Summary
هنا ، نقدم طريقة فحص معدلة يمكن استخدامها على نطاق واسع لفحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي بسرعة في مسببات الأمراض النباتية.
Abstract
RNA إسكات هو حفظ تطوريا، آلية تنظيم الجينات تسلسل محددة في eukaryotes. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض النباتية البروتينات مع القدرة على تثبيط مسار إسكات الحمض النووي الريبي النبات المضيف. على عكس بروتينات تأثير الفيروسات ، أظهرت العديد من بروتينات المؤثرات المعسرة القدرة على قمع إسكات الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض البكتيرية والأوميسيتة والفطرية ، ولا تزال الوظائف الجزيئية لمعظم المؤثرات غير معروفة إلى حد كبير. هنا ، نصف بالتفصيل نسخة معدلة قليلا من تحليل التسلل المشترك التي يمكن أن تكون بمثابة طريقة عامة لمراقبة إسكات الحمض النووي الريبي وتوصيف البروتينات المؤثرات التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الخطوات الرئيسية للنهج هي اختيار أوراق صحية ومكتملة النمو ، وضبط ثقافة البكتيريا إلى الكثافة البصرية المناسبة (OD) في 600 نانومتر ، ومراقبة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الفلورية في الوقت الأمثل على المتسللين يترك من أجل تجنب حذف المؤثرات مع ضعف نشاط القمع. هذا البروتوكول المحسن سيساهم في الفحص السريع والدقيق والمكثف للكتمات الإسكات الجيش الملكي النيبالي وبمثابة نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في الوظائف الجزيئية لهذه البروتينات.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، أدى التسارع في تسلسل الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب أمراض النباتات إلى فجوة معرفية متزايدة من أي وقت مضى بين المعلومات تسلسل والوظائف البيولوجية للبروتينات المشفرة1. ومن بين الجزيئات التي كشفت عنها مشاريع التسلسل جزيئات المؤثرات التي تقمع المناعة الفطرية وتيسر الاستعمار المضيف؛ تفرز هذه العوامل من قبل مسببات الأمراض النباتية المدمرة، بما في ذلك البكتيريا، والديدان الخيطية، والميكروبات الخيطية. وللاستجابة لهذه التهديدات، طورت النباتات المضيفة مستقبلات جديدة تتعرف على هذه المؤثرات، مما يتيح استعادة الاستجابة المناعية. وبالتالي ، تخضع المؤثرات لضغوط انتقائية مختلفة ، مما يؤدي إلى تنويع ذخيرة التأثير بين الأنساب المسببة للأمراض2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن المؤثرات المفترضة من مسببات الأمراض النباتية تعطل المناعة الفطرية النباتية عن طريق إعاقة العمليات الخلوية المضيفة لصالح الميكروبات بطرق متنوعة ، بما في ذلك خلل تنظيم مسارات الإشارات ، والنسخ ، والنقل داخل الخلايا ، واستقرار الهيكل الخلوي ، والاتجار بالحويز ، والحمض النووي الريبي إسكات3،4،5. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من مسببات الأمراض ، ولا سيما تلك من مسببات الأمراض الخيطية ، ظلت غامضة.
RNA إسكات هو جهاز تنشيط الجينات بوساطة homology التي يتم حفظها بين eukaryotes. يتم تشغيل هذه العملية من قبل الحمض النووي الريبي طويل تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) ويستهدف الحمض النووي الريبي المتماثل واحد تقطعت بهم السبل (ssRNA) بطريقة تسلسل محددة، وأنه يتلاعب مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك الدفاع المضادة للفيروسات6. للتغلب على الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ، تطورت بعض الفيروسات لتعويض إسكات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك القدرة على تكرار داخل المقصورات داخل الخلايا أو الهروب من الإشارة المعاد تنظيمها. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجية الأكثر عمومية التي تحمي الفيروسات جينومها ضد فقدان الحمض النووي الريبي المعتمد على وظيفة الجينات هو ترميز بروتينات محددة تقمع RNA إسكات7،8. وقد أنشئت عدة نهج مختلفة ميكانيكيا لفحص وتوصيف المكثفات الفيروسية من إسكات الجيش الملكي النيبالي (VSRs)، بما في ذلك التسلل المشترك للثقافات كيتومالونز Agrobacterium، والنباتات المعدلة وراثيا التعبير عن القامع المفترضة، والتطعيم وثقافة الخلية9،10،11،12، 13.
