Summary
Mevcut el yazması, hipokampal arteriyol ve kılcal damarları fare beyninden nasıl izole edilebildiğini ve basınç miyografisi, immünoresans, biyokimya ve moleküler çalışmalar için nasıl basınçlandırılabildiğini ayrıntılarıyla anlatmaktadır.
Abstract
İnce davranışsal değişikliklerden geç evre demansa kadar, vasküler kognitif bozukluk genellikle serebral iskemi sonrasında gelişir. İnme ve kardiyak arrest son derece cinsel dimorfik hastalıklardır, ve her ikisi de serebral iskemi neden. Ancak, vasküler bilişsel bozukluğu anlamada ilerleme, ve daha sonra cinsiyete özgü tedaviler geliştirme, kısmen fonksiyonel çalışmalarda fare modellerinden beyin mikrosirkülasyon soruşturma zorlukları ile sınırlı olmuştur. Burada, fare beyninden ex vivo hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol (HiCaPA) preparatında kapiller-arteriyol sinyalini incelemek için bir yaklaşım salıyoruz. Kapiller stimülasyona yanıt olarak arterioler çapı ölçmek için mikrosirkülasyonu nasıl izole edebileceğimizi, kanülasyonu nasıl bastırabileceğimizi ve basınçlendirebileceğimizi anlatıyoruz. Biz uygun fonksiyonel kontroller HiCaPA hazırlık bütünlüğünü doğrulamak ve tipik sonuçlar görüntülemek için kullanılabilir göstermek, bir nörovasküler kaplin ajan olarak potasyum test ve Kir2 içe doğrulayan potasyum kanal ailesinin son karakterize inhibitörü etkisi de dahil olmak üzere, ML133. Ayrıca, erkek ve dişi farelerden elde edilen preparatlarda yanıtları karşılaştırıyoruz. Bu veriler fonksiyonel araştırmaları yansıtırken, yaklaşımımız moleküler biyoloji, immünkimya ve elektrofizyoloji çalışmalarında da kullanılabilir.
Introduction
Beyin yüzeyinde pial dolaşım çok çalışmanın nesnesi olmuştur, kısmen deneysel erişilebilirlik nedeniyle. Ancak serebral vaskülatürün topolojisi farklı bölgeler oluşturur. Kan akışını yönlendirmek için önemli kapasite ile anastomozlar açısından zengin sağlam pial ağ aksine, intraserebral parenkimal arterioller (PAs) mevcut sınırlı teminat kaynağı, her biri sinirdokusununayrı bir hacim perfüzyon 1,2. Bu, benzersiz fizyolojik özellikleri ile birlikte3,4,5,6,7,8, intraserebral arterioller serebral kan akımı için önemli bir site yapar kan akışı üzerinde bir darboğaz etkisi oluşturur (CBF) yönetmelik9,10. Izolasyon ve PAs cannülasyonu doğasında teknik zorluklara rağmen, son on yılda basınçlıkaplar 11 ,12,13,14,15,16,17kullanarak ex vivo fonksiyonel çalışmalarda artan bir ilgi gördü. Bu artan ilgi nin nedenlerinden biri nörovasküler kaplin (NVC), beyin fonksiyonel hiperemi18sürdüren mekanizma üzerinde yürütülen önemli araştırma çabasıdır.
Bölgesel olarak, CBF hızla lokal nöral aktivasyon19aşağıdaki artabilir. NVC'yi kontrol eden hücresel mekanizmalar ve sinyal özellikleri tam olarak anlaşılamamıştır. Ancak, nöral aktivite algılama ve yukarı arteriyol20,21,22dilate bir hiperpolarize elektrik sinyali içine çevirerek NVC sırasında beyin kılcal damarları için daha önce beklenmedik bir rol tespit . Eylem potansiyelleri23,24 ve astrositik endfeet üzerinde büyük iletkenlik Ca2 +aktive K+ (BK) kanallarının açılması25,26 interstisyel potasyum iyon konsantrasyonu artırmak [K+]o, hangi kılcal damar damar endotel güçlü içe doğrulayıcı K+ (Kir) kanallarının aktivasyonu ile sonuçlanır. Bu kanal harici K+ tarafından değil, aynı zamanda hiperpolarizasyon kendisi tarafından aktive edilir. Boşluk kavşakları ile yayılan, hiperpolarize akım sonra arteriyol kadar komşu kapiller endotel hücrelerinde yeniler, nerede miyosit gevşeme ve CBF artış nedenolur 20,21. Bu mekanizmanın çalışması bize vazoaktif ajanlar ile kapiller stimülasyon sırasında arterioler çapı ölçmek için basınçlı kapiller-parankimal arteriyol (CaPA) hazırlık geliştirmek için yol açtı. CaPA preparat bozulmamış bir kanüle intraserebral arteriyol segmenti oluşur, aşağı kapiller ramification. Kılcal uçlar bir mikropipet ile oda cam alt karşı sıkıştırılır, hangi tıkabasır ve tüm vasküler oluşumu stabilize20,21.
