Hyperspektrala imaging som ett verktyg för att studera optisk anisotropi i Lanthanide-baserade molekylära enstaka kristaller

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att erhålla självlysande hyperspektrala bilddata och för att analysera optiska anisotropi funktioner i lanthanide-baserade enstaka kristaller med hjälp av en Hyperspectral Imaging System.

Abstract

I detta arbete beskriver vi ett protokoll för en ny tillämpning av hyperspektrala imaging (HSI) i analysen av självlysande lanthanide (Ln^{3 +})-baserade molekylära enstaka kristaller. Som representativt exempel valde vi en enda kristall av heterodinuklear Ln-baserade komplex [TbEu(bpm) (tfaa)₆] (bpm =2,2'-bipyrimidin, tfaa^– =1,1,1-trifluoroacetylacetonate) uppvisar ljusa utsläpp under UV-excitation. HSI är en framväxande teknik som kombinerar 2-dimensionell rumslig avbildning av en självlysande struktur med spektralinformation från varje pixel i den erhållna bilden. Närmare bestämt gav HSI på enstaka kristaller av [Tb-Eu] komplexa lokal spektralinformation avtäckningen variation av luminescensintensiteten vid olika tidpunkter längs de studerade kristallerna. Dessa ändringar tillskrivades till den optiska anisotropin som var närvarande i kristallen, som resulterar från den olika molekylära emballagen av Ln³⁺ joner i varje av riktningarna av kristallen strukturerar. HSI häri beskrivs är ett exempel på lämpligheten av sådan teknik för spektro-rumsliga undersökningar av molekylära material. Men, viktigt, detta protokoll kan lätt förlängas för andra typer av självlysande material (såsom mikron-stora molekylära kristaller, oorganiska mikropartiklar, nanopartiklar i biologiska vävnader, eller märkta celler, bland annat), vilket öppnar många möjligheter för djupare undersökning av struktur-egendom relationer. I slutändan kommer sådana undersökningar att ge kunskap som ska utnyttjas i konstruktionen av avancerade material för ett brett spektrum av tillämpningar, från bioimaging till tekniska tillämpningar, såsom vågledare eller optoelektroniska enheter.

Introduction

Hyperspectral Imaging (HSI) är en teknik som genererar en rumslig karta där varje x-y-koordinat innehåller en spektralinformation som kan baseras på alla typer av spektroskopi, nämligen fotoluminescens, absorption och spridning av spektroskopier^1,2,3. Som ett resultat erhålls en 3-dimensionell uppsättning data (även kallad "hyperspektrala kub") där x-y-koordinaterna är de rumsliga axlarna och z-koordinaten är den spektrala informationen från det analyserade provet. z Därför innehåller hyperspektrala kuben både rumslig och spektral information, vilket ger en mer detaljerad spektroskopi undersökning av provet än traditionell spektroskopi. Medan HSI har varit känt i flera år inom fjärranalys (t.ex. geologi, livsmedelsindustri^4),framträdde det nyligen som en innovativ teknik för karakterisering av nanomaterial., ^2,,5 eller sonder för biomedicinska tillämpningar^3,,6,7,8. Generellt sett är det inte begränsat till UV / synlig / nära infraröd (NIR) domän, men kan också utökas med hjälp av andra strålkällor, såsom röntgenstrålar - till exempel för att karakterisera elementär distribution i olika material⁹ - eller Terahertz strålning, där HSI användes för att utföra termisk avkänning i biologiska vävnader⁸. Vidare har fotoluminiscenskartläggning kombinerats med Raman-kartläggning för att undersöka de optiska egenskaperna hos monolayer MoS₂¹⁰. Bland de rapporterade tillämpningarna av optisk hsi finns det dock fortfarande bara ett fåtal exempel på HSI för lanthanidbaserade material^{11,,12,13,,14,,15,16,17}. Till exempel kan vi citera: upptäckt av cancer i vävnader⁶, analys av ljuspenetrationsdjupet i biologiska vävnader⁷, multiplex biologisk avbildning³, analys av multikomponentenergiöverföring i hybridsystem¹¹, och undersökning av aggregering-inducerad förändringar i spektroskopiska egenskaper upconverting nanopartiklar¹². Det är tydligt att HSI:s attraktionskraft beror på dess lämplighet att generera kunskap om miljöspecifik luminescens, vilket ger samtidig rumslig och spektral information om sonden.

Dra nytta av denna kraftfulla teknik vi häri beskriva ett protokoll för att undersöka den optiska anisotropin av heterodinuklear Tb^{3 +}-Eu^{3 +} enda kristall [TbEu (bpm) (tfaa)₆] (Figur 1a)¹³. Den optiska anisotropi som observerades berodde på de olika molekylära förpackning av Ln^{3 +} joner i de olika kristallografiska riktningar (figur 1b), vilket resulterar i vissa kristall ansikten visar ljusare, andra visar dimmer photolumineescence. Det föreslogs att den ökade luminescensintensiteten vid kristallens specifika ansikten korrelerades med effektivare energiöverföring längs de kristallografiska riktningar där Ln³⁺··· Ln^{3 +} jon avstånd var den kortaste¹³.