كل من هذه المقالات المحددة لها مزايا وعيوب، وتحدد VSRs بالطريقة الخاصة بها. ويستند أحد النهج الأكثر شيوعا على التسلل المشترك للثقافات A. tmuefaciens الفردية التي تؤوي البروتين الفيروسي المحتمل والجينات مراسل (عادة البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) على النباتات Nicotiana benthamiana 16c تشكل تشكيلGFP تحت سيطرة القرنبيط فسيفساء فيروس 35S المروج. في حالة عدم وجود مثبط إسكات فيروسي نشط ، يتم تحديد GFP على أنه خارجي من قبل الخلايا المضيفة ويتم إسكاته في غضون 3 أيام بعد التسلل (نقطة في البوصة). وعلى النقيض من ذلك، إذا كان البروتين الفيروسي يمتلك نشاط الكبت، فإن مستوى التعبير عن GFP يظل ثابتاً بعد 3−9 نقطة في البوصة9. هذا النسخة المشتركة من عملية التتسلل بسيطة وسريعة. ومع ذلك ، فإنه ليس مستقرا للغاية ولا حساسة. ومع ذلك ، فقد حددت في إجراء العديد من VSRs مع تسلسل البروتين المتنوعة والهياكل في العديد من فيروسات الجيش الملكي النيبالي7،8.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف العديد من البروتينات المؤثرات التي يمكن أن تمنع نشاط إسكات الحمض النووي الريبي الخلوي من البكتيريا ، الأوميسيت ، ومسببات الأمراض النباتية الفطرية14،15،16. هذه النتائج تعني أن قمع الجيش الملكي النيبالي هو استراتيجية مشتركة لتسهيل العدوى التي تستخدمها مسببات الأمراض في معظم الممالك. من الناحية النظرية، قد العديد، إن لم يكن كل، من المؤثرات ترميز مثبطات إسكات الجيش الملكي النيبالي (RSSs)؛ غير أنه لم يتم حتى الآن تحديد سوى عدد قليل منها، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص استراتيجية الفرز العامة الموثوقة. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقيق في مثبطات من إسكات الجيش الملكي النيبالي في الغالبية العظمى من مسببات الأمراض النباتية17.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكولًا مثاليًا وعامًا لتحديد تأثيرات مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تقمع إسكات الحمض النووي الريبي المحلي والنظامي باستخدام فحص التسلل الزراعي. وكان الهدف الأول من هذه الدراسة هو التأكيد على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ووصف الخطوات بالتفصيل، وبالتالي توفير فحص للفحص يناسب تقريباً جميع تأثيرات مسببات الأمراض النباتية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: يجب إجراء جميع خطوات الإجراء في درجة حرارة الغرفة (RT).
تنبيه: إيداع جميع الوسائط التي تحتوي على الميكروبات المسببة للأمراض، وكذلك النباتات والأنسجة النباتية المستخدمة في العينات، في حاويات النفايات المناسبة والأوتوكلاف قبل التخلص منها.
1. إعداد بلازميد يبني التي تحتوي على تأثيرات المفترضة
- حدد المؤثرات المعسرة المفترضة التي يتم التعبير عنها بشكل كبير أثناء العدوى ، كما يحددها تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-Seq) ، وكذلك بواسطة تقنية PCR الكمية في الوقت الحقيقي (qRT-PCR).
- تحديد موقع انشقاق إشارة الببتيد من كل المؤثرات باستخدام أداة برمجية مثل SignalP18.
- تصميم التمهيديات وأداء PCR لتضخيم الجينات ترميز التأثير من الفائدة باستخدام البوليميراز الحمض النووي عالية الدقة. أداء agarose هلام electrophoresis للتحقق من المنتج PCR، ثم استنساخ amplicon في بوابة دخول ناقلات pQBV3 باستخدام مجموعة الاستنساخ خالية من الربط(جدول المواد)،وبعد ذلك في التعبير الوجهة ناقلات pEG100 باستخدام رد فعل إعادة تركيب LR19.
- تحويل 3-5 ميكرولتر من خليط تفاعل LR إلى 100 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة (على سبيل المثال، TOP10، DH5α)، ونشر الخلايا البكتيرية المتحولة على Luria-Bertani (LB) أغار المتوسطة المكملة مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 16-20 ساعة.
