Summary
Dieses Protokoll stellt ein robustes, reproduzierbares Modell des vaskularisierten Kompositallotransplantats (VCA) dar, das auf die gleichzeitige Untersuchung der Immunologie und funktionellen Erholung ausgerichtet ist. Die In akribische Technik investierte Zeit in eine orthotopische Transplantation mit handgenähten Gefäßanastomosen und neuronaler Koaptation in eine orthotopische Transplantation mit dem rechten Mittelschenkel der Hinterbeine.
Abstract
Insbesondere die Gliedmaßentransplantation und das vaskularisierte Komposit-Allotransplant (VCA) im Allgemeinen haben ein breites therapeutisches Versprechen, das durch aktuelle Einschränkungen bei der Immunsuppression und funktionellen neuromotorischen Erholung gebremst wurde. Viele Tiermodelle wurden für die Untersuchung einzigartiger Merkmale von VCA entwickelt, aber hier präsentieren wir ein robustes reproduzierbares Modell der orthotopischen Hintergliedsetransplantation bei Ratten, das beide Aspekte der aktuellen VCA-Beschränkung gleichzeitig untersuchen soll: Immunsuppressionsstrategien und funktionelle neuromotorische Erholung. Im Zentrum des Modells steht die Verpflichtung zu akribischen, bewährten mikrochirurgischen Techniken wie handgenähten Gefäßanastomosen und handgenähter neuronaler Koaptation des Femoralnervs und des Ischiasnervs. Dieser Ansatz führt zu dauerhaften Rekonstruktionen von Gliedmaßen, die länger lebende Tiere ermöglichen, die in der Lage sind, sich zu rehabilitieren, die täglichen Aktivitäten wieder aufzuleben und funktionelle Tests durchzuführen. Mit der kurzfristigen Behandlung konventioneller Immunsuppressiva überlebten allotransplantierte Tiere bis zu 70 Tage nach der Transplantation, und isotransplantierte Tiere bieten eine lange Lebensdauer über 200 Tage nach der Operation hinaus. Der Nachweis einer neurologischen funktionellen Genesung ist nach der Operation 30 Tage vorhanden. Dieses Modell bietet nicht nur eine nützliche Plattform für die Vernehmung immunologischer Fragen, die für VCA und Nervenregeneration einzigartig sind, sondern ermöglicht auch die In-vivo-Prüfung neuer therapeutischer Strategien, die speziell auf VCA zugeschnitten sind.
Introduction
Die Gliedmaßentransplantation unter der breiteren Kategorie der vasularisierten Komposit-Allotransplant (VCA) oder Kompositgewebe-Allotransplant (CTA) hat ihr therapeutisches Versprechen noch nicht erfüllt. Seit den ersten erfolgreichen Transplantationen mit menschlicher Hand in Lyon, Frankreich und Louisville, Kentucky in den Jahren 1998 und 1999 wurden weltweit über 100 Transplantationen mit der oberen Extremität bei sorgfältig ausgewählten Patienten durchgeführt1. Größere Anwendbarkeit wurde durch erhebliche Immunsuppression und begrenzte funktionelle neuromotorische Erholung behindert. Aktuelle Immunsuppressionsstrategien führen zu einer 85%igen Inzidenz akuter Abstoßung bei 77% Inzidenz opportunistischerInfektionen 2. Auf der anderen Seite, funktionelle Erholung nach Handtransplantation tritt; Die durchschnittliche Behinderung der Armschulter und der Hand (DASH) verbessert sich von 71 auf 43, aber diese Funktionsstufe kann immer noch als Behinderung2gelten. Angesichts der nicht lebensrettenden Natur der Gliedmaßentransplantation müssen aktuelle Techniken in Tiermodellen verfeinert werden, um den nächsten Schritt in VCA zu machen.
Seit dem ersten Rattenmodell der Gliedmaßentransplantation im Jahr 19783wurden viele innovative Tiermodelle entwickelt, um das Feld von VCA4zu fördern, mit vaskulären Manschettenanastomosen zur Minimierung der operativen Zeit5,6, heterotopische osteomyokutane Transplantationen zur Minimierung physiologischer Beleidigung des Empfängertiers7,8,9,10,11, und neuartige immunologische Ansätze7,12,13,14., Das hier vorgestellte Rattenmodell der orthotopischen rechten Hintergliedse der Mittelschenkeltransplantation betont akribische, bewährte mikrochirurgische Techniken wie handgenähte Gefäßanastomosen und neuronale Koaptation als Vorabinvestition in eine robuste, reproduzierbare Modellplattform, um beide Aspekte der aktuellen VCA-Beschränkung gleichzeitig zu untersuchen: Immunsuppressionsstrategien und funktionelle neuromotorische Erholung.
