Summary
Hier stellen wir ein modifiziertes Screening-Verfahren vor, das ausgiebig eingesetzt werden kann, um RNA-Silencing-Suppressoren bei Pflanzenpathogenen schnell zu überprüfen.
Abstract
RNA-Silencing ist ein evolutionär konservierter, sequenzspezifischer Genregulationsmechanismus in Eukaryoten. Mehrere Pflanzenpathogene haben Proteine entwickelt, die die Fähigkeit hemmen können, den RNA-Silencing-Signalweg der Wirtspflanze zu hemmen. Im Gegensatz zu Viruseffektorproteinen haben nur mehrere abgesonderte Effektorproteine die Fähigkeit gezeigt, DAS RNA-Silencing bei bakteriellen, Oomyceten- und Pilzpathogenen zu unterdrücken, und die molekularen Funktionen der meisten Effektoren bleiben weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir detailliert eine leicht modifizierte Version des Co-Infiltrations-Assays, die als allgemeine Methode zur Beobachtung des RNA-Silencings und zur Charakterisierung von Effektorproteinen dienen könnte, die durch Pflanzenpathogene abgesondert werden. Die wichtigsten Schritte des Ansatzes sind die Wahl der gesunden und voll entwickelten Blätter, die Anpassung der Bakterienkultur an die entsprechende optische Dichte (OD) bei 600 nm und die Beobachtung der Fluoreszenz (Green Fluorescent Protein, GFP) zur optimalen Zeit auf der infiltrierten um das Auslassen von Effektoren mit schwacher Unterdrückungsaktivität zu vermeiden. Dieses verbesserte Protokoll wird zu einem schnellen, genauen und umfassenden Screening von RNA-Silencing-Suppressoren beitragen und als hervorragender Ausgangspunkt für die Untersuchung der molekularen Funktionen dieser Proteine dienen.
Introduction
In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Beschleunigung der Genomsequenzierung von Mikroorganismen, die Pflanzenkrankheiten verursachen, zu einer immer größeren Wissenslücke zwischen Sequenzinformationen und den biologischen Funktionen kodierter Proteinegeführt 1. Unter den Molekülen, die durch Sequenzierungsprojekte enthüllt werden, sind Effektormoleküle, die angeborene Immunität unterdrücken und die Wirtskolonisierung erleichtern; diese Faktoren werden durch zerstörerische Pflanzenpathogene, einschließlich Bakterien, Nematoden und fadenförmige Mikroben, abgesondert. Um auf diese Bedrohungen zu reagieren, haben Wirtspflanzen neuartige Rezeptoren entwickelt, die diese Effektoren erkennen und die Wiederherstellung der Immunantwort ermöglichen. Daher unterliegen Effektoren verschiedenen selektiven Drücken, was zu einer Diversifizierung des Effektorrepertoires zwischen pathogenen Linien2führt. In den letzten Jahren haben vermeintliche Effektoren von Pflanzenpathogenen gezeigt, dass sie die angeborene Pflanzenimmunität stören, indem sie die zellulären Wirtsprozesse behindern, um den Mikroben auf verschiedene Weise zu nützen, einschließlich Dysregulation von Signalwegen, Transkription, intrazellulärer Transport, Zytoskelettstabilität, Vesikelhandel und RNA-Silencing3,4,5. Die überwiegende Mehrheit der Pathogen-Effektoren, insbesondere solche von fadenförmigen Krankheitserregern, sind jedoch rätselhaft geblieben.
RNA-Silencing ist eine homologievermittelte Geninaktivierungsmaschinerie, die unter Eukaryoten konserviert wird. Der Prozess wird durch lange doppelsträngige RNA (dsRNA) ausgelöst und zielt sequenzspezifisch auf die homologe einsträngige RNA (ssRNA) ab und manipuliert eine Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich antiviraler Abwehr6. Um angeborene Immunantworten des Wirts zu überwinden, haben sich einige Viren entwickelt, um das RNA-Silencing auszugleichen, einschließlich der Fähigkeit, sich innerhalb intrazellulärer Kompartimente zu replizieren oder dem reorganisierten Signal des Stummschaltungs zu entkommen. Die allgemeinste Strategie, mit der Viren ihre Genome vor dem RNA-Silencing-abhängigen Verlust der Genfunktion schützen, besteht jedoch darin, bestimmte Proteine zu kodieren, die die RNA-Silencing7,8unterdrücken. Es wurden mehrere mechanistisch unterschiedliche Ansätze zur Abschirmung und Charakterisierung viraler Suppressoren von RNA-Silencing (VSRs) etabliert, einschließlich der Ko-Infiltration von Agrobacterium-Tumefaciens-Kulturen, transgenen Pflanzen, die vermeintliche Unterdrücker ausdrücken, Pfropfen und Zellkultur9,10,11,12,13.