ملاحظة: يمكن تحديد التحويلات الإيجابية بواسطة PCRمستعمرة 20 وتحليلها من قبل miniprep plasmid والتسلسل. - إدخال 50-100 نانوغرام من البلازميدات المؤتلفة التي تحمل بروتين التأثير إلى 100 ميكرولتر من الخلايا A. tumefaciens المختصة كيميائياً (على سبيل المثال، GV3101 أو C58C1)، وتخلط بلطف، ثم تتجمد في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة.
- أضف 500 ميكرولتر من مرق LB واحتضانه عند 30 درجة مئوية لمدة 4−6 ساعة مع اهتزاز لطيف، ثم نقل ونشر جميع خلايا البكتيريا الزراعية على LB agar متوسطة مكمّلة بـ 50 ميكروغرام/مل كاناميسين و50 ميكروغرام/مل ريفامبيسين عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
ملاحظة: يمكن التحقق من المستنسخات الإيجابية بواسطة PCR مستعمرة. - استخدام مستعمرة واحدة تحولت لتجارب تسلل الزراعية ما لم يتم توجيه خلاف ذلك.
ملاحظة: في هذا البحث، لم تتضمن أي من جينات المؤثرات التي تم اختبارها الإنترونات المتوقعة؛ تم تضخيم كل من الجينات مباشرة من الحمض النووي الجينومي لعزل ة Phytophthora sojae. يوصى بمتجه تعبير نبات العبارة بدون أي علامة، ولكن ليس ضروريًا.
2. إعداد النباتات N. بنتاميانا 16c
- إعداد مزيج التربة بوتينغ تتكون من (من حيث الحجم) 50٪ الطحالب الخث، 30٪ البيرلايت، و 20٪ فيرميكوليت، والأوتوكلاف في 120 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- نقع التربة الأوتوكلاف يمزج مع حل الأسمدة النباتية (1 ز / لتر) وحزمة فرعية لهم في الأواني الصغيرة (80 ملم × 80 ملم × 75 ملم) المخزنة في صينية أكبر (540 ملم × 285 ملم × 60 ملم).
- زرع واحد أو اثنين من بذور N. بنتاميانا 16c على سطح التربة من كل وعاء. تغطية صينية مع قبة بلاستيكية والسماح للبذور تنبت.
- ضع الدرج تحت الضوء وغرف النمو التي يتم التحكم فيها درجة الحرارة مع درجة حرارة 23-25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية 50−60٪، وفترة ضوء طويلة اليوم (14 ساعة ضوئية /10 ساعة داكنة، مع إضاءة عند 130−150 μE·m-2s-1).
- اخلع القبة البلاستيكية بعد أن تنبت البذور (3-4 أيام) واسمح للشتلات بالنمو في نفس الظروف المستخدمة لخطوة الإنبات.
- إضافة كمية مناسبة من الماء، والحفاظ على التربة رطبة ولكن ليس نقع، كل 2-3 أيام؛ إضافة الأسمدة كل 10 أيام لتعزيز المزيد من النمو. الحفاظ على النباتات N. benthamiana 16c في ظل الظروف العادية حتى تصبح جاهزة للاستخدام؛ في هذه المرحلة يجب أن يكون للنبات ما لا يقل عن خمسة أوراق حقيقية مطورة بالكامل ولا توجد أبطان مرئية أو براعم زهرة ، ويجب أن يكون للأوراق مظهر أخضر صحي).
- استخدم أوراق 3-4 أسابيع من N. benthamiana 16c لمقالات الحمض النووي الريبي المحلية لإسكات، والنباتات N. benthamiana 16c الشباب (10-14 أيام من العمر) لمقالات الحمض النووي الريبي النظامية إسكات.
ملاحظة: تختلف ظروف ومرافق نمو النباتات عبر المختبرات؛ اختيار أوراق صحية ومتطورة وموسعة بالكامل للتسلل.
3. إعداد ثقافة البكتريا الزراعية للتسلل
- اختيار مستعمرة إيجابية من لوحة LB وتلقيح الخلايا في أنبوب زجاجي يحتوي على 5 مل من LB المتوسطة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل kanamycin و 50 ميكروغرام / مل ريفامبيسين. تنمو الخلايا عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة.