Motiveras av dessa resultat, föreslår vi inrättandet av en detaljerad metod för att analysera optisk anisotropi genom HSI, vilket öppnar vägen för bättre förståelse av jon-jon energiöverföring processer och avstämbara självlysande egenskaper som härrör från specifika molekylära arrangemang^18,19. Dessa struktur-egenskaper relationer har erkänts som viktiga aspekter för innovativa optiska material design inklusive, men inte begränsat till waveguide system och opto-magnetiska lagringsenheter på nano och mikroskala - ta itu med efterfrågan på effektivare och miniatyriserade optiska system²⁰.

Protocol

VARNING: Det rekommenderas att använda skyddsglasögon som är specifika för den excitationsvåglängd som används hela tiden när bildapparaten används.

1. Konfiguration av hyperspektralt mikroskop

OBS: En översikt över det hyperspektrala bildsystemet ges i figur 2a, med de viktigaste komponenterna i bildapparaten som beskrivs. Bildsystemet kan användas för att detektera det synliga eller nära infraröda (NIR) utsläppet från ett prov. Beroende på vilken detektering som önskas (synlig eller NIR) går ljuset genom två olika ljusvägar (bild 2e). En kombination av olika strålesvarvningskuber och dikrofilterkuber (optiska kuber) måste placeras på specifika positioner i instrumentet för att välja respektive bana.

1. Slå på datorn som är ansluten till bildsystemet. Slå på datorns bildskärm.
2. Ställ in lämplig optisk kubkonfiguration (bild 2b,c).
   OBS: Här beskrivs imagerkonfigurationen(optisk kubkonfiguration)för HSI-mappning med UV-excitation och synlige utsläppsdetektering. Det är dock också möjligt att ändra den för NIR-excitation och synlig eller NIR-utsläppsdetektering, beroende på det analyserade provet. Se avsnittet Representativa resultat i ett exempel.
   1. Från mikroskopstadiet (1 i figur 2a)och efter utsläppsstrålens väg mot detektorerna (3 i figur 2a)lämnar du den första positionen för en optisk kub (4 i figur 2b)ledig och placera den optiska kuben för konfokalmikroskop (DFM1-P01) i det läge som anges som 5 i figur 2b,så att utsläppen från provet riktas genom den synliga ljusvägen.
   2. Om du tittar längs den optiska vägen mot detektorn placerar du den synliga optiska kuben (CM1-P01), som innehåller dikrospegeln och filtren för att rikta det synliga utsläppet till detektionsvägarna, i det läge som anges som 6 i figur 2b.
   3. Om du fortsätter vägen mot detektorn placerar du den optiska kuben för konfialt hål (DFM1-P01) i det läge som anges som 7 i figur 2b för att rikta ljuset genom den synliga ljusdetekteringsbanan. Placera sedan den optiska kuben för konfialspektrometern (DFM1-P01) i läge 8 i figur 2c så att det avgivna ljuset når detektorn.
   4. För HSI-mappningen ska du manuellt styra detektorns slitöppning (9 i figur 2c)för att matcha med storleken på de hål som används (cirka 50 mm är optimal).
   5. I PHySpec-programvaran väljer du hålhålets bländare (5 i figur 3).
      OBS: Ju mindre hål bländare, desto bättre är HSI-upplösning, på bekostnad av signalintensitet.
3. Slå på bredbandslampan(bild 2d, infälld) genom att placera brytaren (10 i bild 2d)i PÅ-läget. För att styra intensiteten av magnetiseringslampan, vrid vredet indikeras med 11(figur 2d) till högre (32 – lägsta intensitet) eller lägre värden (1 – högsta intensitet). Håll bredbandslyktansens slutare (12 i bild 2d)stängd under upplägget.
   OBS: De högre värdena motsvarar högre dämpning av den effekttäthet som lampan avger, medan lägre värden motsvarar lägre dämpning.
4. Slå på följande maskinvara i den ordning som anges nedan genom att ställa in deras växlar i PÅ-läge:
   1. Slå på ThorLabs rörelsekänsliga handkontroll.
   2. Slå på Nikons strömkälla.
   3. Slå på ASI-styrenheten.
   4. Slå på Galvo-handkontrollen.
   5. Slå på ProEm-detektorn.
   6. Slå på Bayspec-detektorn.
5. Öppna PHySpec-programvaran på datorn genom att dubbelklicka på ikonen.
   1. Tryck på F8 på tangentbordet för att initiera IMA Upconversion-systemet och klicka på OK-knappen i fönstret Anslut till systemet.
      STEG 1.5.1. kan också utföras genom att klicka på fliken System och sedan klicka på Anslut för att komma fram till fönstret Anslut till systemet. Sedan kan OK-knappen klickas för att ansluta bildsystemet till programvaran.
   2. Se till att alla menyer visas på gränssnittet (Färgkamera, ProEm och Bayspec) samt instrumentets kontrollpanel, till vänster på skärmen, som visas i figur 3.