Jeder dieser Assays hat Vor- und Nachteile und identifiziert VSRs auf seine eigene Weise. Einer der häufigsten Ansätze basiert auf der Ko-Infiltration einzelner A. tmuefaciens-Kulturen, die das potentielle virale Protein und ein Reportergen (typisch grünes fluoreszierendes Protein [GFP]) auf den Nicotiana benthamiana 16c-Pflanzen beherbergen, die GFP unter der Kontrolle des Blumenkohlmosaikvirus 35S-Promotors konstitutiv ausdrücken. In Ermangelung eines aktiven viralen Silencing Suppressors wird GFP von den Wirtszellen als exogen identifiziert und innerhalb von 3 Tagen nach der Infiltration (dpi) zum Schweigen gebracht. Im Gegensatz dazu, wenn das virale Protein Unterdrückungsaktivität besitzt, bleibt der Expressionsgrad von GFP stabil über 3-9 dpi9. Dieser Co-Infiltrationstest ist einfach und schnell; es ist jedoch weder sehr stabil noch empfindlich. Nichtsdestotrotz hat der Assay zahlreiche VSRs mit unterschiedlichen Proteinsequenzen und Strukturen in vielen RNA-Virenidentifiziert 7,8.
Kürzlich wurden mehrere Effektorproteine, die die zelluläre RNA-Silencing-Aktivität hemmen können, durch bakterielle, Oomycete und Pilzpflanzenpathogene14,15,16charakterisiert. Diese Ergebnisse implizieren, dass RNA-Silencing-Unterdrückung eine gemeinsame Strategie zur Erleichterung der Infektion ist, die von Krankheitserregern in den meisten Königreichen verwendet wird. Theoretisch könnten viele, wenn nicht alle Der Effektoren RNA-Silencing Suppressoren (RSS) kodieren; Bisher wurden jedoch nur wenige identifiziert, was vor allem auf den Mangel an zuverlässiger und allgemeiner Screening-Strategie zurückzuführen ist. Darüber hinaus wurden die Unterdrücker von RNA-Silencing bei der überwiegenden Mehrheit der Pflanzenpathogene17nicht untersucht.
In diesem Bericht stellen wir ein optimiertes und allgemeines Protokoll zur Identifizierung von Pflanzenpathogeneffektoren vor, die lokale und systemische RNA-Silencing mittels agroinfiltrations-Assay unterdrücken können. Das oberste Ziel dieser Studie war es, die wichtigsten Aspekte des Protokolls hervorzuheben und die Schritte detailliert zu beschreiben, wodurch ein Screening-Test durchgeführt wird, der für fast alle Effektoren von Pflanzenpathogenen geeignet ist.
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Protocol
HINWEIS: Alle Schritte des Verfahrens sollten bei Raumtemperatur (RT) durchgeführt werden.
VORSICHT: Legen Sie alle Medien, die pathogene Mikroben enthalten, sowie die pflanzen- und pflanzengewebe, die im Test verwendet werden, in die entsprechenden Abfallbehälter und Autoklaven ein, bevor Sie sie entsorgen.
1. Herstellung von Plasmidkonstrukten, die vermeintliche Effektoren enthalten
- Wählen Sie vermeintlich eftare resezernierte Effektoren, die während der Infektion stark exprimiert werden, wie durch RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) und weiter durch quantitative Echtzeit-PCR-Technik (qRT-PCR) bestimmt.
- Bestimmen Sie die Signalpeptidspaltungsstelle jedes Effektors mit einem Software-Tool wie SignalP18.
- Entwerfen Sie Primer und führen Sie PCR durch, um das Gen zu verstärken, das den Effektor von Interesse mit High-Fidelity-DNA-Polymerase kodiert. Führen Sie agarose Gelelektrophorese durch, um das PCR-Produkt zu überprüfen, klonen Sie dann das Amplikon in den Gateway-Eintragsvektor pQBV3 mit dem ligationsfreien Klonen-Kit(Materialtabelle) und anschließend in den Zielexpressionsvektor pEG100 mit der LR-Rekombinationsreaktion19.