- نقل 100 ميكرولتر من الثقافة إلى 5 مل من متوسط LB المكمل بنفس المضادات الحيوية، وحمض الإيثانولين (MES؛ درجة الحموضة 5.6) و20 ميكرومتر من الأسيتوسرينجون (AS). تنمو البكتيريا عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 16−20 ساعة.
- خلايا الطرد المركزي في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة. صب قبالة supernatant وإعادة تعليق بيليه في 2 مل من 10 mM MgCl2 العازلة.
- كرر الخطوة 3.3 لضمان الإزالة الكاملة للمضادات الحيوية.
- تحديد كثافة ثقافة البكتريا الزراعية من خلال قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600). ضبط إلى OD600 من 1.5−2.0 مع 10 mM MgCl2 المخزن المؤقت.
- إضافة 10 mM MES (درجة الحموضة 5.6) و 150 ميكرومتر AS إلى ثقافات التعليق النهائي واحتضان الخلايا في RT لمدة 3 ساعة على الأقل دون اهتزاز.
ملاحظة: لا تترك ثقافات التعليق النهائي بين عشية وضحاها.
4. التسلل المشترك N. بنتاميانا يترك
- مزيج كميات متساوية من ثقافة Agrobacterium التي تحتوي على 35S-GFP مع ثقافة Agrobacterium التي تحتوي على 35S- الخيار فيروس الفسيفساء القامع 2b (CMV2b)، المؤثرات المفترضة، أو ناقلات فارغة (EV).
- تتسلل بعناية وببطء إلى تعليق التفطر ة المتعددة على الجوانب اللامحورية لأوراق N. benthamiana 16c باستخدام حقنة بدون إبرة 1 مل.
- إزالة التعليق البكتيري المتبقية من الأوراق مع ماسحات الأنسجة الرخوة ودائرة هوامش بقع تسللت مع قلم صانع.
- ترك النباتات المتسللة في غرفة النمو في ظل نفس ظروف النمو.
ملاحظة: لأسباب تتعلق بالسلامة والصحة، يجب ارتداء نظارات واقية للعين وقناع أثناء التسلل. لمنع التلوث المتبادل ، يجب تغيير القفازات أو تعقيمها بالإيثانول بين عمليات التسلل. عادة ما لا يقل عن 1 مل من تعليق agrobacterium لكل ورقة هناك حاجة للتسلل. وللإسكات النظامي، ستكون هناك حاجة إلى ورقتين على الأقل للتسلل.
5. تحليل التصوير GFP
- الكشف بصريا ً عن تفلور GFP في الأوراق المزروعة حديثًا من النباتات الكاملة بعد 2 أسابيع بعد التسلل (لإسكات الحمض النووي الريبي النظامي) أو بقع متسللة من الأوراق 3−4 نقطة في البوصة باستخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية طويل الموجة (UV) دون جمع الأوراق.
- صور النباتات التي تم جمعها و / أو الأوراق المنفصلة مع كاميرا رقمية مزودة بمرشحات الأشعة فوق البنفسجية والصفراء.
ملاحظة: لمقالات عن قمع إسكات المحلية، والتحقيق في بقع تسللت من أوراق N. بنتاميانا 16c، في حين أن لمنهجي ة إسكات نشاط القمع، والتحقيق في الأوراق نمت حديثا. قد يختلف نشاط قمع إسكات الحمض النووي الريبي عبر المؤثرات الفردية. لذلك ، لاحظ البقع أو الأوراق على مدى بضعة أيام بدءًا من 3 نقطة في البوصة. استخدام CMV2b وEV كعناصر تحكم إيجابية وسلبية، على التوالي.
6. تحليل بقع الشمالية من مستويات GFP مرنا في الأوراق المتسللة
- عزل مجموع الحمض النووي الريبي من الأنسجة الورقية باستخدام كاشف العزل ة RNA(جدول المواد)
- اجمع الأنسجة الورقية من بقع N. benthamiana 16c المتسللة عند 4−7 نقطة في البوصة، واسحق النيتروجين السائل إلى مسحوق ناعم، ونقل المسحوق إلى أنبوب معقم 2 مل.
- إضافة الكاشف عزل الجيش الملكي النيبالي (1 مل / 100 ملغ الأنسجة) على الفور إلى أنبوب عينات في غطاء محرك السيارة، يهز بقوة لتجانس، واحتضان في RT لمدة 5 دقيقة.
