I denne protokollen er en metode for murine holmeisolasjon og transplantasjon i det inuinale subkutane hvite fettvevet beskrevet. Isolerte syngeneiske murine holmer transplanterer til en murine mottaker ved hjelp av en kjeller membran hydrogel. Blodsukkernivået til mottakerne overvåkes, og histologianalyse av holmetransplantatene utføres.
Pankreas holmetransplantasjon er en veletablert terapeutisk behandling for type 1 diabetes. Nyrekapselen er det mest brukte stedet for holmetransplantasjon hos gnagermodeller. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige holmer hos store dyr og mennesker. Det inuinale subkutane hvite fettvevet (ISWAT), et nytt subkutant rom, ble funnet å være et potensielt verdifullt sted for holmetransplantasjon. Dette nettstedet har bedre blodtilførsel enn andre subkutane mellomrom. Videre har ISWAT plass til en større holmemasse enn nyrekapselen, og transplantasjon i den er enkel. Dette manuskriptet beskriver prosedyren for mus holme isolasjon og transplantasjon i ISWAT stedet for syngeneic diabetisk mus mottakere. Ved hjelp av denne protokollen ble murine bukspyttkjerteløyer isolert av standard kollagennase fordøyelse og en kjellermembran matrise hydrogel ble brukt til å fikse rensede holmer i ISWAT-området. Blodsukkernivået til mottakermusene ble overvåket i mer enn 100 dager. Islet grafts ble hentet på dag 100 etter transplantasjon for histologisk analyse. Protokollen for holmetransplantasjon i ISWAT-nettstedet beskrevet i dette manuskriptet er enkel og effektiv.
Den verdensomspennende forekomsten og forekomsten av diabetes mellitus type 1 (T1DM) øker raskt, ifølge statistiske data fra International Diabetes Federation (IDF)1. Holmetransplantasjon er en av de mest lovende tilnærmingene for behandling av T1DM4. Siden det store gjennombruddet i klinisk holmetransplantasjon ved hjelp av Edmonton-protokollen2 ble rapportert, fungerende holmegraftoverlevelse hos T1DM-mottakere etter 5 år nå når ca 50%3.
Tidligere ble flere transplantasjonssteder, som lever, nyrekapsel, milt, intramuskulær region, subkutan plass, benmarg og omentalpose utforsket for eksperimentell holmetransplantasjon5,6,7. Noen av de ovennevnte stedene har blitt testet i kliniske innstillinger8. Selv om holmetransplantasjon i leveren fortsatt er den mest brukte metoden i klinisk anvendelse i dag9,er det flere viktige problemer å løse når du bruker dette nettstedet. For eksempel, hvordan redusere tidlig tap av transplanterte holmer forårsaket av øyeblikkelig blod mediert inflammatorisk reaksjon (IBMIR) og dårlig oksygenering forsyning10,11 og hvordan å hente holme grafts om nødvendig, fordi de diffust lokalisere i leveren. Nyrekapselen kan være et ideelt sted for gnagermottakere. Den stramme nyrekapselen begrenser imidlertid transplantasjonen av tilstrekkelige allogene holmer hos mennesker, selv om det kan være bedre egnet for holmexenotransplantasjon på grunn av de svært rensede svineøyene som brukes klinisk5,12. Derfor er søket etter et mer egnet sted for holmetransplantasjon pågår.
Det subkutane rommet kan brukes som et klinisk aktuelt sted for holmetransplantasjon på grunn av tilgjengeligheten. Effektiviteten av holmetransplantasjon i det subkutane rommet er imidlertid ekstremt lav, og krever dermed et relativt stort antall holmer for å reversere hyperglykemi13. Nylig fant et japansk forskningsteam ISWAT, et nytt subkutan sted overlegen for holmetransplantasjon i en murine modell sammenlignet med leveren14. ISWAT inneholder epigastrisk arterie og vene, slik at den rike blodtilførselen kan sikre at holmetransplantatrevaskularisering. I dette manuskriptet foreslår vi en enkel implantasjonsmetode ved hjelp av en kjellermembranmatrisehydrogel for å fikse syngeneiske murine-holmer i ISWAT. Denne protokollen viser seg effektiv for holmetransplantasjon.