2. Hyperspektral avbildning av en [TbEu(bpm)(tfaa)₆] en kristall

1. För att förbereda provet, placera kristallen på en mikroskopi glasskiva. Om det behövs för att använda högre förstoring, täck kristallen med ett tunt täckglas och säkra den med tejp, så att provet kan placeras med det tunna täckglaset vänt mot objektivet.
2. Placera den glasrutschbana på vilken provet har beretts på mikroskopstadiet och fäst den med metallarmarna (figur 4a,b).
3. Flytta provet med hjälp av joysticken(bild 4c)på ASI-styrenheten för att placera provet över de mål som används.
4. Placera den högra filterkuben manuellt i hjulet under målen (3 i figur 5) för att välja lampans UV-excitation och låta det synliga utsläppet passeras mot detektorn.
   OBS: Ytterligare filterkuber finns tillgängliga för användning av antingen grön eller blå ljus excitation, vilket innebär att rätt filterkub på plats är viktigt för lämplig excitationvåglängd.
5. Placera 20X-målet manuellt (indikerat av 5 i figur 5) under provet och tryck på den vita knappen (6 i figur 5) på mikroskopets vänstra sida för att tända det vita ljuset.
   1. Justera ljusstyrkan genom att vrida vredet under den vita ljusströmbrytaren (7 i bild 5).
6. I PHySpec-programvaran trycker du på knappen Spela upp (video) på färgkamerafönstret, vilket kommer att orsaka förvärv av en live-skanning.
   1. Om färgkamerafönstret visar en svart bild ökar du exponeringstiden (2 i bild 3)och/eller förstärkningsvärdet (3 i bild 3) som finns på instrumentkontrollpanelen under fliken Färgkamera. Om bilden som visas är för ljus minskar du exponeringstiden och/eller förstärkningsvärdet.
   2. Se till att den främre ratten på mikroskopets högra sida (2 i figur 5) är inställd på R för att skicka 20 % av signalen till kameran/kikaren och 80 % av signalen till detektorn.
7. Fokusera på provet genom att justera avståndet mellan målet och scenen (figur 4b). Detta görs genom att vrida på rattarna som visas i bild 4d på mikroskopets högra sida.
   OBS: Den större ratten används för grova justeringar, medan den mindre ratten är för mer känsliga och små fokusförändringar.
8. Se till att det manuellt valda målet också väljs på programvaran. Klicka först på knappen Visa i den övre menyraden och klicka sedan på ett Visa/dölj skalfält för att visa skalfältet på bilden (1 i bild 3). Gå sedan till fliken Galvanometer i instruktionskontrollpanelen och välj det mål som används (4 i figur 3). Kontrollera att det visade skalfältet är korrekt genom att välja rätt mål i programvaran.
9. I programvaran väljer du lämplig detektor genom att gå till fliken Diverter (ProEM – 6 i figur 3) och galler genom att gå till fliken Filter (1200 gr/mm vid ProEM – 7 i figur 3) under fliken SpectraPro SP-2300 .
10. Öppna bredbandslyktansen (12 i figur 2) så att UV-excitationen av provet kan ske. Vrid intensitetsratten (11 i bild 2d) till önskat läge (t.ex. 8 – mellanintensitet) för att kontrollera intensiteten hos bredbandslampans (UV)-excitation.
    1. Om du vill välja mellan bred fältbelysning (öppen bländare) eller en mindre punktbelysning (mer sluten bländare) styr du storleken på UV-lampfältets bländare med hjälp av spaken och rattarna som visas i bild 4 i figur 5.
11. Under fliken SpectraPro SP-2300 väljer du en våglängd för att observera provemissionen.
12. Om utsläppsvåglängderna för provet är okända, förvärva ett utsläppsspektrum.
    1. I sequencer klickar du på +-tecknet för att lägga till en ny sekvens ("nod") för förvärv av ett utsläppsspektrum.
       1. Klicka på Spektrometer och sedan Spectrum Acquisition (med spektralskanning).
       2. Mata in en minsta våglängd (dvs. 400 nm) och en maximal våglängd (dvs. 700 nm) och klicka på OK för att ställa in det spektralområde där spektrumet ska registreras.
       3. Välj lämplig exponeringstid i programvarans vänstra sida. Välj kortare tider (t.ex. 0,1 s) för mycket ljusa prover och längre tider (t.ex. 2 s) för dimsändare.
       4. Justera magnetiseringseffekten vid bredbandslampans (UV) excitation (se steg 1.3 ovan).
          OBS: Vid NIR diod excitation, kan den justeras från neutral densitet rullgardinsmenyn på vänster sida av PHySpec programvara.
    2. På sequencer, klicka på dubbelspelsknappen för att köra hela sekvensen. När spektrumet har visats, notera de regioner som är av intresse för detektion av provutsläppet(t.ex. 580 till 640 nm vid prover från Tb³⁺- och Eu^3+).
    3. Vid behov, optimera signaldetektering genom att antingen ändra fokus för provet eller genom att justera exponeringstiden i PHySpec-programvaran. Uppnå ytterligare optimering av signaldetektering genom att öka provets utsläppsintensitet genom att ändra kraften hos excitationskällan (bredbandslampan), enligt beskrivningen ovan.
13. Justera exponeringstiden (t.ex. 0,5 s – 2 i bild 3) och gain (3 i figur 3)i färgkameran därefter, för att få en bild av god kvalitet. Om det behövs lägger du till skalfältet i bilden genom att klicka på knappen Visa/dölj skalstrecket på den andra raden på menyn högst upp i PHySpec-programfönstret.
14. Rekommendation: Innan hyperspektral kuben förvärvas, registrera en optisk bild av kristallen i vitt ljus(figur 6a)och/eller UV full (figur 6b) eller begränsad(figur 6c)belysning (UV-belysning som styrs av slutaröppningen, visas som 4 i figur 5). För att göra det, med provet i fokus, klicka på uppspelningsknappen på färgkameran.
15. Klicka på Arkiv och sedan Exportera fönstervy, välj önskat format för att exportera den erhållna bilden och spara filen med önskat tillägg (.h5, . JPEG).
16. Innan du hämtar den hyperspektrala bilden, stäng av den vita ljusbelysningen samt rumslampan.
17. Skriv en ny sekvens för att hämta hyperspektral kuben. Därför, i sequencer, klicka på + tecknet för att lägga till en ny nod.
    1. Klicka på Confocal Imager.
       1. Klicka på Multi-Spectrum Förvärv. Här definieras önskat synfält av antalet poäng att hämta i x- och y-riktningarna och stegstorleken. Använd till exempel 100 punkter i x och 100 punkter i y med en stegstorlek på 5 μm för att få en bild på 500 x 500 μm.
          Obs: Det totala antalet förvärvspoäng och integrationstiden vid varje punkt kommer direkt att påverka den totala förvärvstiden för hyperspektrala kuben.
          1. Mata in önskat X-läge (t.ex. 100) och Y-läge (t.ex. 100) räknas samt önskad stegstorlek (t.ex. 5 μm). Välj alternativet Maskinvara för kamerasynkronisering för synlig utsläppsmappning (och programvarualternativ vid NIR-detektering). Klicka på OK.
18. I sequencer klickar du på den nyligen tillagda multispektrumförvärvraden för att markera noden.
19. Klicka på knappen Spela upp om du vill köra den markerade noden.
    OBS: Den återstående tiden som förvärvet kommer att ta visas bredvid noden (i minuter, t.ex., 28 min).
20. När förvärvet är klart sparar du hyperspektralkuben i lämpligt filformat (.h5).