Daha önce fare korteks20,21 ve sıçan amigdala13 ve hipokampus16,17arteriyollerden CaPA preparatları görüntüleyerek enstrümantal yenilikler yaptık. Hipokampal vaskülatür patolojik koşullara yatkınlığı nedeniyle daha fazla dikkat alır gibi, burada fare hipokampus CaPA hazırlık için bir adım adım yöntem sağlamak (HiCaPA) sadece fonksiyonel NVC çalışmalarda değil, aynı zamanda moleküler biyoloji, immünokimya ve elektrofizyoloji kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler Colorado Üniversitesi, Anschutz Tıp Kampüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine göre yapıldı.
1. Çözümler
- Diseksiyon için MOPS-tamponlu tuzlu kullanın ve numuneleri kullanılmadan önce 4 °C'de tutun. Çözeltiye gaz yapmayın. Aşağıdaki bileşimi ile MOPS tamponlu tuzlu hazırlayın: 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM KH2PO4, 1 mM MgSO4, 2.5 mM CaCl2, 5 mM glikoz, 3 mM MOPS, 0.02 mM EDTA, 2 mM piruvat, 10 mg/mL büyükbaş serum albumin, pH 7.3 4 °C.
- Banyo çözeltisi ve pipet çözeltisi olarak yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) kullanın. Gaz hem aCSF ve Ca2 +-% 5 CO2ile ücretsiz aCSF , % 20 O2, ve N2 dengesi. Aşağıdaki bileşimi ile çözelti hazırlayın: 125 mM NaCl, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO3, 1.25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 4 mM glikoz, 2 mM CaCl2, pH 7.3 (% 5 CO2ile havalandırma ile , 20% O2, ve N2 dengesi).
- Nominal ca2+-free aCSF (0 mM [Ca2+]o, 5 mM EGTA) cinsinden maksimal dilatasyonu elde edin.
2. Organ odası hazırlığı
- Borosilikat cam kılcal damarları (dış çap = 1,2 mm; iç çap = 0,69 mm; uzunluk = 10 cm) bir cam çekmeceye yerleştirin. Bir ucunda uzun, ince bir ucu yapmak için kılcal çekin.
- Odanın bir tarafına, luminal damar basınç minyatür peristaltik pompa bağlanabilir bir kanül ekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, kanülün ucunu kırın, böylece ilgi kabına uyacak kadar küçük, ancak çözeltilerin uçtan akmasına izin verecek kadar büyüktür. Ucun yaklaşık 10-15 μm çapında olduğundan emin olun.
- Kanülleri bir şırınga kullanarak oksijenli aCSF ile 0,22 μm'lik bir filtre ile doldurun. Kanülde hava kabarcığı veya enkaz olmadığından emin olun.
- Odanın karşı tarafına iki kanül daha ekleyin. Onların ipuçlarını kırmak etmeyin.
3. Hipokampus diseksiyon ve izolasyon
- Ötenazi ve bir farenin kafasını kesmek. Bu deney için, erkekler ve dişiler arasındaki farkları karşılaştırmak için 8 haftalık bir C57BL6/J farekullanın. Fareye pentobarbital enjekte edin ve cerrahi makasla kafasını kesin.
- Küçük diseksiyon makasları kullanarak, başının üst kısmında orta hat boyunca deri kesti. Deriyi yanlara doğru hareket ettirin.