- Transformieren Sie 3-5 l LR-Reaktionsgemisch in 100 l kompetente E. coli-Zellen (z.B. TOP10, DH5), verbreiten Sie die transformierten Bakterienzellen auf dem Agarmedium Luria-Bertani (LB), ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin, und inkubieren Sie bei 37 °C für 16 -20 h.
HINWEIS: Positive Transformationsmittel können durch Kolonie PCR20 identifiziert und durch Plasmid-Miniprep und Sequenzierung weiter analysiert werden. - 50 bis 100 ng rekombinante Plasmide, die Effektorprotein etatmitteltragen, in 100 l chemisch kompetente A. tumefaciens-Zellen (z. B. GV3101 oder C58C1) einführen, sanft mischen und dann 1 min in flüssigem Stickstoff einfrieren. Die Zellen in einem 37 °C-Wasserbad 5 min auftauen.
- Fügen Sie 500 l LB-Brühe hinzu und brüten bei 30 °C für 4 x 6 h mit sanftem Schütteln, und übertragen und verteilen Sie dann alle Agrobakterienzellen auf LB-Agar-Medium, ergänzt mit 50 g/ml Kanamycin und 50 g/ml Rifampicin bei 30 °C für 2 Tage.
HINWEIS: Positive Klone können durch Kolonie PCR überprüft werden. - Verwenden Sie eine einzige transformierte Kolonie für Agro-Infiltrationsexperimente, sofern nicht anders bestimmt.
HINWEIS: In der vorliegenden Forschung enthielt keines der getesteten Effektorgene vorhergesagte Introns; jedes der Gene wurde direkt aus der genomischen DNA eines Phytophthora-Soja-Isolats verstärkt. Es wird ein Gateway-Pflanzenausdrucksvektor ohne Tag empfohlen, ist jedoch nicht erforderlich.
2. Herstellung von N. benthamiana 16c Pflanzen
- Bereiten Sie Topfbodenmischungen vor, die aus (Volumen) 50% Torfmoos, 30% Perlit und 20% Vermiculit und Autoklaven bei 120 °C für 20 min bestehen.
- Autoklaven-Bodenmischungen mit Pflanzendüngerlösung (1 g/L) einweichen und in kleinere Töpfe (80 mm x 80 mm x 75 mm) in einem größeren Fach (540 mm x 285 mm x 60 mm) unterpacken.
- Säen Sie ein oder zwei Samen von N. benthamiana 16c auf die Bodenoberfläche jedes Topfes. Bedecken Sie das Tablett mit einer Kunststoffkuppel und lassen Sie Samen keimen.
- Legen Sie das Tablett unter licht- und temperaturgeregelte Wachstumskammern mit einer Temperatur von 23 bis 25 °C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50 bis 60 % und einer langen Photoperiode (14 h hell/10 h dunkel, mit einer Beleuchtung bei 130 x 150,2s-1).
- Nehmen Sie die Kunststoffkuppel ab, nachdem die Samen keimen (3-4 Tage) und lassen Sie die Sämlinge unter den gleichen Bedingungen wachsen, die für den Keimschritt verwendet werden.
- Fügen Sie eine angemessene Menge an Wasser, halten Boden feucht, aber nicht einweichen, alle 2 bis 3 Tage; Dünger alle 10 Tage hinzufügen, um weiteres Wachstum zu fördern. Halten Sie N. benthamiana 16c Pflanzen unter normalen Bedingungen, bis sie gebrauchsfertig sind; in diesem Stadium sollte die Pflanze mindestens fünf voll entwickelte echte Blätter und keine sichtbaren Achsel- oder Blütenknospen haben, und die Blätter sollten ein gesundes grünes Aussehen haben).
- Verwenden Sie 3-4 Wochen alte Blätter von N. benthamiana 16c für lokale RNA-Silencing-Assays und junge N. benthamiana 16c-Pflanzen (10-14 Tage alt) für systemische RNA-Silencing-Assays.
ANMERKUNG: Die Bedingungen und Anlagen für den Pflanzenwachstum sind von Labor zu Laboratorien unterschiedlich; sich für gesunde, gut entwickelte und vollständig erweiterte Blätter zur Infiltration zu entscheiden.