3. Hyperspektrala dataanalys

1. Direkt efter förvärvet, om den sparade hyperspektrala kuben inte öppnas automatiskt i programvaran, återställa hyperspektrat kuben, som sparades som .h5-fil, genom att klicka på Arkiv i den övre menyraden och sedan hovra markören och klicka på Open File.... När fönstret med titeln Välj data (s) för att öppna dyker upp, välj den mapp där .h5-filen sparas och dubbelklicka på filen för att öppna den.
2. När hyperspektrala kubfilen har importerats ändrar du den hyperspektrala kubbilden så att intensiteten hos en viss spektralvåglängd flyttas genom att flytta stapeln högst upp på kubbilden till vänster (nedre våglängden, t.ex. 580 nm) eller höger (högre våglängd, t.ex. 638 nm).
   Obs! Figure 7
3. Efter att ha valt den våglängd som är av intresse för analysen (t.ex.den maximala intensiteten, som när det gäller [TbEu(bpm)(tfaa)₆] är 613,26 nm), gör en (eller alla) av de tre möjliga typerna av spektralanalys: (A) den spektrala fördelningen i form av en bild (2 i figur 7), B) En utsläppsintensitetsprofil i en region av intresse (3 i diagram 7). C Utvinning av ett spektrum vid en viss punkt eller region av intresse (4 i figur 7).
   1. Om det finns spektralfördelning från en bild använder du funktionen Beskär och lagerplats för att öka signal-brus-förhållandet i bilden. För att göra det klickar du på den övre menyn Bearbetning och väljer sedan Data och sedan alternativet Beskär och lagerplats.
   2. För en profil för utsläppsintensitet högerklickar du på kubbilden och väljer profilen Skapa mål eller Skapa X eller Skapa Y beroende på om endast en punkt (Mål - 5 och 6 i figur 7) eller en rad (Profil - 7 och 8 i figur 7) behöver analyseras. Markera analysområdet genom att dra målet, den vågräta eller den lodräta linjeprofilen med markören och flytta den över kuben.
      1. När profilen har valts korrekt högerklickar du på regionen och väljer Lägg till mål i diagram. Välj alternativet att skapa ett nytt diagram för att visa utsläppsintensiteten(y-axeln) som en funktion av målets fysiska position (x-axeln). Spektrumet visas i det nya diagrammet som infogades (6 och 7 i figur 7).
         Obs! Figure 7
   3. Alternativt kan du erhålla ett utsläppsspektrum av ett visst område i provet (9 i figur 7). Till att börja med, hovra markören över kubbilden och högerklicka. Klicka på alternativen Rektangelmarkering eller Ellipsmarkering på fliken som visas.
      1. Rita markeringsformen (t.ex. en rektangel) över önskat område genom att klicka och dra markören över kuben. När området har valts korrekt högerklickar du på området och väljer Lägg till markering i diagram.
      2. I fönstret Lägg till i diagramväljer du Skapa ett nytt diagram för att visa målets utsättningsspektra och klickar på OK.
         OBS: En ny färgad linje (8 i figur 7) visas i diagrammet där målemissionen visas, med utsläppsintensiteten som y-axeln och våglängden vid x-axeln. Detta spektrum motsvarar den genomsnittliga intensiteten i det valda området för varje våglängd.
4. När spektrumet har hämtats sparar du det innan du väljer en ny region eftersom endast en region kan väljas åt gången. Om du vill göra det markerar du fönstret där diagrammet innehåller. På Arkiv-menyn väljer du Spara som och väljer att spara diagrammet i den mapp som du väljer, med hjälp av namnet på valet, antingen i .h5-format, som kan öppnas i PHySpec-programvaran eller i CSV-format, som kan importeras i Excel.