- Kafatasının kaudal tarafında başlayarak, koku ampulleri ulaşılır kadar orta hat boyunca kafatası kesti. Beyin açığa çıkana kadar kafatasının bazı kısımlarını çıkarın.
- Farenin burnunun yanından başlayarak yavaşça beyni çıkarın. Koku ampulleri, kranial sinirler ve omurilik küçük diseksiyon makas ile yapıları keserek beyin ayırın.
- Beyni tamamen batırmak için yeterli MOPS çözeltisi ile bir diseksiyon plakayerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, ventral tarafı aşağı bakan diseksiyon plakasının ortasına beyin yerleştirin.
- Jilet kullanarak, uzunlamasına çatlak boyunca beyni ikiye böl. Keskin kenar, diseksiyon plakasının altına paralel olacak şekilde bıçağı tutun. Bıçağı tek vuruşta beyne doğru bastır. Bir yarımküreyi plakanın kenarına doğru hareket ettirin.
- Her yarımküre için ayrı ayrı veya paralel olarak aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Orta çizgi aşağı bakacak şekilde plakanın ortasına bir yarımküre yerleştirin. Sonra beyincik ve beyin sapı kaldırmak için enine çatlak boyunca kesmek için jilet kullanın. Bıçağı dokuyu doğruit.
- Hemisferi medial tarafın yukarı bakacak şekilde döndürün (Şekil 1A). Yerde beyin tutmak için bir spatula kullanın. İkinci bir spatula kullanarak, hipokampus kapsayan talamus, septum ve hipotalamus kaldırmak için corpus callosum ve kepçe altında alt ucu ekleyin (Şekil 1B).
- Hipokampus artık serebrum arka tarafında yakın kavisli bir yapı olarak görünür olduğundan emin olun. Serebrumu yerinde tutmak için bir spatula kullanarak, hipokampusu serebrumdan çıkarmak için ikinci spatulayı kullanın (Şekil 1C).
- Hipokampi'yi MOPS çözeltisi ile yarı yolda dolu yeni bir diseksiyon plakasına aktarın. Beynin geri kalanını at.
4. Hipokampal arteriyol izolasyonu
- Her hipokampus için aşağıdaki adımları tamamlayın.
- Bölümün her iki ucunda küçük iğneler kullanarak hipokampi birini sabitle. Hipokampal arter yukarı bakıyor.
- Çok keskin forceps kullanarak, yavaşça hipokampus küçük bölümleri germek. Bu arteriyolçevreleyen doku gevşetmek, daha kolay onları incelemek için yapım.
- Dış enine arter initeetmek için dorsal hipokampal doku ile arama (Şekil 1C)16,27.
- Yavaşça dış enine arter kapmak ve yavaş yavaş hipokampus CA3 bölge perfusing arteriyol ve kılcal toplamak için doku uzak çekin.
- Dokudan çıkarılacak başka damar lar kalmadıktan sonra hipokampi'yi atın. Kullanımda değilken plakalar buz üzerinde damarları tutun.
5. Hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol kanülülasyonu
- Kılcal damarlar ile biten bir dalı ile bir arteriyol bulun. Organ odasına aktarın. Arteriyol tam olarak genişlendiğinde yaklaşık 15-30 μm olduğundan emin olun (Şekil 1D).
- Kanül ucunu hedef alanın altındaki arteriole duvarından iterek kan damarını dikkatlice monte edin. Dikkatle kravat yerleştirmek için yeterli doku olana kadar kanül üzerine gemi kaydırın.
- Kan damarı ve kanül üzerine sığar, böylece 12-0 naylon dikişile gevşek bir düğüm yapın. Bağları güvence altına almak için yarım otostop çeldiğini kullan. Sonra düğüm sıkmak ve kanül arteriol güvenli uçları çekin. Yavaşça forceps ile çekerek kravat altında herhangi bir yabancı gemi dalları çıkarın.
- Başka bir kravat yapmak ve mühür için arteriole diğer ucunda güvenli.
- Odanın altındaki kapak kaymasına karşı düz olana kadar bağlı olan kanülile kanülü indirin. Kanülçok fazla düşürmek için dikkatli olun ya da kıracak.