- إضافة الكلوروفورم (200 ميكرولتر/1 مل RNA الكاشف العزل) إلى كل أنبوب في غطاء محرك السيارة، يهز بقوة لمدة 15 ق، واحتضان في RT لمدة 5 دقيقة. الطرد المركزي التجانس في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 °C.
- نقل supernatant في أنبوب جديد RNase خالية والتخلص من بيليه. إضافة 0.7 حجم من الايزوبروبانول إلى supernatant، عكس بلطف عدة مرات، واحتضان الخليط في RT لمدة 10 دقيقة.
- راسب بيليه الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي عند 12,000 × ز لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
- تجاهل supernatant، وغسل بيليه مع الإيثانول 70٪، والهواء الجاف بيليه في غطاء محرك السيارة. إذابة الحمض النووي الريبي في الماء المعالج بالديثيل بيروكربونات (DEPC) عن طريق الاحتضان في حمام مائي 65 درجة مئوية لمدة 10−20 دقيقة.
- تحليل بقع الشمالية من مستوى GFP مرنا في الأوراق المتسللة
- إعداد 1.2٪ الفورمالديهايد denaturing هلام أغاروز في 1x MOPS تشغيل العازلة.
- مزيج الجيش الملكي النيبالي 1:1 مع الحمض النووي الريبي صبغة التحميل والتشوه عن طريق الحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، والبرد على الفور عينات مشوهة على الجليد لمدة 1 دقيقة.
- تحميل العينات على هلام وelectrophorese في 100 V لمدة 50 دقيقة حتى يتم فصل الحمض النووي الريبي بشكل جيد.
- شطف الجل في 20x المالحة الصوديوم سيترات (SSC) عازلة لإزالة الفورمالديهايد ونقل الجل إلى غشاء النايلون عن طريق نقل الشعيرات الدموية في 20x SSC العازلة بين عشية وضحاها. نقع الغشاء في 2x SSC وإصلاح الجيش الملكي النيبالي إلى الغشاء عن طريق تعريض الغشاء الرطب لربط الصليب فوق البنفسجي.
- إضافة الكمية المناسبة من المخزن المؤقت التهجين (10 مل لكل 100 سم2 غشاء؛ جدول المواد) في أنبوب التهجين ويهتاج في 60 درجة مئوية في فرن التهجين.
- وضع الغشاء في أنبوب التهجين واحتضان لمدة 60 دقيقة في 60 درجة مئوية. تمييع مسبار الحمض النووي المسمى 5'DIG (التركيز النهائي، 50 نانوغرام/مل) في محلول التهجين الذي يحتوي على مخزن هجين مُدفئ مسبقًا.
- تجاهل المخزن المؤقت preهجينوجين وفورا استبدال مع حل التهجين الدفء تحتوي على التحقيق المسمى DIG. احتضان وصمة عار مع التحقيق في 60 درجة مئوية بين عشية وضحاها، مع الانفعالات لطيف.
- بعد التهجين، وغسل الغشاء مرتين في المخازن المؤقتة من زيادة stringency في 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لكل منهما. مسح بلطف الغشاء لإزالة العازلة الغسيل اضافية وإضافة الكواشف على النحو المقترح في التهجين chemiluminescent ومجموعة الكشف(جدول المواد).
- الكشف عن الإشارات الهجينة عن طريق رد فعل كيميائي جنبا إلى جنب مع نظام التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أعلاه، نحن نصف الإجراء خطوة بخطوة لفحص فحص محسنة لتقييم نشاط RSS من تأثيرات P. sojae RxLR. وتستغرق التجربة في الإجمال 5-6 أسابيع. وفي وقت لاحق، يمكن أن تتسم RSSs التي تم تحديدها من خلال الفحص بمزيد من التفصيل من حيث الوظيفة والآلية الجزيئية. كمثال على نهجنا، استخدمنا P. sojae RxLR تأثير مثبط Phytophthora من الحمض النووي الريبي إسكات 1 (PSR1)، الذي يتم إفرازه وتسليمه إلى الخلايا المضيفة من خلال الهوستوريا أثناء العدوى.