Representative Results

För att illustrera konfigurationen av hyperspektralt mikroskop för datainsamlingen på en Ln-baserad, molekylär enda kristall (dvs. [TbEu(bpm)(tfaa)₆], figur 1a), visar figur 2 en översikt över systemet samt rätt placering av de optiska kuberna i installationen. Bild 3 visar en skärmdump av PHySpec-programvaran som innehåller de menyer som användes vid HSI-förvärvet. Figur 4 och figur 5 visar mikroskopstadiet mer i detalj, inklusive placeringen av den glasskiva som innehåller provet som ska analyseras. Den valda UV-belysningen tändes för att visa kristallens synliga röda luminiscens (figur 4a och 1 i figur 5). Figur 6a visar en ljus fältbild av kristallen som registrerats efter justering av provet i rätt fokus. Kristallens nålliknande morfologi kan tydligt ses. Figur 6b,c visar bilden av samma kristall under UV-excitation med antingen full utsikt(figur 6b)eller lokalt begränsad(figur 6c). Under den breda UV-belysningen syns omedelbart skillnaderna mellan utsläppsljusstyrkan från kristallens olika ansikten. Den begränsade belysningen kan användas som ett alternativ, främst för att undersöka eventuella effekter av energi eller ljusöverföring i kristallen, vilket kan utlösa vågledarliknande beteende. I detta fall detekteras ett starkt utsläpp i en punkt som inte direkt är under excitation. Detta tyder på att effektiv energimigration sker genom kristallen¹³ (5 och 6 i figur 7).

Från den förvärvade hyperspektrala kuben är det ytterligare möjligt att erhålla den spektrala fördelningen i form av en bild som representerar en specifik våglängd, intensitetsprofilen för en specifik utsläppsvåglängd, liksom utsläppsspektrat vid valfri pixel eller område av den förvärvade hyperspektrala kuben. Som ett exempel visar utsläppsspektra som anges i figur 7 (panel 4) de mest karakteristiska utsläppsbanden i Eu³⁺ jonen: det band som observerats vid 590 nm tilldelas den magnetiska dipolen (MD) ⁵D₀→⁷F₁ övergång av Eu^{3 +}, medan utsläppstopparna i regionen från 610 till 630 nm härrör från den överkänsliga forcerade elektriska dipolen (ED) ⁵D₀→⁷F₂ Eu^{3 +} övergång. Förhållandet mellan den integrerade intensiteten i dessa två övergångar är väl känt för att vara en utmärkt sond av den kemiska miljön runt Ln^{3 +} jon i strukturen av den enda kristall^21:ju lägre symmetri runt Ln^{3 +} jon, desto större är ED / MD förhållandet. Detta gör det möjligt att dra slutsatser om symmetri karaktär av den kemiska miljön i Ln^{3 +} jon. Dessutom kan Stark uppdelning av ⁵D₀→⁷F₂ övergången också korreleras med symmetri runt Ln^{3 +} i sin kristallografiska miljö - ju lägre symmetri, desto högre är antalet Stark undernivåer. När det gäller den nålliknande polymorftalet kristalliserade i det lågsymmetriska kristallsystemet delas ^{övergången 5}D₀→⁷F₂ upp i fyra subtoppar (spektra visas i figur 7, panel 4). En sådan analys är särskilt tilltalande när man jämför de optiska egenskaperna hos flera polymorf av en självlysande kristall. Vi har tidigare visat att informationen om den kemiska miljön som härleds från den optiska analysen korrelerade väl med den molekylära kristallstruktur som erhållits genom en kristallröntgenanalys¹³. Dessutom kan den spektrala profilen längs de olika kristallytorna som visas i figur 7 (panel 3), som indikerar ljusare utsläpp vid spetsen och sidoytorna, också korreleras med Ln³⁺··· Ln^{3 +} jon avstånd i de tre rumsliga riktningar (Figur 1b): tätare Ln^{3 +} packning längs axlarna vinkelrätt mot spetsen och sidoytor, respektive, gynna jon-jon energiöverföring. Därför observeras utsläppsförbättring vid respektive ansikten, alltså optisk anisotropi.

På det hela taget utgör de olika alternativen för dataanalys, som visas i figur 7 och figur 8,de viktigaste inslagen i den kombinerade spektroskopiska och rumsliga informationen, som kan undersökas genom HSI-analys av självlysande prover.