- Odanın karşı tarafında bir kanül kullanarak, aşağı böylece noktası arteriol sonunda kravat aşağı pins.
- Kapiller dalı kapak kaymasına sabitlemek için üçüncü kanülkullanın. Kılcal damarların uçlarını açıkta bırakarak ucu dalanın ucuna yakın yerleştirin (kanülün altına değil).
6. Basınç miyografisi
- Kayıt yazılımıyla odayı diseksiyon alanından mikroskoba taşıyın.
- Giriş ve çıkış borularını perfüzyon için hazneye bağlayın. Perfüzyonu ısıtmalı aCSF (37 °C) ile 4 mL/dk akış hızında başlatın.
- Basınçlı kanülü basınç transdüseri ile eşleştirilmiş peristaltik bir pompaya takın ve iç basıncı 20 mm Hg'ye getirin.
- Kayıt yazılımını başlatın. Mümkün olan en net görüntüyü elde etmek için mikroskop ve görüntüleme ayarlarını ayarlayın. Ayarlar algılama yazılımı için optimize edildikten sonra kaydı başlatın.
- Bir kenar algılama yazılımı ile arterçapı nı kaydederken damar Basıncını 40 mm Hg'ye kadar artırın.
- ~ 15-20 dakika aCSF ile oda dışında MOPS çözeltisi yıkamak için izin ve HiCaPA hazırlık sağlamak ve miyojenik sesi geliştirmek.
- Bir geminin canlılığını test etmek için banyo perfüzyonuna 1 μM NS309 çözeltisi uygulayın (Bkz. Şekil 2A,B ve Temsili Sonuçlar bölümü). Arterioler segment daha önce açıklandığı gibi yaklaşık% 30-40 miyojenik sesi gösteren, büyütmek gerekir3,14,20.
7. Kapiller uçların fokal stimülasyonu
- Arteriyol için temel tonu kurulduktan ve endotel fonksiyonu değerlendirildikten sonra, kapiller stimülasyon yanıtını test edin.
- Bir cam çekmece kullanarak, bir ucunda ince bir nokta olacak şekilde kanüller olun. Test edilen ilacın 5 psi'de uçtan sorunsuz bir şekilde akabilmesi için bir kanülden ucu kırın.
- Kanülü ilgi ilaç çözeltisi ile doldurun ve mikroskopbağlı bir 3 eksenli mikromanipülatör ekleyin. Boruyu basınç çıkarma sisteminden kanüle bağlayın.
- Yavaş yavaş kılcal damarlar yakınındaki banyo içine kanül aşağı, oda içinde gemi veya donanım herhangi bir parçası vurmak için dikkatli olmak. Onlara dokunmadan kılcal damarların uçlarının yanındaki kanülün ucunu manevra. Kanülün ucunu, kanül sızıntıları halinde uyarılmasını önlemek için kapağın hemen dışında tutun.
- Kılcal damarları uyarmaya hazır olduğunuzda, kanülleri kapak kaymasına ve kılcal damarların hemen yanına indirin. Basınç ejeksiyon sistemini istenilen fırlatma süresiyle (burada 20 s) etkinleştirin. Stimülasyon bittikten sonra, daha fazla uyarılma önlemek için biraz kanül yükseltmek.
- Gerektiğinde uyarımı tekrarlayın. Farklı ilaç bileşikleri test etmek için basınç ejeksiyon sistemi kanül değiştirin.
- Sadece kılcal damarların uyarıldığını doğrulamak için kanülü 1 μM NS309 çözeltisi ile doldurun ve yukarıdaki adımları tekrarlayın.