3. Vorbereitung der Agrobacterium-Kultur zur Infiltration
- Wählen Sie eine positive Kolonie aus der LB-Platte und impfen Sie die Zellen in ein Glasrohr, das 5 ml LB-Medium enthält, das mit 50 g/ml Kanamycin und 50 g/ml Rifampicin ergänzt wird. Wachsen Sie die Zellen bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen pro Minute für 24 bis 48 h.
- Übertragen Sie 100 l Kultur in 5 ml LB-Medium, ergänzt mit gleichen Antibiotika, 10 mM 2-(N-Morpholino)-Ethanulfonsäure (MES; pH 5,6) und 20 m Acetosyringon (AS). Wachsen Sie Bakterien bei 30 °C mit Schütteln bei 200 Umdrehungen von 16 bis 20 h.
- Zentrifugenzellen bei 4.000 x g für 10 min. Gießen Sie den Überstand ab und setzen Sie das Pellet in 2 ml 10 mM MgCl2 Puffer wieder auf.
- Wiederholen Sie Schritt 3.3, um die vollständige Entfernung von Antibiotika zu gewährleisten.
- Bestimmen Sie die Dichte der Agrobacterium-Kultur, indem Sie die optische Dichte bei 600 nm (OD600) messen. Stellen Sie sich auf einen OD600 von 1,5 x 2,0 mit 10 mM MgCl2 Puffer ein.
- Fügen Sie 10 mM MES (pH 5,6) und 150 M AS zu den endgültigen Suspensionskulturen hinzu und inkubieren Sie die Zellen bei RT für mindestens 3 h ohne Schütteln.
HINWEIS: Lassen Sie die endgültigen Suspensionskulturen nicht über Nacht.
4. Mitinfiltration N. benthamiana Blätter
- Mischen Sie gleiche Volumina einer Agrobacterium-Kultur, die 35S-GFP enthält, mit einer Agrobacterium-Kultur, die 35S-Gurken-Mosaikvirus-Suppressor 2b (CMV2b), vermeintlichen Effektor oder leeren Vektor (EV) enthält.
- Die gemischten Agrobacteriumsuspensionen an den abaxialen Seiten von N. benthamiana 16c Blättern mit einer 1 ml nadellosen Spritze vorsichtig und langsam infiltrieren.
- Entfernen Sie die verbleibende bakterielle Suspension von den Blättern mit Weichteilwischer und kreisen Sie die Ränder der infiltrierten Pflaster mit einem Maker-Stift.
- Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen in der Wachstumskammer unter den gleichen Wachstumsbedingungen.
HINWEIS: Aus Sicherheits- und Gesundheitsgründen sollten Schutzbrillen und eine Maske während der Infiltration getragen werden. Um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, sollten Handschuhe zwischen den Infiltrationen mit Ethanol gewechselt oder sterilisiert werden. Normalerweise werden für die Infiltration mindestens 1 ml Agrobacteriumsuspensionen pro Blatt benötigt. Für die systemische Silencing, mindestens zwei Blätter werden für die Infiltration erforderlich sein.
5. GFP-Bildgebungsanalyse
- Visuell detektieren GFP Fluoreszenz in neu gewachsenen Blättern von ganzen Pflanzen 2 Wochen nach der Infiltration (für systemische RNA-Silencing) oder infiltrierte Flecken von Blättern 3-4 dpi mit einer langwelligen ultravioletten (UV) Lampe ohne Blättersammlung.
- Fotografieren Sie gesammelte Pflanzen und/oder freistehende Blätter mit einer Digitalkamera, die sowohl mit UV- als auch mit gelben Filtern ausgestattet ist.
HINWEIS: Für Tests der lokalen Silencing-Unterdrückung, untersuchen sie infiltrierte Flecken von N. benthamiana 16c Blättern, während für systemische Silencing-Unterdrückungsaktivität neu gewachsene Blätter untersucht werden. Die Unterdrückungsaktivität der RNA-Silencing kann je nach Effektor variieren. Beobachten Sie daher die Pflaster oder Blätter über ein paar Tage ab 3 dpi. Verwenden Sie CMV2b und EV als positive bzw. negative Steuerelemente.