Figur 1: Molekylstruktur och kristallografiska arrangemang. (a)Den heterodinukleära Ln-baserade komplexets struktur [TbEu(bpm)(tfaa)₆], där Ln₁ och Ln₂ är Tb³⁺ och Eu³⁺ joner. Störda grupper och väteatomer utelämnas för tydlighetens skull. Färgkod: Eu: mörk cyan; C: grå; O: röd; N: blå; F: limegrön. b)Återgivning av den molekylära förpackningen i kristallen: i) överst vyn och ii) spetsvy av den nålliknande enkristallen struktur med utvalda inmolekylära och intramolekylära Ln··· På avstånd (tfaa-underenheter och väteatomer utelämnas för tydlighetens skull). iii) Kristallförpackningsarrangemanget för [TbEu(bmp)(tfaa)₆] dimers (väteatomer utelämnas för tydlighetens skull). (iv) Diagram över kristalltillväxtens ansikten hos dimer som avslöjar den kortaste Ln··· I avstånden i (0 1 0) och (2 -1 1) kristallografiska riktningar. Siffran har ändrats från referens 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 2: Översikt över hyperspektralt bildsystem. Visas är den konfiguration som krävs för luminescenskartläggning i det synliga spektrala området med HJÄLP AV UV-excitation. a)Allmän bild av systemet, där 1 är mikroskopstadiet, 2 är den sektion som innehåller den optiska konfigurationen och 3 är spektrometern med synliga detektorer och NIR-detektorer. b)Öppen vy över den optiska uppställningen nära mikroskopstadiet (höger sida av a) som visar experimentets optiska konfiguration: optisk kubposition 4 förblir tom och konfiktmikroskopkuben cube placeras i läge 5 för att föra ljuset genom den synliga banan. Den synliga kuben placeras i läge 6 för att rikta det synliga ljuset till detektionsbanan, och konfikthålskuben placeras i läge 7 för att dirigera ljuset till den synliga detekteringsbanan. c)Öppen vy över den optiska uppställningen närmare detektorerna (vänster sida av a) som visar position 8,där konfiktpektrometerkuben cube är placerad för att reflektera ljus mot spektrometern och synlig kamera. Infälld 9 visar skruven för att justera öppningsbredden på spektrometersliten. d)Vy över mikroskopstadiet, dator- och bredbandslampan (används för UV-excitation) styrenhet. I infälld visas bredbandslampans styrenhet med mer detaljer: 10 är på/av-knappen, 11 är ratten för att styra lampans intensitet och 12 är avtryckaren. e)Schema som visar den optiska banan/NIR från mikroskopstadiet till detektorerna, inklusive de optiska kublägena från 4 till 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 3: Skärmdump av PHySpec programvara som visar menyn med de parametrar som ska justeras för HSI. 1 gör det möjligt att infoga skalfältet i färgkamerabilden; 2 och 3 gör det möjligt att kontrollera exponeringstiden och få värdet på färgkameran, respektive; rätt objektiva lins måste väljas i 4; 5 gör det möjligt att välja bländaren på hålet; 6 (Omkastare) och 7 (Filter) gör det möjligt att välja detektor och gallerduring, exponeringstiden för den synliga detektorn är inställd i 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: Allmän bild av mikroskopstadiet. a) Placering av glasbilden som innehåller provet i scenen, med UV-belysningen PÅ som visar provets röda luminiscens (liten röd prick i mitten av glasglaset). b)Syn på mikroskopstadiet med den vita ljusbelysningskondensorn ovanpå. c)Stegkontrollant som visar den joystick som styr scenens rörelse i de riktningar som indikeras av orange och gula pilar (visas även i a. d)Detaljerad vy över fokusknappen, som flyttar scenen i de riktningar som indikeras av den röda pilen (visas också i (b)). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5: Komponenterna i mikroskopstadiet. 1 mikroskopsteg med provet på glasglaset placerat på provscenen ovanpå objektiven. 2 hjul för att justera fokus (stort hjul) och för att rikta den avfångade utsläppet (litet hjul) antingen bara till detektorn (L), delvis till detektorn och delvis till kameran (R), eller enbart till binokulärlinser (öga); 3 excitations-/utsläppsfilter hjul som används för att välja excitation våglängdsområdet. Detaljen till höger visar filterkuben som håller i UV-filtret och långpassningsfiltret som används i detta experiment. 4 i toppen / botten visar rattarna för att flytta excitation balken genom provet, medan i mellan, det cirkulära fältet bländare kontroll; 5 objektiv; 6 PÅ/AV-knappen för den vita ljusbelysningen; 7 ratten för att justera ljusstyrkan på den vita ljuslampan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6: Optiska mikroskopibilder av den analyserade enkristallen. Dessa bilder erhölls under(a)vit ljusbelysning, (b) full-view UV-belysning, med hjälp av excitation cirkulär bländare helt öppen, och (c) lokalt begränsad UV-belysning (präglad av den vita cirkeln), med hjälp av en närmare excitation cirkulär bländare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Bild 7: Skärmdump av PHySpec programvara som visar hyperspektrala kub dataanalysprocessen. Olika spektralanalysmetoder kan tillämpas på den förvärvade hyperspektrala kuben: 1 visar våglängden som valdes för den spektrala bildfördelning som visas i 2; 3 visar de horisontella intensitetsprofilerna på 613,26 nm (7) och vertikala (8). 4 visar utsläppsspektra som utvinns ur målen 5 och 6 samt från det område som lyfts fram i 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 8: Alternativ tillämpning av HSI-sondering av synergin mellan uppkonverterande nanopartiklar och lanthanidkomplex. Det här exemplet visar hyperspektrala analys av ett hybridsystem bestående av molekylära kristaller ([Tb₂(bpm)(tfaa)₆]) i kombination med uppkonverterande nanopartiklar (NaGdF₄:Tm³⁺,Yb³⁺). (a)Fotomikrofotografer under vit- och UV-ljusbelysning tillsammans med det område av intresse (ROI) som används för hyperspektral avbildning under 980 nm ljusbestrålning. b)Tm³⁺ och indirekta Tb³⁺ utsläpp som övervakas över en yta på 20 x 20 μm². cVariationen i utsläppsbandens absoluta intensitet fluktuerade i hela hybridsystemet som tyder på vissa variationer i den totala mängden material som fördelas över ytan. d)Förhållandet mellan komplexets integrerade utsläpp kontra Tm³⁺: ¹G₄→³H_{6 (kvadrater)} och Tm³⁺: ¹G₄→³F₄ (cirklar) bekräftade den samtidiga närvaron av de två moietiesna i hela hybridsystemet och den homogena interaktionen mellan dem. Skala barer är 20 μm i fotomikrografer och 5 μm i ROIs och spektrala kartor. Fotomikrofotografer presenteras i riktiga färger. Figuren har ändrats från referens 11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Den hyperspektrala imaging protokoll här beskrivs ger en enkel metod som gör det möjligt att få spektroskopisk information på exakta platser i provet. Med den beskrivna installationen kan den rumsliga upplösningen(x- och y-mappning) nå ner till 0,5 μm medan spektralupplösningen kan vara 0,2 nm för mappningen inom det synliga området och 0,6 nm för NIR-området.