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Protocol
Alle Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Guide for the Care and Use of Laboratory Animals der National Institutes of Health (NIH) durchgeführt und vom Northwestern University Animal Care and Use Committee genehmigt. Die spezifischen Verfahren wurden unter dem Protokoll IS00001663 durchgeführt.
HINWEIS: Es wurden zwei Rattenstämme verwendet, Lewis-Ratten und August Copenhagen x Irish (ACI) Ratten. Die Tiere wurden in drei Behandlungsgruppen eingeteilt: Allotransplantohne Immunsuppression (ACI zu Lewis), Allotransplant mit konventioneller Immunsuppression (ACI zu Lewis) und Isotransplant (Lewis zu Lewis oder ACI zu ACI). Lewis ist ein inzuchtiger Stamm, während ACI-Ratten einen ausgezüchteten Wildtyp darstellen, daher wurde diese Kombination gewählt, um die schlechtere Ablehnungsreaktion zu modellieren. Die konventionelle Immunsuppression wurde subkutan entweder als Rapamycin 1 mg/kg vom postoperativen Tag (POD) minus 1 bis POD 28 oder als FK506 3 mg/kg von POD 0 bis POD 14 und danach einmal wöchentlich verabreicht. Sowohl männliche als auch weibliche Ratten waren anspruchsberechtigte Empfänger im Alter von 8 bis 16 Wochen und wiegen zum Zeitpunkt der Operation zwischen 250 und 400 Gramm.
1. Spender rechte Hintere Gliedmaßen Ernte
- Induzieren Sie Die Vollnarkose mit 5% Isofluran in reinem Sauerstoff durch einen Verdampfer mit einem geeigneten Aufräumsystem.
- Bestätigen Sie ausreichende Tiefe der Anästhesie mit Zehenkneifung, und verwenden Sie dann Haarschneider, um das Fell von der rechten Hintergliedund und rechten Leistenoperation zu trimmen
- Down-Titrate des Isoflurans durch einen Nagetier Nasenkegel auf 2-2,5%.
- Positionieren Sie die Rattensupine mit ausgebreiteten Gliedmaßen, die an den Seiten auf einem Bedienbrett mit einem Heizkissen darunter verklebt sind. Desinfizieren Sie die haarlose Haut mit 70% Reiben Vonalkohol und schützen Sie das Operationsfeld mit steriler Gaze.
- Mit einem geeigneten mikrochirurgischen Mikroskop beginnen mikrochirurgische Instrumente und mit einfachem Zugang zur bipolaren und monopolaren Elektrokauterie die Zerlegung.
- Verwenden Sie eine Schere, um einen umlaufenden Haut-/Unterhautgewebeschnitt um das rechte Hinterglied zu machen. Beginnen Sie in der Leistenfalte medial auf etwa dem gleichen Niveau wie das Leistenband und verlängern Sie dorsal-seitlich, um den Umfangsschnitt zu vervollständigen.
- Nachdem die Muskelschicht direkt unter dem Schnitt freigelegt wurde, sezieren und kauterisieren Sie die oberflächlichen epigastrischen Gefäße, die von der Muskelschicht zur gerade erzeugten proximalen Haut/Subkutanenklappe führen.
- Reflektieren Sie die proximale Klappe superomedial auf das Leistenband und die distale Haut/Subkutane Klappe inferolateral auf das Knie.
- Verwenden Sie einen Drahtretraktor oder gewalzte Gaze, um das Feld freizulegen.
- Beachten Sie, dass die Leistenanatomie der Ratte dem Menschen ähnlich ist; von seitlich bis medial liegen der Nerv, die Arterie und die Vene.
- Sezieren Sie den Oberschenkelnerv, teilen Sie ihn scharf am Leistenband, proximal bis zur Bifurkation, wenn möglich. Ziehen Sie den geteilten Nerv minderwertig zurück und halten Sie ihn sicher aus dem Weg, bedeckt unter feuchter Gaze.
- Wenn Sie die Aufmerksamkeit auf die Oberschenkelarterie und Vene lenken, verwenden Sie 4 cm 7-0 Seidenbinde, um die Gefäße atraumatisch zurückzuziehen, anstatt sie direkt zu handhaben.