لتأكيد أن PSR1 لديه نشاط RSS وبالتالي مناسبة لهذا الأسلوب، تم خلط كل سلالة البكتريا الزراعية المحولة مع سلالة تؤوي 35S-GFP وتم اختراقها في أوراق N. بنتاميانا 16c. تم استخدام EV و CMV2b كضوابط سلبية وإيجابية ، على التوالي(الشكل 1). وصل التعبير GFP إلى أعلى مستوى في الأوراق المتسللة مع جميع الخلائط عند 2-3 نقطة في البوصة. ظلت كثافة الفلورسينس الخضراء قوية في البقع التي تم اختراقها مع 35S-GFP بالإضافة إلى CMV2b خلال فترة 6-9 أيام من الملاحظة21. كما أدى التسلل المشترك لـ GFP مع PSR1 إلى زيادة تفلور GFP خلال فترة 3.5-4.5 يوم من الملاحظات، كما يتضح من ارتفاع الفلورس في البقع المتسللة. ومع ذلك ، فإن كثافة الفلورية في بقع تسللت مع 35S -GFP وEV ضعفت في 3 نقطة في البوصة. في 4−5 نقطة في البوصة، كان الفلورسينة GFP بالكاد يمكن الكشف عنها(الشكل 1).
كشفت اللطخة الشمالية أن GFP mRNA تراكمت أعلى في الأوراق التي تعبر عن 35S-GFP بالإضافة إلى 35S-CMV2b أو 35S-GFP بالإضافة إلى 35S-PSR1 مما كانت عليها في الأوراق التي تعبر عن 35S-GFP بالإضافة إلى EV(الشكل 2). وهكذا، ساهم التعبير النسخي لـ PSR1 وكذلك CMV2b في تثبيت GFP مرنا، مما أدى إلى ارتفاع تفلور GFP.
كما استخدمنا جهاز تقييم التسلل الزراعي لتقييم انتشار إشارة الصمت في أوراق شتلات N. benthamiana 16c التي يبلغ عمرها أسبوعين. لهذا الغرض، عادة ما نختار 3-4 أوراق أكبر لحقن الأوراق الكاملة. في 14 نقطة في البوصة، أكثر من 98٪ من EV أظهرت واضحة لا GFP إشارة في الأوراق النظامية، في حين أن كل من PSR1 و CMV2b منعت بكفاءة انتشار الجهازية للإشارة إسكات من خلال رصد الفلورGFP في حوالي 80٪ من النباتات المشتركة في اختراق، وفي 20٪ المتبقية من النباتات المتسللة مع سوى عدد قليل من الأوردة الحمراء ظهرت في الأوراق الناشئة حديثا(الشكل 3).
الشكل 1: Phytophthora sojae RxLR effector PSR1 يقمع الجيش الملكي النيبالي المحلية إسكات في نيتيانا بنتاميانا (N. بنتاميانا)16c النباتات. تم اختراق الأوراق المطورة بالكامل لنباتات N. benthamiana 16c (اللوحة اليسرى) المطورة بالكامل في بقع مع خلائط Agrobacterium تحمل 35S-GFP والبنى المشار لها أعلاه في كل صورة. تم التصوير GFP مضان المنطقة المتسللة تحت الضوء الطبيعي (اللوحة الوسطى) وضوء الأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (اللوحة اليمنى) عند 4 نقطة في البوصة. وتكررت التجربة مرتين بنتائج مماثلة. الأسهم الحمراء تمثل الأوراق المخترقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تراكم GFP مرنا في تسلل N. بنتاميانا 16c يترك. CK وEV تمثل N. benthamiana 16c يترك وحده و16c يترك تسللت مع 35S-GFP زائد EV. واستخدمت عينات من EV وCMV2b كضوابط سلبية وإيجابية، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام rRNA كعنصر تحكم التحميل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: P. sojae RxLR effector PSR1 يقمع إسكات الحمض النووي الريبي النظامي في النباتات N. benthamiana 16c. ثلاث أو أربع أوراق من 2 أسابيع من العمر N. benthamiana 16c شتلات (اللوحة اليسرى) كانت عابرة المشتركة من قبل Agrobacterium إيواء 35S-GFP وإما EV أو ناقلات التعبير عن PSR1 أو CMV2b من المروج 35S. تم التصوير GFP مضان من الأوراق المزروعة حديثا تحت الضوء الطبيعي (اللوحة العليا) والأشعة فوق البنفسجية طويلة الموجة (لوحة السفلى) في 14 نقطة في البوصة. وتكررت هذه التجربة مرتين بنتائج مماثلة. السهام الحمراء تشير إلى أوراق متسللة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الجيش الملكي النيبالي إسكات هو آلية الدفاع الرئيسية المستخدمة من قبل النباتات لمكافحة الفيروسية والبكتيرية والأوميسيت، ومسببات الأمراض الفطرية. بدورها ، تطورت هذه الميكروبات إسكات البروتينات المكثفة لمواجهة إسكات المضادة للفيروسات ، وهذه RSSs تتداخل مع خطوات مختلفة من مسار إسكات الحمض النووي الريبي22،23. وقد وضعت العديد من فحص المقالات لتحديد RSSS10.