För att genomföra hyperspektrala kartläggning på en enda kristall följer provberedningen ett enkelt förfarande: kristallen kan helt enkelt placeras på en glasmikroskopirutschbana, täckt av ett täckglas efter behov. Fokusera provet med rätt objektiv och den ljusa fältbilden vid färgkamerauppsättningen i programvaran är ett mycket viktigt steg under föranalysstadiet för att få bäst lösta hyperspektrala bilder. Vanligtvis erhålls högre utsläppsintensiteter när provet är väl fokuserat. När detta är gjort, valet av parametrar för analysen såsom x och y räknas och stegstorleken kommer att diktera synfältet och rumslig provtagning, respektive av den erhållna hyperspektrala kuben. Målets numeriska bländare och excitations-/utsläppsvåglängderna dikterar dock den verkliga volymen av provet som undersöks vid varje förvärvspunkt. Till exempel, för det mål som används i denna studie, med numerisk bländare (NA) på 0,4, och med hjälp av excitation i UV-spektralområdet (390 nm), har den fokuserade laserpunkten en storlek på cirka 0,6 x 0,6 μm i x- och y-riktning. Laserplatsens storlek beräknades med hjälp av webbplatsen (https://www.microscopyu.com/tutorials/imageformation-airyna, som användes den 26 september 2019). Om den valda stegstorleken är större än den rumsliga provtagningen kan man faktiskt prova ett område som är mindre än det område som anges av stegstorleken. Om provet är homogent kan det hända att undersampling inte är ett problem. Men om rumsliga variationer i provet är viktiga att upptäcka, erhålls optimal provtagning med en stegstorlek inställd på halva laserstrålens storlek på provet. Den valda exponeringstiden och intensiteten hos den UV-valda belysningen kommer att styra intensiteten hos det erhållna spektra. Sådana parametrar varierar från prov till prov, beroende på utsläppsintensiteten och känsligheten för UV-excitationen.

Vid denna punkt kan de kritiska stegen i protokollet listas som: anpassningen av det optiska systemet, korrekt placering av de optiska kuberna, reglering av den cirkulära bländaren av excitation och detektor slits öppningar, val av hål, fokus för provet i färgkameran med rätt objektiva linser, intensiteten i bredbandslampan och korrekt val av långpass filterkuben (vilket möjliggör UV-excitation) , samt val av rätt stegstorlek och exponeringstid som nämnts ovan. Slutligen måste rumslamporna vara släckta under all tid av hyperspektrala kubförvärv.

Vid dålig signaldetektering antingen med färgkameran eller spektrometern bör felsökningen av tekniken omfatta noggrant kontroll av vart och ett av de kritiska stegen ovan, innan hyperspektralt kubförvärv påbörjas. Konfigurationen av utsignalen i mikroskopstadiet är också viktig. De tre möjliga konfigurationerna är: ögat (100 % av utsignalen skickas till mikroskopkarokulärfästet), L (100 % av utsignalen skickas till detektorerna) och R (80 % av utsignalen skickas till detektorerna och 20 % till mikroskopkarokulärfästet). Under hyperspektrala kubinsamlingen måste R- eller L-konfigurationen användas. Om alla ovanstående parametrar är korrekt valda kan stickupplöst rumslig och spektral information om provet erhållas.