6. Nördliche Blot-Analyse des GFP-mRNA-Spiegels in infiltrierten Blättern
- Isolierung der gesamten RNA aus Blattgewebe mit dem RNA-Isolationsreagenz (Materialtabelle)
- Sammeln Sie Blattgewebe aus infiltrierten N. benthamiana 16c Pflasterbeizen bei 4-7 dpi, pulverisieren Sie in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver, und übertragen Sie das Pulver in ein steriles 2 ml Rohr.
- Fügen Sie das RNA-Isolationsreagenz (1 ml/100 mg Gewebe) sofort in das beprobte Röhrchen in einer Haube, schütteln Sie kräftig, um zu homogenisieren, und inkubieren Bei RT für 5 min.
- Chloroform (200 l/1 ml RNA-Isolationsreagenz) in jede Röhre in einer Haube geben, 15 s kräftig schütteln und bei RT 5 min inkubieren. Zentrifugieren Sie das Homogenat bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C.
- Übertragen Sie den Überstand in ein neues RNase-freies Rohr und entsorgen Sie das Pellet. 0,7 Volumen Isopropanol in den Überstand geben, mehrmals sanft invertieren und die Mischung bei RT 10 min inkubieren.
- Das RNA-Pellet durch Zentrifugation bei 12.000 x g 15 min bei 4 °C ausfälten.
- Den Überstand entsorgen, das Pellet mit 70% Ethanol waschen und das Pellet in einer Haube lufttrocknen. Lösen Sie die RNA in diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem Wasser auf, indem Sie sie in einem 65 °C-Wasserbad für 10 bis 20 min inkubieren.
- Nördliche Blot-Analyse des GFP-mRNA-Spiegels in den infiltrierten Blättern
- Bereiten Sie ein 1,2% Formaldehyd-denaturierendes Agarose-Gel in 1x MOPS Laufpuffer vor.
- RNA 1:1 mit RNA-Ladefarbstoff mischen und durch Inkubation bei 65 °C 10 min denaturieren, die denaturierten Proben sofort 1 min auf Eis abkühlen.
- Die Proben auf das Gel und Elektrophorese bei 100 V 50 min laden, bis die RNA gut getrennt ist.
- Spülen Sie das Gel in 20x Saline-Natriumcitrat-Puffer (SSC), um Formaldehyd zu entfernen und das Gel über Nacht in 20x SSC-Puffer auf die Nylonmembran zu übertragen. Die Membran in 2x SSC einweichen und die RNA an der Membran fixieren, indem Sie die nasse Membran UV-Kreuzverknüpfungen aussetzen.
- Fügen Sie die entsprechende Menge an Hybridisierungspuffer (10 ml pro 100 cm2 Membran; Materialtabelle) in einem Hybridisierungsrohr und bei 60 °C im Hybridisierungsofen aufregnen.
- Die Membran in das Hybridisierungsrohr geben und 60 min bei 60 °C inkubieren. Verdünnen Sie eine 5'DIG-markierte DNA-Sonde (Endkonzentration, 50 ng/ml) in die Hybridisierungslösung, die einen vorgewärmten Hybridisierungspuffer enthält.
- Verwerfen Sie den Prehybridisierungspuffer und ersetzen Sie ihn sofort durch eine vorgewärmte Hybridisierungslösung, die die DIG-markierte Sonde enthält. Inkubieren Sie den Blot mit Sonde bei 60 °C über Nacht, mit sanfter Rührung.
- Waschen Sie die Membran nach der Hybridisierung zweimal in Puffern mit erhöhter Stringenz bei 60 °C für jeweils 20 min. Wischen Sie die Membran vorsichtig ab, um zusätzlichen Waschpuffer zu entfernen und Reagenzien hinzuzufügen, wie im chemilumineszierenden Hybridisierungs- und Detektionskit (Tabelle der Materialien) vorgeschlagen.
- Erkennen Sie hybridisierte Signale durch chemilumineszierende Reaktion in Kombination mit dem Bildgebungssystem.
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Representative Results
Oben beschreiben wir das Schritt-für-Schritt-Verfahren für einen verbesserten Screening-Assay zur Beurteilung der RSS-Aktivität von P. sojae RxLR-Effektoren. Insgesamt dauert das Experiment 5 bis 6 Wochen. Anschließend können die durch den Assay identifizierten RSS weiter in Funktion und molekularem Mechanismus charakterisiert werden. Als Beispiel für unseren Ansatz verwendeten wir den P. sojae RxLR effecto Phytophthora Suppressor der RNA-Silencing 1 (PSR1), der während der Infektion durch Haustoria abgesondert und in Wirtszellen abgegeben wird.