NOT: Kapiller endotel hücreleri NS309 tarafından aktive K+ kanalları ifade etmez, bu nedenle arteriyol uyarılma yanıt vermemelidir. Arteriol genişlerse kanülyeniden konumlandırılmalı veya deliğin çapının daha küçük olması gerekir (Bkz. Şekil 2A,B ve Temsili Sonuçlar bölümü).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Endotel küçük iletkenliği (SK) ve ara iletkenlik (IK) Ca2+duyarlı K+ kanalları PA'ların çapı üzerinde dilatrasyon etkisi uygular. Sentetik IK ve SK kanal agonisti olan 1 μM NS309'un banyo uygulaması maksimal genişlemeye neden olur(Şekil 2A,B). Ancak, kapiller endotel hücreleri IK ve SK kanalları eksikliği ve NS30920yanıt olarak hiperpolarize vermedi. Sonuç olarak, fokal basınç ejeksiyonu (20 s, 5 psi) ile 1 μM NS309 ile uyarıcı kapiller biter upstream arterioler genişlemeye neden olmadı(Şekil 2A,B). Bu sonuç, NS309'un HiCaPA preparatlarında arteriyol'a ulaşmadığını ve basınç ejeksiyonu ile kılcal damarlara uygulanan bileşiğin mekansal kısıtlamasını değerlendirmek için bir kontrol olarak kullanılabileceğini göstermektedir.
Bu hazırlık temelde kılcal damarlardan PA'lara içeriden gelen elektrik sinyallerinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. HiCaPA preparatını kullanarak, kılcal uçlara 10 mM K+ içeren aCSF uyguladık ve daha önce kortikal vaskülature20'denCaPA preparatlarında yaptığımız gibi yukarı akım arterioler dilatasyonu(Şekil 2A,C)ölçtük. Daha sonra, bildiğimiz kadarıyla ilk kez, HiCaPA preparatları kullanarak kadın farelerde kapiller-arteriyol elektrik sinyalizasyon araştırdı. 10 mM K+ ile kapiller stimülasyon ile uyarılmış arterioler dilatasyon erkek ve dişi farelerin preparatları arasında farklılık yoktu(Şekil 2A,C).
Son olarak, bu yaklaşımın bir diğer temel yararı kılcal stimülasyon önce banyoda farmakolojik araçlar uygulamak imkanıdır. Burada ML133, yeni geliştirilen Kir2 inhibitörü28etkisini test etti. Banyo perfüzyonuna 10 μM ML133 eklenmesi, hem erkek hem de dişi farelerin HiCaPA preparatlarında 10 mM K+ yanıt olarak kılcal kaynaklı arterioler dilatasyonu neredeyse ortadan kaldırmış(Şekil 2A,C). Bu son sonuç, Kir2.1 kanalının daha önce erkek beyninin kortikal mikrosirkülasyonunda tanımlandığı gibi kadın serebral vaskülatürde elektriksel sinyalizasyona aracılık ettiğini göstermektedir.
Şekil 1: Hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol (HiCaPA) preparatının fareden izolasyon ve basınçlandırma metodolojisi. (A) Yeni izole beyin interhemisferik fissür aşağıdaki sagital düzlemde ikiye kesilir ve medial tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirilir. (B) Talamus, septum ve hipotalamus yavaşça hipokampus ortaya çıkarmak için kaldırılır. (C) Hipokampus dikkatle çıkarılır. (D) Kılcal ağaçları ile arterioller hipokampus izole edilir ve arterioler segmentin bir ucu bir basınç sistemine bağlı bir mikropipet ile canülize edilir, ve diğer ucu tıkanmış. Kılcal uçlar kapatılır ve cam pipet ucu ile kapak kaymakarşı muhafaza edilir. İç çap arteriyol bir veya birkaç bölgede bir kenar algılama sistemi ile izlenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: 1 μM NS309 ile kılcal damarların fokal stimülasyonunun yukarı arteriolar çap üzerinde etkisi yoktur, 10 mM K+içeren aCSF ile stimülasyonundan farklı olarak. (A) 1 μM NS309 banyo uygulamasının etkisini gösteren upstream arteriolar çapının ve ardından 1 μM NS309 ile art arda kılcal uçsama (20 s, 5 psi) ve Kir2 kanal inhibitörü ML133'ün yokluğunda veya varlığında 10 mM K+ içeren aCSF ile temsili kayıt. 