- Ligate alle Zweige der Femoralgefäße, wie sie mit 7-0 Seidenkrawatten entstehen; die Zweige zwischen den Bindungen aufteilen. Für sehr kleine Zweige kann anstelle von Krawatten eine bipolare Kautery verwendet werden.
HINWEIS: Arterielle und venöse Zweige, die eine Teilung erfordern, umfassen den oberflächlichen Zirkumflex iliac und die Muskelgefäße. Der oberflächliche Zirkumflex-Iliac ist in der Regel am größten und scheint tief zu tauchen, wie die profunda femoral beim Menschen, aber die Profunde fehlt in der Ratte15. Distaler zweige der Femoralgefäße wie die höchste Genicular und der saphenous Zweig erfordern in der Regel keine Teilung. - Systematisch injizieren 500 internationale Einheiten von Heparin durch die Penisvene in einem männlichen Rattenspender. Verwenden Sie die oberflächliche epigastrische Vene, wenn die Spenderratte weiblich ist.
- Lassen Sie das Heparin 2 min systemisch zirkulieren, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren.
- Ligate die Oberschenkelarterie mit 7-0 Seidenkrawatten als proximal zum Leistenband wie möglich und teilen Sie zwischen den Krawatten.
- Ähnlich wie die Arterie, ligate und teilen Sie die femorale Vene.
- Reflektieren Sie sowohl Arterie als auch Vene minderwertig, sicher aus dem Weg, bedeckt unter feuchter Gaze zusammen mit dem Oberschenkelnerv zuvor bedeckt. Sezieren Sie die ventralen Muskelgruppen und achten Sie darauf, jedes sichtbare Gefäß, das entsteht, zu kauterisieren. Aufmerksamkeit auf Hämostase hier wird Empfänger Blutverlust nach Reperfusion zu minimieren.
- Tief zu den ventralen Muskelgruppen, identifizieren und stark teilen Sie den Ischiasnerv proximal zu seinen Zweigen. Drei Ischiaszweige sind in der Regel sichtbar: tibial, peroneal und sural. Alle drei sollten alle in der Spender-Extremität erhalten bleiben. Ein vierter Kutanzweig ist in dieser Sektion in der Regel nicht zu sehen15,16.
- Beenden Sie die Teilung der verbleibenden ventralen und dorsalen Muskelgruppen auf mittlerer Oberschenkelebene mit akribischer Hämostase. Es kann notwendig sein, die Gliedmaße zwischendurch zurückzuziehen, um die Teilung der Muskeln zu vollenden.
- Transect den Oberschenkelknochen an der Mittelwelle mit einer handgeführten Akku-Drehsäge.
- Nachdem Sie das Gliedmaßentransplantat vom Spender entfernt haben, schneiden Sie die seidengebundenen Enden von der Transplantatseite femoralarterienundund die Venenstümpfe, wodurch die Gefäße wieder geöffnet werden.
- Legen Sie einen 24-Spur-Angiokatheter in den Transplantatarterienstumpf ein und spülen Sie das Transplantat mit 250 internationalen Einheiten Heparin in 5 ml eiskalter Normalsaline verdünnt, wobei sie beobachtet, wie sie klar durch die geöffnete Vene fließt.
- Langsam, spülen Sie das Transplantat für ca. 3 min. Überschüssige seimful Spülung kann das Endothel beschädigen.
- Legen Sie das Transplantat in eine gekühlte Salineschale, die in einem Eiskübel verschachtelt ist, bis zur Transplantation.
- Euthanisieren Sie die Spenderratte mit bilateraler Thorakotomie.
- Reinigen Sie alle chirurgischen Instrumente entsprechend.
2. Empfänger native rechte hintere Gliedmaßenamputation
- Induzieren Sie die Anästhesie mit Isofluran bei 5%, bestätigen Sie die Tiefe, trimmen Sie das Fell, positionieren Sie das Tier und desinfizieren Sie die Haut mit Alkohol, wie für die Spenderratte beschrieben.
- Downtitrat-Isofluran auf 2-2,5% und injizieren subkutane präoperative Analgesie mit Buprenorphin 1,2 mg/kg und präoperative Prophylaxe mit Enrofloxacin 7,5 mg/kg.
- Wie für den Spender, machen Sie einen umfangren Schnitt in der Leistenfalte, reflektieren Hautklappen, die Hämostase versichern, und sezieren Sie den Oberschenkelnerv, arterielle und Venen, ligating die gleichen Zweiggefäße wie oben.
- Teilen Sie den Oberschenkelnerv dister als für den Spender, aber proximal zur Bifurkation, wenn möglich.