Um zu bestätigen, dass PSR1 RSS-Aktivität hat und somit für diese Methode geeignet ist, wurde jede transformierte Agrobacterium-Sorte mit einer Sorte gemischt, die 35S-GFP beherbergt, und wurde in Blätter von N. benthamiana 16c infiltriert. EV und CMV2b wurden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet (Abbildung 1). Die GFP-Expression erreichte den höchsten Wert in Blättern, die mit allen Mischungen bei 2-3 dpi infiltriert wurden. Die grüne Fluoreszenzintensität blieb stark in Denten, die mit 35S-GFP plus CMV2b während eines Beobachtungszeitraums von 6 bis 9 Tagen koinfiltriert wurden21. Die Gleichzeitige Infiltration von GFP mit PSR1 führte auch zu einer stärkeren GFP-Fluoreszenz während einer Beobachtungszeit von 3,5 bis 4,5 Tagen, wie eine erhöhte Fluoreszenz in den infiltrierten Pflastern zeigt. Die Fluoreszenzintensität in Mitfiltrierten mit 35S-GFP und EV schwächte sich jedoch bei 3 dpi ab. Bei 4-5 dpi war die GFP-Fluoreszenz kaum nachweisbar (Abbildung 1).
Nördlicher Blot zeigte, dass GFP mRNA sich höher in den Blättern angesammelt emittierte, die 35S-GFP plus 35S-CMV2b oder 35S-GFP plus 35S-PSR1 ausdrückten, als in den Blättern, die 35S-GFP plus EV exdrücken (Abbildung 2). So trug die transkriptionelle Expression von PSR1 sowie CMV2b zur Stabilisierung der GFP mRNA bei, was zu erhöhter GFP-Fluoreszenz führte.
Wir verwendeten auch den Agro-Infiltrationstest, um die Ausbreitung des Schalldämpfersignals in den Blättern der 2 Wochen alten N. benthamiana 16c Sämlinge zu bewerten. Zu diesem Zweck wählten wir in der Regel 3 x 4 größere Blätter für ganze Blätter Injektion. Bei 14 dpi zeigten mehr als 98% der EV offensichtliche keine GFP-Signalisierung in systemischen Blättern, während sowohl PSR1 als auch CMV2b die systemische Ausbreitung des Silencing-Signals effizient verhinderten, indem gfP-Fluoreszenz in etwa 80% der mitinfiltrierten Pflanzen beobachtet wurde und in den restlichen 20% der infiltrierten Pflanzen mit nur wenigen roten Adern in neu entstandenen Blättern auftraten (Abbildung 3).
Abbildung 1: Phytophthora sojae RxLR-Effektor PSR1 unterdrückt lokale RNA-Silencing in Nicotiana benthamiana (N. benthamiana) 16c Pflanzen. Vollentwickelte Blätter von 3-4 Wochen alten N. benthamiana 16c Pflanzen (linke Platte) wurden in Pflastern mit Agrobacterium-Mischungen mit 35S-GFP und den über jedem Bild angegebenen Konstrukten mitinfiltriert. Die GFP-Fluoreszenz des infiltrierten Bereichs wurde unter natürlichem Licht (Mittelpanel) und langwelligem UV-Licht (rechte spie) bei 4 dpi abgebildet. Das Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Rote Pfeile stellen infiltrierte Blätter dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Akkumulation von GFP mRNA in infiltrierten N. benthamiana 16c Blättern. CK und EV repräsentieren N. benthamiana 16c Blätter allein und 16c Blätter mit 35S-GFP plus EV mitinfiltriert. Proben von EV und CMV2b wurden als negative bzw. positive Kontrollen verwendet. Darüber hinaus wurde rRNA als Ladesteuerung eingesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: P. Sojae RxLR-Effektor PSR1 unterdrückt systemische RNA-Silencing in N. benthamiana 16c Pflanzen. Drei oder vier Blätter von 2 Wochen alten N. benthamiana 16c Sämlingen (linkes Panel) wurden vorübergehend von Agrobacterium mit 35S-GFP und entweder EV oder Vektor, der PSR1 oder CMV2b aus dem 35S-Promotor ausdrückt, mitinfiltriert. Die GFP-Fluoreszenz von neu gewachsenen Blättern wurde unter natürlichem Licht (Obere Platte) und langwelligem UV-Licht (untere Platte) bei 14 dpi abgebildet. Dieses Experiment wurde zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt. Rote Pfeile zeigten infiltrierte Blätter an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
RNA-Silencing ist ein wichtiger Abwehrmechanismus, der von Pflanzen eingesetzt wird, um virale, bakterielle, Oomycete- und Pilzkrankheitserreger zu bekämpfen. Im Gegenzug haben diese Mikroben Silencing-Suppressor-Proteine entwickelt, um antiviralen Silencing entgegenzuwirken, und diese RSS stören verschiedene Schritte des RNA-Silencing-Signalwegs22,23. Zur Identifizierung von RSSs10wurden mehrere Screening-Assays entwickelt.
