Summary
우리는 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-타르타르메밀(Fagopyrum tataricum)에서매개 변형된 변종에 의해 털이 많은 뿌리를 유도하는 방법을 설명합니다. 이 유전자 기능 및 타르타리 메밀에서 이차 대사 산물의 생산을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다., 어떤 유전 변환에 대 한 채택, 또는 개선 후 다른 약용 식물에 대 한 사용.
Abstract
타르타리 메밀 (TB) [Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn] 그것은 플라보노이드, 특히 루틴과 같은 풍부한 이차 대사 산물을 포함하기 때문에 다양한 생물학적 및 약리학적 활동을 가지고 있습니다. Agrobacterium 뿌리 줄기 유전자 유전자 기능을 조사 하 고 이차 대사 산물의 수율을 증가 하는 약용 식물에 털이 뿌리를 유도 하기 위해 전세계적으로 점차적으로 사용 되었습니다. 본 연구에서, 우리는 결핵에서 A. 근위축성-매개털뿌리를 생성하는 상세한 방법을 기술하였다. 7-10일 에서 코틸레톤 및 hypocotyledonary 축은 이식으로 선택되고 1 주 후에 나타난 모험적인 털이 뿌리를 유도하는 이진 벡터를 운반하는 A. 뿌리 줄기 유전자에 감염되었습니다. 생성된 털이 많은 뿌리 형질전환은 형태, 저항성 선택(kanamycin), 및 리포터 유전자 발현(녹색 형광 단백질)에 기초하여 확인되었다. 그 후, 변형 된 털이 뿌리는 필요에 따라 자기 전파되었다. 한편, 골수모세포증(MYB) 전사 인자 인, FtMYB116은 A. 뿌리줄기-매개된 털뿌리를 이용하여 결핵 게놈으로 변형되어 플라보노이드합성에서 FtMYB116의 역할을 검증하였다. 결과는 플라보노이드 관련 유전자의 발현 및 플라보노이드 화합물(루틴 및 케르세틴)의 수율이 FtMYB116에의해 촉진된 유의한(p&0.01)이었으며, 이는 A. rhizogenes-매개털이 뿌리가 유전자 기능 및 이차 대사 산물의 생산을 조사하는 효과적인 대체 도구로 사용될 수 있음을 나타낸다. 털이 많은 뿌리를 생성하기 위한 본 연구에서 기술된 상세한 단계별 프로토콜은 조정 후 임의의 유전적 변형 또는 다른 약용 식물에 대해 채택될 수 있다.
Introduction
타르타리 메밀(TB)(파고피룸타타리쿰(L.) 가에르트른)은 파고피룸 속과 가족다각과1에속하는 디코틸레돈의 일종이다. 한의학 상동성 식품의 일종으로, 결핵은 독특한 화학 성분과 질병에 대한 다양한 생체 활동으로 인해 상당한 관심을 받고 있습니다. 결핵은 주로 탄수화물, 단백질, 비타민 및 카로티노이드뿐만 아니라 페놀산 및 플라보노이드와 같은 폴리페놀이 풍부합니다1. 항산화,항고혈압제 2,항염증제, 항암 및 항당뇨 특성을 포함한 플라보노이드의 다양한 생물학적 및 약리학적 활동이3가지입증되었다.
아그로박테리움 뿌리줄기는 상처부위4,,5를감염시킴으로써 여러 고식물, 특히 디코틸레톤에서 털이 많은 뿌리질환의 발병에 기여하는 토양 세균이다. 이러한 과정은 뿌리 유도(Ri) 플라스미드5,,6에서 T-DNA의 전달에 의해 개시되고 일반적으로 리플라스미드로부터 의 외인성 유전자의 통합 및 발현및 털이 많은 뿌리 표현형을 생성하는 후속 단계를 수반한다.7 A. 뿌리 줄기-매개 형질 전환 털이 뿌리, 식물 생명 공학 분야에서 강력한 도구로, 가장 널리 때문에 그들의 안정적이고 높은 생산성과 짧은 기간에 쉽게 얻을 수 사용되었다. 더욱이, A. 뿌리줄기유전자에 의해 유도된 털이 많은 뿌리는 호르몬이 없는 배지에서 그들의 배기류 발달 및 고도로 분지성장에 의해 효율적으로 구별된다8. 그들은 인공 종자 생산, 뿌리 작은혹 연구를 포함하여 연구의 몇몇 필드에서 이용될 수 있고, 진균균균균, 선충 및 근병원체 와 같은 그밖 유기체와의 상호 작용을 공부하기에서7,,9. 또한, 털이 많은 뿌리 형질전환 배양물들은 생화학적 경로 및 화학적 신호질과 의약품, 화장품 및 식품 첨가물로서 사용되는 식물 이차 대사산물을 생산하기 위한 실험 시스템으로 광범위하게 사용되고 있다8,,10. 인돌 알칼로이드, 아코마이트, 트로판 알칼로이드, 테르페노이드 및 플라보노이드를 포함한 귀중한 이차 대사산물은 야생형 털뿌리에서 합성되어2,수십 년 동안 파낙스인삼11의인삼, 쿠마린12, 암미12,13,