Vissa möjliga ändringar av den beskrivna tekniken häri kan exemplifieras av hyperspektralavbildning av andra system, såsom självlysande mikropartiklar¹⁴ eller optiska hybridsystem som består av molekylära kristaller i kombination med uppkonverterande nanopartiklar (figur 8)¹¹. I dessa exempel användes NIR-laserdioden (980 nm) som excitationskälla och ersatte UV-excitation, samtidigt som den genererade synliga emissionen upptäcktes. I det senare exemplet på hybridsystemet avslöjade HSI homogeniteten hos hybridfilmer som kombinerar uppkonverterande nanopartiklar (NaGdF_4:Tm³⁺,Yb³⁺) och [Tb₂(bpm)(tfaa)₆] kristaller till ett multivåglängdsresponsivt isotropiskt system, som uppvisar energiöverföring mellan material och molekyler (figur 8)¹¹. Genom att använda InGaAs-detektorn i systemet blir det dessutom möjligt att upptäcka utsläpp i området NIR(1000–1700 nm). Detta är av särskilt intresse när man söker undersökning av NIR-baserade optiska sonder för biomedicinska tillämpningar³. I det här fallet måste systemets optiska kubkonfiguration (bild 2e) ställas in för NIR-sökvägen. Vid NIR-excitation-NIR-utsläpp blir en av begränsningarna i den hyperspektrala teknik som beskrivs här uppenbart: som våglängdsberoende är spektraxupplösningen i NIR-regionen lägrevs. än för den synliga detekteringen, dvs. För sub-1 μm-funktioner, t.ex.

Slutligen(oavsett vald HSI-konfiguration och våglängdsregim) kan datamanipulationen göras antingen med instrumentets programvara eller, som visas för de spektrala profilerna, exporteras för att analyseras i andra programvarupaket som Origin® eller Microsoft Excel. I vårt exempel avslöjades kristallens optiska anisotropi också snabbt vid färgkamerabilden, nämligen genom den starka intensitetsvariationen längs de olika kristallytorna. Under den breda UV-excitationen erhålls dessutom olika utsläppsintensiteter beroende på vilket ansikte som analyseras (figur 7). Möjligheten att erhålla utsläppsintensitetsprofilen på olika intressanta platser vid kristallen (målen i figur 7) gör det ytterligare möjligt att studera variationer i utsläppsintensiteten och, om sådana finns, även i spektralform. Den blockliknande polymorfningen för [TbEu(bpm)(tfaa)₆] utgör ett exempel där två kristallansikten uppvisade lika höga utsläppsintensiteter och en lägre utsläppsintensitet för den tredje¹³. I händelse av ett system utan anisotropi skulle utsläppsintensiteten vara densamma för alla kristaller.

Kompletterande metoder för att sondera optisk anisotropi är till exempel relaterade till förekomsten av polariserade utsläpp från ett prov. Dessa inkluderar polarisering minne eller spektroskopisk ellipsometry. Den första består i korrelationen mellan polariseringstillståndet för det ljus som avges av materialet med polariseringstillståndet för infallande magnetiseringsljuset,^22,23 medan den senare mäter förändringen i ljusets polariseringstillstånd efter att ha reflekterat snett av en tunn provfilm²⁴. Men en fördel med att använda hyperspektrala avbildning som ett verktyg för att sondera optisk anisotropi, som visas här, kommer med det faktum att förekomsten av polarisering inte är ett krav för provanalys. Dessutom kräver provberedningen inte tillverkning av tunna filmer, varken en mycket noggrann orientering av kristallen med avseende på händelsen och insamt ljus. Dessa aspekter gör tekniken med HSI potentiellt mer allmänt tillämplig. Dessutom visualiseras anisotropiska funktioner snabbt vid bildinsamling, och dataanalys är enkel (vilket exemplifieras ovan).

Med tanke på ett bredare tillämpningsområde kan HSI-teknikens betydelse tillskrivas dess unika egenskap för att kärna den optiska signalen med miljöberoende funktioner. Till exempel är en sådan anslutning nödvändig för att förbättra förståelsen av nano-bio interaktioner^3,15,16 inom det växande området nanomedicin eller ens för att förstå struktur-egenskaper relation i materialvetenskap^10,11,12,13. Som sådan kan framtida potentiella tillämpningar av den här beskrivna tekniken namnges som men inte begränsas till: analys av biologiska prover in vitro, ex vivo och in vivo utför kartläggning av molekyler av biologiskt intresse^4,,6, anpassning av mikroskopstadiet för att studera miljöspecifika optoelektroniska egenskaper(t.ex. prover inbäddade i elektriska kretsar), optisk temperaturavkänning^8,,15 (genom att lägga till en temperaturregulator till mikroskopstadiet) eller gasavkänning (genom att anpassa en gaskammare till mikroskopstadiet). HSI har vidare visats lämplig för fluorescens excitationstekniker i stället för fluorescensutsläpp²⁵. Ett bra exempel på användningen av denna hyperspektrala teknik anpassning är detektion av cancerceller i biologiska vävnader⁶. Följaktligen har det protokoll som beskrivs här potential att till stor del utvidgas till att omfatta studier av spektroskopiska egenskaper hos många olika typer av självlysande strukturer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope glass slides	FisherBrand	12-550-15	Glass slides used for sample preparation
Visible and Near Infrared Hyperspectral Confocal Imager	PhotonETC		Microscope used for the analysis, builted according to the user needs, therefore it is no catalog number