10 mM K+ kapiller üzerine uygulanması 10 μM ML133 tarafından bloke edildi hızlı upstream arterioler dilatasyon üretti. NS309 genişlemeye neden olmadı. NS309 ile kapiller stimülasyona yanıt olarak upstream arterioler dilatasyon yokluğu basınç la ilgili bileşiklerin arteriyol ulaşmadığını göstermektedir. (B) Banyoda veya kılcal uçlarda uygulanan 1 μM NS309 ile indüklenen çap değişikliklerini gösteren özet veriler (n = 14; ****p < 0.0001, eşleştirilmiş t-testi). (C) Banyoda 10 μM ML133'ten önce ve sonra hiCaPA preparatlarında doğrudan uygulanan 10 mM K+ ile indüklenen arterioler çap değişikliklerini gösteren özet veriler banyoda uygulanmıştır (***p < 0.0005, n.s. = önemsiz, eşleşmemiş t-testi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazmasında açıklanan basınçlı HiCaPA (hipokampal kapiller-parenkimal arteriyol) hazırlığı, parenkimal arteriyol29'u izole etmek, basınçlandırmak ve çalışma prosedürümüzün bir uzantısıdır29. Yakın zamanda beyin kapiller endotel hücrelerinde Kir2.1 kanallarının sinirsel aktivasyonile ilişkili [K+]o hissartışları olduğunu ve yukarı yayılan arteriyoles20'yigenişleten bir hiperpolarize sinyal ürettiğini bildirdik. Kılcal damarlar için bu daha önce beklenmeyen rolü ortaya kortikal mikrosirkülasyon capa hazırlık geliştirerek kısmen mümkün olmuştur20,21. Bu el yazması benzer bir deneysel yaklaşım sunar ama nörovasküler kaplin sırasında kılcal-arteriyol sinyalaraştırmak için basit ve tekrarlanabilir bir yaklaşım tanımlamak için fare beyninin daha derin ve daha sınırlı yapısından.
Beyin mikrosirkülasyonu zarif kırılgan ve bazı uygulamalar, özellikle germe ve damarların işleme en aza indirmek, arteriyol ve kılcal damarların hayatta kalmasını sağlamak için kullanılmalıdır. Miyojenik tonun spontan gelişimi bir preparatın canlılığının ilk göstergesidir30. Endotel fonksiyonu daha sonra sk ve IK kanallarının agonist NS309'u banyo çözeltisine ekleyerek değerlendirilebilir, bu da neredeyse maksimum genişlemeye neden olur. NS309'un banyo uygulamasına bir ton veya yanıt geliştirilmemesi durumunda, hazırlık başka bir tonda değiştirilmelidir. NS309 ayrıca fokal kapiller stimülasyonun yayılmasını test etmek için de kullanılır. Kapiller endotel hücreleri SK ve IK kanalları eksikliği nedeniyle20, basınç ejeksiyon uğrama ile kapiller üzerine NS309 lokal teslimat Şekil 2'degösterildiği gibi yukarı arterioler çapı üzerinde hiçbir etkisi olmamalıdır , bileşikler yanlışlıkla arteriol uyarmak olmadığını gösteren. Bu adımlar doğrulandıktan sonra, kapiller-arteriyol sinyalizasyon test edilebilir.
Burada 10 mM K+içeren aCSF ile kılcal damarları uyararak elektrik sinyalizasyonu inceledik. Ancak, farklı sinyal yöntemleri farklı bilinen vazoaktif ajanlar veya nörotransmitterler ile kılcal damarlar uyararak mevcut yaklaşım kullanılarak araştırılabilir. Bu hazırlık başka bir yararı araştırmak ve sonunda farklı hayvanlar arasında nvc karşılaştırmak ve farklı beyin bölgeleri arasında olasılığıdır. Beyin düzgün serebrovasküler patolojiler31,32tarafından hedef değildir, çünkü bu özellikle ilginç . Burada sunulan yaklaşımın genel bir sınırlama mikrosirkülasyon izole ederek, nörovasküler birimin önemli bileşenleri, nöronlar ve astrositler gibi, kaybolur. In vivo CBF görüntüleme için kranial pencere gibi diğer preparatlar, bozulmamış nörovasküler ünitenin yapısını korumak ve bozulmamış bir sistemde NVC çalışma daha uygundur. Ancak, kranial pencere hazırlanmasında, parenkimal arterioller belirli bir ekipman olmadan görüntü zordur, multifoton mikroskop gibi, ve derin bölgelerde, hipokampus gibi, görüntü zor kalır. Bu bağlamda Filosa laboratuvarında beyin dilimlerindeki miyojenik tonu indüklemek için ışık akışını kullanarak geliştirilen yaklaşım, beyin dilimi ile in vivo yaklaşımlar arasında zarif bir bağlantıyı temsil eder33. Ancak, çevredeki sinir dokusu topikal uygulanan bir ilacın penetrasyon sınırlayabilir, onun off-hedef potansiyelini artırmak ve yorumları zor hale, çeşitli hücre tipleri ilaçlara maruz çünkü. Öncelikle bu potansiyel sorunları çözmek için ex vivo yaklaşımımızı geliştirdik. Sonuç olarak, birden fazla yaklaşım tam NVC çalışma için birlikte kullanılmalıdır.
