Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
- Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
- Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64 (1), 23-32 (1999).
- Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72 (4), 3155-3160 (1998).
- Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214 (2), 370-384 (1999).
- Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179 (1), 226-232 (2012).
- Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15 (2), 1006819 (2019).
- Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36 (22), 3101-3111 (2018).