Hier beschreiben wir ein verbessertes Protokoll für das Screening von Effektorproteinen, die von P. sojae bei einer Infektion in die Wirtszelle sezerniert werden, um RNA-Silencing im Wirt zu unterdrücken. Dieser modifizierte Assay basiert auf einem viralen Co-Infiltrations-Assay, unterscheidet sich aber in mehreren wichtigen Weisen. Erstens sollten sowohl Bakterien als auch N.benthamiana 16c Pflanzen kräftig und gesund sein; dies ist sehr wichtig für die stabile Expression von Effektoren aus den Bakterien und die Verwendung von voll entwickelten N.benthamiana 16c gewährleistet experimentelle Reproduzierbarkeit und Zuverlässigkeit. Wir verwenden oft nur zwei oder drei voll entwickelte Blätter pro Pflanze im vegetativen Wachstumsstadium, die alten und neu entstandenen Blätter sind ungeeignet. Zweitens muss OD600 der Bakterienkultur auf einen optimalen Wert eingestellt werden, in der Regel 0,75 bis 1,0 für Agrobacterium. Eine niedrigere OD600 (auch so niedrig wie 0,2) kann verwendet werden, um VSRs zu überprüfen, aber nicht PSRs24. Drittens muss der ideale Zeitpunkt für die Untersuchung der grünen Fluoreszenz für jeden Effektor optimiert werden. Bei Viren weisen Blätter, die mit Kulturen mit GFP plus vermeintlichen VSRs injiziert werden, einen deutlichen Anstieg der grünen Fluoreszenz im infiltrierten Bereich bei 3 dpi auf, und das Signal bleibt bis 9 dpi22hoch, aber es wurde nur bei 4 oder 5 dpi für PSRs in unserer vorliegenden Studie ausgestellt. Daher ist es auch wichtig, die RNA-Silencing-Aktivität weiter zu bestätigen, indem die Akkumulation von GFP mRNA quantifiziert wird. Schließlich ist es wichtig, die entsprechende Kontrolle zu verwenden. VSRs sind nicht immer die idealen positiven Kontrollen zur Identifizierung von Effektorproteinen, da diese Proteine eine viel stärkere Unterdrückungsaktivität haben als PSRs. Dies könnte dazu führen, dass schwache Unterdrücker von RNA-Silencing nicht erkannt werden.
In diesem Bericht zeigen wir die Verwendung unseres modifizierten Assays zum Abschirmen von Unterdrückern von RNA-Silencing bei Phytophthora- und Puccinia graminis-Erregern. Daher stellt unsere Methode ein nützliches Werkzeug zur Charakterisierung potenzieller Effektoren dar, die RSSs kodieren, die die Krankheitsanfälligkeit fördern, indem sie die kleine RNA-Akkumulation15,16,17hemmen. Daher glauben wir, dass unser Protokoll breit genutzt werden könnte, um Effektoren zu überprüfen, die von Pflanzenpathogenen abgesondert werden. Zukünftige Arbeiten werden sich darauf konzentrieren, mehr RSS s in anderen Krankheitserregern zu identifizieren und die Rolle der RNA-Silencing bei der Pflanzenabwehr gegen eindringende Mikroben zu klären.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des "Shuguang Program" der Shanghai Education Development Foundation und der Shanghai Municipal Education Commission, des National Key Research and Development Program of China National Key R&D Program of China ( 2018YFD0201500), die National Natural Science Foundation of China (Nr. 31571696 und 31660510), das Thousand Talents Program for Young Professionals of China und die Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (18DZ2260500).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
References
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- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
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