Özetle, bu rapor, basınçlı hipokampal arteriyol ve kılcal damarların, kılcal damar-arteriyol sürekliliği boyunca ayrı krep pozisyonlarda fonksiyonel parametreler üzerinde test edilmesine olanak tanıyan ek vivo sağlam bir hazırlığı açıklamaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Jules Morin'e el yazması hakkındaki anlayışlı yorumları için teşekkür etmek isterler. Bu araştırma, KAR Amacı Gütmeyen Umut Organizasyonumuz, Kadın Sağlığı ve Araştırma Merkezi ve NHLBI R01HL136636 (FD) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22µm Syringe Filters | CELLTREAT Scientific Products | 229751 | |
| 12-0 Nylon (12cm) Black | Microsurgery Instruments, Inc | S12-0 NYLON | |
| Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B | |
| Borosilicate Glass O.D.: 1.2 mm, I.D.: 0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| CaCl2 dihydrate | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Dissection Scope | Olympus | SZ11 | |
| ECOLINE VC-MS/CA 4-12 — complete Pump with Drive and MS/CA 4-12 pump-head | Ismatec | ISM 1090 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Fine Scissors - Sharp | Fine Science Tools | 14063-09 | |
| Inline Water Heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| Integra™ Miltex™Tissue Forceps | Fisher Scientific | 12-460-117 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| MgCl Anhydrous | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micromanipulator | Narishige | MN-153 | |
| ML 133 hydrochloride | Tocris | 4549 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NS309 | Tocris | 3895 | |
| Picospritzer III - Intracellular Microinjection Dispense Systems, 2-channel | Parker Hannifin | 052-0500-900 | |
| Pressure Servo Controller with Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P3662 | |
| Super Fine Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Surgical Scissors - Sharp-Blunt | Fine Science Tools | 14001-13 | |
| Vertical Micropipette Puller | Narishige | PP-83 |
References
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 365-370 (2007).
- Shih, A. Y., et al. Robust and fragile aspects of cortical blood flow in relation to the underlying angioarchitecture. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 22 (3), 204-218 (2015).
- Cipolla, M. J., Smith, J., Kohlmeyer, M. M., Godfrey, J. A. SKCa and IKCa Channels, Myogenic Tone, and Vasodilator Responses in Middle Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles: Effect of Ischemia and Reperfusion. Stroke. 40 (4), 1451-1457 (2009).
- Nystoriak, M. A., et al. Fundamental increase in pressure-dependent constriction of brain parenchymal arterioles from subarachnoid hemorrhage model rats due to membrane depolarization. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 300 (3), H803-H812 (2011).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Acidosis dilates brain parenchymal arterioles by conversion of calcium waves to sparks to activate BK channels. Circulation Research. 110 (2), 285-294 (2012).
- Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 20 (4), 307-316 (2013).
- Cipolla, M. J., et al. Increased pressure-induced tone in rat parenchymal arterioles vs. middle cerebral arteries: role of ion channels and calcium sensitivity. Journal of Applied Physiology. 117 (1), 53-59 (2014).
- De Silva, T. M., Modrick, M. L., Dabertrand, F., Faraci, F. M. Changes in Cerebral Arteries and Parenchymal Arterioles with Aging: Role of Rho Kinase 2 and Impact of Genetic Background. Hypertension. 71 (5), 921-927 (2018).
- Shih, A. Y., et al. The smallest stroke: occlusion of one penetrating vessel leads to infarction and a cognitive deficit. Nature Neuroscience. 16 (1), 55-63 (2013).