- Sezieren Sie die Oberschenkelarterie und Vene mit genügend Platz, um jeweils einzeln auf der Ebene des Leistenbandes zu klemmen. Die Vene und arterien mit mikrochirurgischen Bulldoggenklemmen klemmen. Nach dem Einklemmen jedes Gefäß scharf mit einer Schere teilen.
- Teilen Sie die ventralen und dorsalen Muskeln des Oberschenkels in der Mittleren Oberschenkelebene mit akribischer Hämostase, wobei die Extremität bei Bedarf medial zurückgezogen wird.
- Identifizieren und teilen Sie die Ischiasnerven proximal zu ihren Zweigpunkten wie oben.
- Transect den Oberschenkelknochen an der Mittelwelle mit der Säge.
- Entfernen Sie das native Rechte des Empfängers und entsorgen Sie es entsprechend.
- Titrate des Isoflurans auf 1-1,5% durch den Nasenkegel.
3. Spender für die Implantation der Rezipienten
- Mit der Handsäge, rasieren Sie alle Unregelmäßigkeiten von Spender und Empfänger Oberschenkelknochen geschnitten enden.
- Schneiden Sie mit der Säge das Nabenende einer 18-Spur-Nadel ab, die zur intramedullären Rute des Oberschenkelknochens wird.
- Bevor Sie den Knochen manipulieren, wenden Sie eine kleine Menge Knochenwachs auf das Empfänger geschnitten Ende des Oberschenkelknochens, um Die Marrow Blutungen während des Reaming-Prozesses zu reduzieren.
- Koapt den Spender und Empfänger Femoral Knochen mit der 18-Spur-Nadel als intramedulläre Rute. Eine gewisse Kraft ist notwendig, aber nicht ream entweder Knochen so weit, um den Kortex zu brechen.
- Entfernen Sie bei Bedarf die Nadel und trimmen Sie sie auf eine entsprechende Länge, so dass beide Knochen problemlos über die Nadel passen, ohne dass eine Nadel zwischen den Knochen zeigt.
- Legen Sie eine kleine Stütze wie ein Pad Gaze oder einen kleinen Felsen oder Modellierton unter die Spenderglied, um sie von Spannung fernzuhalten.
- Die ventralen Muskelgruppen mit acht bis zehn einfachen unterbrochenen 5-0 Polyglactin-Nähten neu annähern, damit sich das Transplantat nicht um die Oberschenkelnadel dreht. Dies gibt dem Glied Stabilität für die Anastomosen.
- Bewässern Sie regelmäßig das Transplantat und das Operationsfeld mit eiskalter Saline, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen und warme ischämische Reperfusionsverletzungen zu reduzieren.
- Richten Sie die Spender- und Empfängerfemoralarterien aus und anastomose sie am Ende, um modezulaufen, indem Sie einfache unterbrochene 10-0 Nylon-Nähte verwenden, um sowohl Spannung als auch Looping zu vermeiden. Die Arterie benötigt durchschnittlich sechs Nähte.
- Ähnlich wie die Arterie, anastomose der Spender und Empfänger Femoral Venen in End-to-End-Mode. Die Vene erfordert sechs bis acht Nähte.
HINWEIS: Großzügige kaltherzig bewässernde, atraumatische Gefäßhandhabungstechnik und lange Schwänze als Aufenthaltsnähte für den Gefäßrückzug sind wichtige Werkzeuge für effektive mikrochirurgische Anastomosen. - Legen Sie eine kleine Menge hämostatisches Cellulosepulver um beide Anastomosen, und entfernen Sie dann die proximalen mikrochirurgischen Bulldoggenklemmen an der Vene und der Arterie.
- Prüfen Sie beide Anastomosen auf gute Durchgängigkeit und Strömung. Verwenden Sie Wattestäbchen, um die Vene sanft zu prod und eine gute Hämostase der beiden Anastomosen zu gewährleisten. Halten Sie den Druck über die Blutungsstellen und legen Sie bei Bedarf mehr hämostatisches Cellulosepulver auf. Eine weitere Naht kann durch ein blutendes Loch auf die Gefahr gebracht werden, die Nadel nur als letztes Mittel zu "back-walling".
- Wenn beide Anastomosen zufriedenstellend bestätigt werden, trimmen Sie alle verbleibenden langen Aufenthalt Nähte kurz, um die anderen zu entsprechen.
- Positionieren Sie die Ratte auf die linke seitliche Dekubitusposition, verwenden Sie die liberale Elektrokauterie, um eine akribische Hämostase jeder Reperfusionsmuskelblutung zu erreichen.