هنا، ونحن نصف بروتوكول محسنة لفحص البروتينات effector تفرزها P. sojae في الخلية المضيفة على العدوى لقدرتها على قمع الجيش الملكي النيبالي إسكات في المضيف. ويستند هذا الاسبوة المعدلة على الفيروسية المشتركة التسلل والمواد ولكن ها يختلف في عدة طرق هامة. أولا, كل من البكتيريا والنباتات N.benthamiana 16c ينبغي أن تكون قوية وصحية; هذا مهم جدا للتعبير مستقرة من المؤثرات من البكتيريا واستخدام N.benthamiana 16c وضعت بالكامل يضمن الاستنساخ التجريبية والموثوقية. نحن غالبا ما تستخدم اثنين أو ثلاثة فقط من الأوراق المطورة بالكامل لكل نبات في مرحلة النمو النباتي، والأوراق القديمة والناشئة حديثا غير مناسبة. ثانياً، يجب تعديل OD600 من الثقافة البكتيرية إلى القيمة المثلى، وعادة ً ما تكون 0.75−1.0 للفطرة الزراعية. يمكن استخدام OD600 أقل (حتى لو منخفضة مثل 0.2) لشاشة VSRs ولكن ليس PSRs24. ثالثا ، يجب أن تكون نقطة مثالية للوقت للتحقيق في الفلورسينس الأخضر الأمثل لكل المؤثرات. في الفيروس، يترك شارك في حقن مع الثقافات التي تحتوي على GFP بالإضافة إلى VSRs المفترضة تظهر زيادة ملحوظة في الفلورس الأخضر في المنطقة المتسللة في 3 نقطة في البوصة، والإشارة لا تزال عالية حتى 9 نقطة في البوصة22،ولكن تم عرضها فقط في 4 أو 5 نقطة في البوصة لPSRs في دراستنا الحالية. ولذلك، من المهم أيضا أن تؤكد كذلك نشاط إسكات الجيش الملكي النيبالي عن طريق تحديد كمية تراكم الحمض النووي الريبي GFP. وأخيرا، من الضروري استخدام عنصر التحكم المناسب. VSRs ليست دائما الضوابط الإيجابية المثالية لتحديد البروتينات المؤثرات لأن هذه البروتينات لديها نشاط قمعي أقوى بكثير من PSRs. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الفشل في الكشف عن مثبطات ضعيفة من إسكات الجيش الملكي النيبالي.
في هذا التقرير، ونحن نبرهن على استخدام لدينا فحص تعديل لفحص لمثبطات من الحمض النووي الريبي إسكات في Phytophthora وبوتشينيا غرامينيس مسببات الأمراض. وهكذا ، فإن طريقتنا تمثل أداة مفيدة لتوصيف المؤثرات المحتملة التي ترميز RSSs ، والتي تعزز قابلية المرض عن طريق تثبيط تراكم الحمض النووي الريبي الصغيرة15،16،17. لذلك ، نعتقد أنه يمكن استخدام بروتوكولنا على نطاق واسع لفحص المؤثرات التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. وسيركز العمل في المستقبل على تحديد المزيد من RSSs في مسببات الأمراض الأخرى، وعلى توضيح دور إسكات الحمض النووي الريبي في الدفاع النباتي ضد الميكروبات الغازية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح من "برنامج شوقوانغ" لمؤسسة تطوير التعليم في شنغهاي ولجنة التعليم لبلدية شنغهاي، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين ( 2018YFD0201500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31571696 و 31660510)، وبرنامج الألف مواهب للمهنيين الشباب في الصين، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), Appendix 3D 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