Bukspyttkjertel holmetransplantasjon er en lovende terapi for å behandle T1DM. Effekten av denne behandlingen påvirkes av mange faktorer, og det er ekstremt viktig å velge et optimalt sted for holmeimplantasjon. Det ideelle anatomiske stedet for holmetransplantasjon bør ha følgende egenskaper: tilgjengelighet for enkel transplantasjon, biopsi og graft gjenfinningprosedyrer; reduserte komplikasjoner; høy suksessrate for blodsukkerkontroll; og langsiktig overlevelse av holmen grafts15,</s…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Key R&D Program of China (2017YFC1103704)Special Funds for the Construction of High Level Hospitals in Guangdong Province (2019), Sanming Project of Medicine in Shenzhen (SZSM201412020), Fund for High Level Medisinsk disiplin Bygging av Shenzhen (2016031638), Shenzhen Foundation of Science and Technology (JCJY20160229204849975, GJHZ20170314171357556), Shenzhen Foundation of Health and Family Planning Commission (SZXJ2017021SZXJ2018059), Medisinsk Vitenskapelig forskningsstiftelse i Guangdong-provinsen i Kina (A2019218), China Postdoctoral Science Foundation (2018M633218).
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit | Merck Millipore | SLHV033RB | |
1.5 mL centrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
5 mL Pasteur pipette | JingAn Biological, China | J00085 | |
5 mL syringe | Szboon, China | 20170829 | |
50 mL conical tube | Corning | 430829 | |
5-0 surgical suture | sh-Jinhuan, China | CR537 | |
60 mL syringe | Szboon, China | 20170623 | |
75% Ethanol | LIRCON, China | 9180527 | |
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) | Invitrogen | A21202 | Dilution (1:200) |
anti-mouse Glucagon antibody | Abcam | ab10988 | Dilution (1:100) |
anti-mouse insulin antibody | Cell Signaling Technology | 3014s | Dilution (1:100) |
blunt-pointed perfusion needle | Oloey, China | 005 | 32G, yellow |
BSA | Meilune, China | MB4219 | |
C57BL/6 Mice | Medical Animal Center of Guangdong Province | 8~10 weeks | |
cell culture dish | BIOFIL, China | TCD000100 | General,Non-treated,87.8 mm diameter |
centrifuge | Thermo Scientific | ST16R | |
cephalosporin | Lukang medical, China | 150303 | |
CMRL-1066 | Sigma-Aldrich | C0422 | |
Codos Pet Clipper | Szcodos, China | CP-8000 | |
collagenase Type V | Sigma | C9262 | |
DAPI | Thermo Fisher | D1306 | |
D-hank's buffer | Coolaber, China | PM5140-10 | |
dithizone | Sigma-Aldrich | D5130 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D4263 | |
Eosin staining media | Beyotime Biotech, China | C0109 | |
FBS | GE Healthcare Life Sciences | SH30084 | |
fluorescein diacetate (FDA) | Thermo Fisher | F1303 | |
fluorescent microscope | Leica | DMIL | |
gel-loading pipet tips | Corning | CLS4884 | |
HBSS | Coolaber, China | PM5150-10 | |
hematoxylin staining media | Cell Signaling Technology | 14166S | |
HISTOPAQUE-1077 | Sigma-Aldrich | RNBG0522 | |
HISTOPAQUE-1119 | Sigma-Aldrich | RNBG0536 | |
Hydrogel | BD Biosciences | 356234 | Basement Membrane Matrix |
Iodophor | LIRCON, China | 5190313 | |
light-tight culture dish | DVS, China | AN-5058548 | self-made, glass dish sprayed with black paint |
Medical Adhesive Tape | Cofoe, China | K12001 | |
non-invasive microtweezers | RWD Life Science | F11033-11 and F12016-15 | |
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system | Johnson & Johnson | 33391713 | |
ophthalmic scissors | RWD Life Science | S12012-12 and S11001-08 | |
P/S (penicillin / streptomycin) | Gibco | 15140-122 | |
pentobarbital sodium | Sigma-Aldrich | P-010 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
STZ (streptozotocin) | Sigma-Aldrich | S0130 | |
Test Strip | GenUltimate | 100-50 | |
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) | proteintech | SA00007-2 | Dilution (1:200) |
vascular clamp | RWD Life Science | R31006-04 |