- Drehen Sie die Aufmerksamkeit auf die Nervenanastomosen, sobald Muskelhämostase gewährleistet ist. Schneiden Sie alle Nervenschnitten zurück, die zerrissen erscheinen.
- Die dorsalen Muskelgruppen unter ischiastischem Nerv mit einfachen unterbrochenen 5-0 Polyglactin-Nähten neu annähern.
- Den Ischiasnerv neu annähern. Acht bis zehn 10-0 Nylon neuronale einfache unterbrochene Nähte werden in der Regel ausreichen.
- Die erinnernden dorsalen Muskelgruppen neu annähern und dann die dorsale Haut mit 4-0 Polyglactin kontinuierlicher Naht schließen.
- Positionieren Sie die Ratte wieder in die Supine-Position und richten Sie den Oberschenkelnerv neu an. Zwei bis drei 10-0 Nylon neuronale einfache unterbrochene Nähte werden in der Regel ausreichen.
- Schließen Sie die ventrale Haut mit 4-0 Polyglactin kontinuierliche Naht. Vermeiden Sie überschüssigen Nähteschwanz, der die Ratte nach dem Erwachen reizen kann.
4. Postoperative Pflege
- Erholen Sie Tiere in ihren Käfigen mit einem Heizkissen unter dem Käfig und bereit zugang zu Nahrung und Wasser, Überwachung für frühe Komplikationen täglich für die erste Woche.
- Geben Sie postoperative Analgesie mit subkutaner Meloxicam 1 mg/kg tägliche Injektion durch POD 2. Geben Sie postoperative Antibiotikaprophylaxe verdünnt Enrofloxacin Spray. Abschrecken Sie die Autotomie (Selbstverstümmelung) mit Bitter Safe Mist, der zweimal täglich über POD 7 auf das Transplantat gesprüht wird.
- Bewahren Sie transplantierte Ratten in Käfigen mit anderen Ratten, um die Rückkehr zu täglichen Aktivitäten zu stimulieren und die transplantierte Gliedmaße zu rehabilitieren.
5. Postoperative Sensationstests
- Wenden Sie die Hargreaves-Prüfung des thermischen Sensationsprotokolls an, die auch an anderer Stelle beschrieben wird17,18.
- Legen Sie die Ratte in den Testbehälter und lassen Sie sie sich 20 Minuten lang akklimatisieren. Das Geräteglas ist sauber bestätigt, und die Wärmequelle bestätigte, mit dem Finger des Ermittlers zu arbeiten.
- Bestätigen Sie vor dem Testen, dass die Ratte wach ist und die getestete Pfote über dem Infrarot-Bewegungsmelder positioniert ist.
- Übertragen Sie wärmeenergetische Energie auf Intensitätsstufe 90. Zeitverzögerung enden, wenn das Tier seine Pfote von der Wärmequelle wegbewegt. Wenn innerhalb von 20 Sekunden keine Bewegung auftritt, wird der Test abgebrochen, um Verletzungen zu vermeiden.
- Erhalten Sie fünf Versuche pro getesteter Gliedmaße, ohne den höchsten und niedrigsten Wert, bevor Sie die durchschnittliche Wartezeit für die Entzugswartezeit für jedes Tier berechnen.
6. Postoperative Motorprüfung
- Mit einem Ganganalyse-Laufband und einer integrierten Softwareanalyseplattform können Sie nach vier bis sechs Wochen nach der Operation Kandidaten für Laufbandtests auswählen.
- Schneiden Sie alle Rattenzehennägel ein oder zwei Tage vor dem Testen.
- Akklimatisieren Sie Tiere vor dem Test für eine Stunde in den Testraum und lassen Sie eine Minute Vortest Streicheln zu, um Die Angst zu beruhigen.
- Platzieren Sie die Ratte in das Laufband, führen Sie das Laufband bei Versuchen mit zunehmender Geschwindigkeit, von 10 cm/s, auf 14 cm/s, bis zum Ziel 18 cm/s. Wenn die Ratte zurückhaltend ist und nicht zum Gehen angezäunt werden kann, brechen Sie die Tests an diesem Tag ab, um eine negative Konditionierung zu vermeiden. Lassen Sie Hochleistungskünstler bis zu 24 cm/s laufen.
- Spülen Sie das Laufbandgerät mit 70% Ethanol zwischen den getesteten Tieren.
- Gait-Parameter werden von der proprietären Software der Analyseplattform ausgegeben.