- Koide, M., et al. The yin and yang of KV channels in cerebral small vessel pathologies. Microcirculation (New York, N.Y.:1994). 25 (1), (2018).
- Girouard, H., et al. Astrocytic endfoot Ca2+ and BK channels determine both arteriolar dilation and constriction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3811-3816 (2010).
- Dabertrand, F., et al. Prostaglandin E2, a postulated astrocyte-derived neurovascular coupling agent, constricts rather than dilates parenchymal arterioles. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 33 (4), 479-482 (2013).
- Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D. C., Hammack, S. E., Nelson, M. T. Stress-induced glucocorticoid signaling remodels neurovascular coupling through impairment of cerebrovascular inwardly rectifying K+ channel function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (20), 7462-7467 (2014).
- Dabertrand, F., et al. Potassium channelopathy-like defect underlies early-stage cerebrovascular dysfunction in a genetic model of small vessel disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (7), E796-E805 (2015).
- Pires, P. W., Sullivan, M. N., Pritchard, H. A. T., Robinson, J. J., Earley, S. Unitary TRPV3 channel Ca2+ influx events elicit endothelium-dependent dilation of cerebral parenchymal arterioles. AJP: Heart and Circulatory Physiology. 309 (12), H2031-H2041 (2015).
- Johnson, A. C., Cipolla, M. J. Altered hippocampal arteriole structure and function in a rat model of preeclampsia: Potential role in impaired seizure-induced hyperemia. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 37 (8), 2857-2869 (2016).
- Johnson, A. C., Miller, J. E., Cipolla, M. J. Memory impairment in spontaneously hypertensive rats is associated with hippocampal hypoperfusion and hippocampal vascular dysfunction. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. , (2019).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Roy, C. S., Sherrington, C. S. On the Regulation of the Blood-supply of the Brain. The Journal of Physiology. 11 (1-2), 85-158 (1890).
- Longden, T. A., et al. Capillary K+-sensing initiates retrograde hyperpolarization to increase local cerebral blood flow. Nature Neuroscience. 20 (5), 717-726 (2017).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Dabertrand, F., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. Endothelial GqPCR activity controls capillary electrical signaling and brain blood flow through PIP2 depletion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (15), E3569-E3577 (2018).
- Harraz, O. F., Longden, T. A., Hill-Eubanks, D., Nelson, M. T. PIP2 depletion promotes TRPV4 channel activity in mouse brain capillary endothelial cells. eLife. 7, 351 (2018).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. A quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. The Journal of Physiology. 117 (4), 500-544 (1952).
- Ballanyi, K., Doutheil, J., Brockhaus, J. Membrane potentials and microenvironment of rat dorsal vagal cells in vitro during energy depletion. The Journal of Physiology. 495 (Pt 3), 769-784 (1996).
- Filosa, J. A., et al. Local potassium signaling couples neuronal activity to vasodilation in the brain. Nature Neuroscience. 9 (11), 1397-1403 (2006).
- Attwell, D., et al. Glial and neuronal control of brain blood flow. Nature. 468 (7321), 232-243 (2010).
- Coyle, P. Vascular patterns of the rat hippocampal formation. Experimental Neurology. 52 (3), 447-458 (1976).
- Wang, H. R., et al. Selective inhibition of the K(ir)2 family of inward rectifier potassium channels by a small molecule probe: the discovery, SAR, and pharmacological characterization of ML133. ACS Chemical Biology. 6 (8), 845-856 (2011).
- Pires, P. W., Dabertrand, F., Earley, S. Isolation and Cannulation of Cerebral Parenchymal Arterioles. Journal of Visualized Experiments. (111), 1-11 (2016).
- Bayliss, W. M. On the local reactions of the arterial wall to changes of internal pressure. The Journal of Physiology. 28 (3), 220-231 (1902).
- Montagne, A., et al. Blood-brain barrier breakdown in the aging human hippocampus. Neuron. 85 (2), 296-302 (2015).
- Zhang, X., et al. Circulating heparin oligosaccharides rapidly target the hippocampus in sepsis, potentially impacting cognitive functions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (19), 9208-9213 (2019).
- Kim, K. J., Filosa, J. A. Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation. The Journal of Physiology. 590 (7), 1757-1770 (2012).