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Representative Results
Überleben und Genesung hängen von akribischer chirurgischer Technik ab. Die Aufmerksamkeit auf die vaskulären Anastomosen und die neuronalen Anastomosen sowie die oben beschriebene Knochenkoaptation ist entscheidend für den Erfolg dieses Modells. Operatives Design und repräsentative anastomotische Ergebnisse sind in Abbildung 1dargestellt.
Die Gesamtsterblichkeit war von der Immunsuppressionsstrategie abhängig, wobei die Mehrheit der isotransplantierten Tiere den Studienendpunkt von 100-200 postoperativen Tagen erreichte, wie in Abbildung 2zu sehen ist. Einmal aus dem akuten postoperativen Fenster heraus, könnten behandelte allotransplantierte Tiere bis zu 58 postoperative Tage überleben. Isografierte Ratten lebten im Laufe des Studiums unbegrenzt, während allograft transplantierte Ratten variable Sterblichkeiten von Rapamycin und FK506 hatten. Von den Behandlungen fk506 förderte die längste Lebensfähigkeit (Tag 57), während Rapamycin war zweitbeste (Tag 20) über die unbehandelte Kontrolle (Tag 10).
Die sensorische und motorische Rückgewinnung ist in Abbildung 3dargestellt. Es wurde gezeigt, dass die Tiere die sensorische Nervenfunktion der transplantierten Pfote mit dem Hargreaves-Gerät am 30. Tag wiedererlangt haben. Die Tiere erholten sich vier Wochen nach der Operation signifikant (Aii). Tiere zeigten deutliche Verbesserungen in der motorischen Funktion der transplantierten Extremität mit hilfe eines Ganganalyse-Laufbandes und einer integrierten Softwareanalyseplattform. Beispiel-Gait-Parameter basierend auf bestimmten Gliedmaßen werden angezeigt (Bii) und ein Sciatic Function Index (SFI) werden ebenfalls dargestellt (Biii).
Abbildung 1: Operatives Design wird im Cartoon-Format dargestellt. (A) Die Ratte wird mit (B) rechtem Hinterbeinquerschnitt dargestellt, der (i) das Oberschenkelbündel (Nerven, Arterie und Vene) (ii) den Ischiasnerv und (iii) den Knochen darstellt. (C) Repräsentative Mikroskope aus dem Operationsmikroskop (Spender links und Empfänger rechts) wurden von der (i) Ischiasnervanastomose (ii) der Femoral-Nervenarterie und Venenanastomosen (von oben nach unten dargestellt) und (iii) der 18-Spur-Nadel-Intramedullären Stab-Femurknochen-Koaptation genommen. Beachten Sie, dass die Spenderstrukturen auf jedem Foto links erscheinen. Beachten Sie auch, dass der Oberschenkelknochen vor der vollständigen Koaptation angezeigt wird, wenn beide Knochen entgegengesetzt sind und die Nadel im Inneren verborgen ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Prozentuales Überleben der Tiere als vorgestellte Tage nach der Operation (POD). Gezeigte Gruppen umfassen Isograft, Allografts ohne Behandlung, Rapamycin und FK506 Immunsuppressiva. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die sensorische Nervenregeneration wird in (A) Hargreaves gezeigt, die jeweils transplantierte Tiere an sechs postoperativen Zeitpunkten testen, und in (B) noch Aufnahmen von Laufbandtests mit DigiGait. (i) Repräsentative Bilder werden mit (ii) jeweiligen Pfotendaten angezeigt. Entsprechende farbkodierte Bilder von Pfoten sind auch in 0,025 ms Rahmen. Digigate-Modelle (iii) werden ebenfalls angezeigt. Die Signifikanz wurde mit einer einwegigen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest eines Bonferroni und SEM bestimmt, wobei n=7 und p< 0,05. Diese speziellen DigiGait-Daten stammen von einem isogenen Tier, das am postoperativen Tag 28 getestet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Die Gliedmaßentransplantation unter der breiteren Kategorie der vaskulären Komponente Allotransplantation (VCA) hat ein weitgehend anwendbares therapeutisches Versprechen, das noch nicht erfüllt ist. Die Haupthindernisse liegen in ungelösten immunologischen Fragen, die einzigartig für VCA und neuromotorische Erholungstechniken sind, die derzeit verwendet werden. Die Entwicklung neuer Techniken hängt von der Entwicklung von Tieren ab, die flexibel, robust und reproduzierbar sind.
Viele Tiermodelle wurden in VCA etabliert, jedes mit spezifischen Vorteilen4. Nichtmenschliche Primatenmodelle bieten eine attraktive Umsetzbarkeit für menschliche Patienten, wurden jedoch durch Kostenbedenken und toxische Immunsuppressionswerte behindert4. Canine Modelle wurden als vorteilhaft für spezifische Ähnlichkeiten der Muskelstruktur als Menschen sowie ein erfahreneres Immunsystem19,20angesehen. Schweinemodelle bieten die Vorteile eines großen Tiermodells, bei dem das Immunsystem immer gut untersucht wird21,22. Maus-Modellsysteme präsentieren die fortschrittlichsten Techniken, um Immunologie zu studieren, aber trotz wichtiger Fortschritte in der gemanschettenen vaskulären mikrochirurgischen Anastomose23,Maus Gliedmaßentransplantation bleibt technisch anspruchsvoll und hat einige Einschränkungen in der funktionellen Erholung Bewertung5,24,25,26.
Rattenmodelle in VCA wurden seit 1978verwendet 3, bietet eine ausgereifte Plattform, um sowohl immunologische und neuromotorische Hypothesen zu untersuchen6,9,13,14,17,27,28,38. Das Modell vereint hier die Vorteile des orthotopischen Ansatzes von hindlimb, Der Nahtanastomose, der Nervenreapproximation und dem Potenzial für die Ganganalyse. Hindlimb orthotop im Gegensatz zu VorderbeinTransplantation ist weniger eine Belastung für die Ratte während des Genesungsprozesses und ermöglicht eine kontinuierliche normale Pflege und Fütterung Verhalten postoperativ. Suture Anastomosis, obwohl sorgfältig kann möglicherweise weniger technische Verwirrung für Langzeitstudien bieten. Die Nervenreapproximation ermöglicht zukünftige Untersuchungen17,,18 und Ganganalyse. Dieses Protokoll stützt sich auf sorgfältige, bewährte mikrochirurgische Techniken, die an anderer Stelle gut beschrieben sind29, was ständige Aufmerksamkeit erfordert, um die unmittelbaren Fallstricke der Anästhesieüberdosierung, anastomottisches Versagen, anastomottische Thrombose und übermäßigen chirurgischen Blutverlust zu vermeiden. Obwohl mehrere Mikrochirurgen den Arbeitsablauf verbessern können, haben wir eine Methode beschrieben, mit der ein einzelner operativer Mikrochirurg eine ausreichende experimentelle Leistung erzielen kann.
Autotomie oder Selbstverstümmelung ist ein Phänomen in mehreren mikrochirurgischen Modellen festgestellt, und es wurde vermutet, umgekehrt mit Nervenheilungkorrelieren 30,31. Die Autotomie wurde in diesem Modell insgesamt gesteuert, möglicherweise im Zusammenhang mit akribischer neuronaler anastomotischer Technik. Die Autotomie ging auch weiter in die Lernkurve zurück. Bitter Safe Mist war ein wertvoller Zusatz zur Kontrolle dieses Phänomens.
Die Gait-Analyse bei Ratten wurde für mehrere Modelle der Verletzung32,33,34, am relevantesten für Ischiasnerv-Verletzung35,36untersucht. Ratten auch wenn nicht Gliedmaßen Transplantation Empfänger sind bekannt, heterogene Themen für Ganganalyse zu sein, und Die Forscher immer noch diskutieren, welche Analyseparameter die Erholung beschreiben37. In diesem Modell haben wir mehrere Methoden beschrieben, um die besten Daten von transplantierten Empfängern zu erhalten, die bereit und in der Lage sind zu gehen. Die Vorauswahl geeigneter Wanderer war keine Prognose für die postoperative Zusammenarbeit. Obwohl sich die Tiere schon mehrere Stunden nach der Operation in ihrem Gehäuse bewegen können, sind sie erst vier bis sechs Wochen nach der Operation für die Ambulation des Laufbandes bereit.
Die Fähigkeit eines Protokolls, die Nervenrückgewinnung in VCA zu messen, hängt von seiner Rehabilitationsstrategie ab. Dieses Protokoll fördert ausdrücklich Transplantationsempfänger, die mit anderen Ratten interagieren, als Anreiz zum Funktionieren. Diese Strategie ist sich der Bedeutung der Modellierung der Rehabilitation bewusst, ist aber einfach, wirtschaftlich und weitgehend Standard. Zukünftige Strategien können eine aktivere Rehabilitation wie die Ausbildung auf dem Laufband umfassen.
Die für dieses Modell anwendbaren immunologischen Techniken gehen über den Rahmen dieser Diskussion hinaus, aber insbesondere der Vergleich von Isotransplantat en to allotransplantierten Tieren bietet eine nützliche Kontrolle, um allograft-immunologische Phänomene und Abstoßung von der ischämischen Reperfusionsverletzung, Entzündung, Revaskularisation und postoperativen Infektionsprozessen zu unterscheiden, die der Transplantationschirurgie selbst innewohnen. Isotransplantate bieten eine ähnliche Kontrolle für Nervenfunktionsstudien aus dem gleichen Grund.
Mit dieser Plattform, Forscher können sowohl VCA Immunologie und neuromotorische Erholung voran.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Frankel Foundation und dem Northwestern Memorial Hospital McCormick Grant (Operation RESTORE) finanziert. Die in dieser Publikation berichtete Forschung wurde vom National Institute of General Medicial Sciences der National Institutes of Health unter der Award-Nummer T32GM008152 unterstützt. Diese Arbeit wurde vom Northwestern University Microsurgery Core and Behavioral Phenotyping Core unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia machine | Vet Equip | 911103 | |
| 0.5cc syringe | Exel | 26018 | |
| 18-gauge needle | BD | 305196 | |
| 1cc syringe | BD | 309659 | |
| 22-gauge needle | BD | 305156 | |
| 24-gauge angiocatheter | Sur-Vet | SROX2419V | |
| 25-gauge needle | Exel | 26403 | |
| 3 cc syringe | BD | 309657 | |
| 5cc syringe | Exel | 26230 | |
| Alcohol | Fisher Scientific | HC-600-1GAL | |
| Anesthesia induction chamber | Vet Equip | 941443 | |
| Anesthetic gas scavenger system | Vet Equip | 931401 | |
| Bipolar electrocautery | Aura | 26-500 | |
| Bitter Spray Mist | Henry Schein | 5553 | |
| Bone wax | CP Medical | CPB31A | |
| Breathing circuit | Vet Equip | 921413 | |
| Buprenophine | Reckitt Benckiser | 12496075705 | |
| Castro-Viejos needle drivers | Roboz | RS-6416 | |
| Cordless rotary saw | Dremel | 8050-N/18 | |
| Cotton swab stick | Fisher Scientific | 23-400-101 | For hemostasis |
| DigiGait Appparatus and Software | Mouse Specifics | MSI-DIG, DIG-SOFT | |
| Dumont forceps (#4) | Roboz | RS-4972 | |
| Dumont forceps (#5) | Roboz | RS-5035 | |
| Enrofloxacin | Norbrook | ANADA 200-495 | |
| FK-506 | Astellas | 301601 | |
| Gauze | Kendall | 1903 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gloves | Microflex | DGP-350-M | |
| Hair clippers | Oster | 078005-010-003 | |
| Handheld monopolar electrocautery | Bovie | AA00 | |
| Hargreaves Apparatus | Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy | 37370 | |
| Heating pad | Walgreens | 126987 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | 42592K | |
| Hot plate | Corning | PC-351 | For warming resusscitation fluid |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Lactated ringers | Baxter | 2B2074 | |
| Large petri dish | Fisher Scientific | FB0875713 | For donor graft while in chilled saline |
| Meloxicam | Henry Schein | 49755 | |
| micro Collin Hartmann retractor | |||
| Micro dissecting scissors | Roboz | RS-5841 | |
| Microfibrillar collagen powder | BD | 1010590 | For hemostasis |
| Microvascular clips | Roboz | RS-5420 | |
| Normal saline | Baxter | 2F7124 | |
| Opthalmic lube | Dechra | IS4398 | |
| Rapmycin | MedChem Express | HY-10219 | |
| Small petri dish | Fisher Scientific | FB0875713A | For warmed resusscitation fluid |
| Sterile drapes | ProAdvantage | N207100 | |
| Surgical gown | Cardinal Health | 9511 | |
| Surgical mask | 3M | 1805 | |
| Surgical microscope, optic model OPMIMD | Zeiss | 169756 | |
| Surgical microscope, Universal S3 | Zeiss | 243188 | |
| Suture 10-0 nylon | Covidien | N2512 | |
| Suture 5-0 vicryl | Ethicon | J213H | |
| Suture 7-0 silk tie | Teleflex | 103-S | |
| Tape | 3M | 1530-1 | |
| Ultrasonic instrument cleaner | Roboz | RS-9911 | |
| Vessel dilation forceps | Roboz | RS-5047 |
References
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