털이 많은 뿌리는 27가구14종에서79종의 식물로 A. 뿌리줄기를 사용하여 생산되었다. 예를 들어, A. 뿌리 줄기-매개 털이 뿌리 변환 대두15,16, 살비아17, 플럼바 고 인디카18, 연꽃 japonicus19,그리고 치커리(Cichorium intybus L.), 20. 결핵 털이 뿌리 변환도 조사되었다2. A. 근위대 유전자에 의해 매개된 털이 많은 뿌리의 발달에 관하여 몇몇 상세한 프로토콜은 이진 벡터를 들고 있거나 하지 않습니다. 예를 들어, Sandra et al.21은 야생형 싹에서 지속되는 형질전환 감자 털이 많은 뿌리를 생산하는 방법을 도입하였다. 완전히 발달된 털이 많은 뿌리는 감자 식물의 줄기 인터노드로 거스 리포터 유전자를 운반하는 A. 뿌리줄기 유전자를 주사한 후 5-6주 후에 시각화될 수 있었다. 또 다른 연구는 또한 황마에 gusA 기자 유전자를 품고 A. 뿌리 줄기에 의해 유도 된 형질 전환 털이 뿌리 시스템을보고했다(코코러스 capsularis L.) 22.또한, Supaart 외23은 ThCA를 생성하기 위해 Δ 1-테트라하이드로칸나비놀산(THCA) 신타제의 유전자를 운반하는 발현 벡터 pBI121로 형질전환된 A. 뿌리줄기유전자를 이용하여 형질전환 담배 털뿌리를 수득하였다.1
그러나, 털이 뿌리 변환의 효과적인 생성을 위한 단계별 프로세스, 특히 결핵에서, 상대적으로 덜 입증 되었습니다. 본 연구에서는, 우리는 기자유전자(GFP),선택적마커(Kan),및 관심 유전자(b4) 및 관심유전자(b4)및 관심 유전자를 이용하여 상세한 프로토콜을 설명하였고, 우리 그룹에서 확인된 기본 나선-루프-나선(bHLH) 패밀리로부터 확인되지 않은 유전자는 결핵에서 털이 많은 뿌리 유전적 변형을 생성한다.bHLH 실험은 5-6 주 동안 지속, 씨앗의 접종에서 털이 뿌리의 생성에, 이식 준비를 포함, 감염, coculturing, subculturing, 및 후속 전파. 더욱이, A. 골수모세포증 전사인자(116)의 결핵 이식유전자를 운반하는 이진 플라스미드를 함유하는뿌리줄기유전자(FtMYB116)는 FTMYB116이 결핵에서 결핵 및 대사 수준에서 결핵에서 의 한 모발 기근 변환을 통해 플라보노이드, 특히 루틴의 축적을 촉진할 수 있는지 여부를 결정하는데 사용되었다. A. rhizogenes FtMYB116은빛 유도 전사 인자이며, 다른 빛 조건 하에서 루틴의 합성을조절한다 5. 찰콘신타제(CHS),플라바노네-3-하이드록실라제(F3H), 플라보노이드-3'-하이드록실라제(F3'H), 플라보놀HF3신타제(FLS)24는 루틴 생합성의 대사 경로에 관여하는 주요 효소이다.F3HFLS 따라서, 본 연구는 결핵 털이 많은 뿌리에서 FtMYB116의 과발현과 주요 효소 유전자의 발현뿐만 아니라 루틴 및 퀘르세틴과 같은 다른 플라보노이드의 함량을 입증한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 연구에 사용된 결핵은 BT18로 명명되었으며, 이는 산시 농업 과학 아카데미의 소규모 기타 곡물 연구 센터에서 재배한 "JinQiao No.2"의 품종에서 유래되었습니다. 이 프로토콜의 기본 단계는 그림 1에나와 있습니다.
참고: 이식 과 관련된 조작을 신속하게 운영하고 가능하면 페트리 접시를 닫아 서 시동및 오염을 피하십시오. 달리 명시되지 않는 한, 모든 배양 배양은 25°C에서 14-h 빛 및 10-h 어두운 광주기의 조건하에서 수행되었다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 이식- 또는 박테리아 관련 작업은 층류 후드의 무균 조건하에서 수행되었다. A. 뿌리줄기 유전자 및 시험관 내 식물 배양에 대한 모든 배지 성분은 표 1에제공된다. pH를 조정한 후, 모든 배지를 20분 동안 120°C에서 오토클레이브하였다.
주의: 모든 유전자 변형 박테리아와 식물을 적절한 폐기물 용기에 보관하십시오. 모든 유해 화학물질을 연기 찬장에 넣고 유해 폐기물 용기에 보관하십시오.
1. 결핵 이식의 준비
- 결핵 씨앗의 준비
- 2년 이하의 온도에서 보존된 통통하고 손상되지 않은 결핵 종자(그림1A1)를선택하십시오.
- 종자 털을 쉽게 벗길 수 있도록 약 20 분 동안 28 °C에서 물에 씨앗을 담급니다(그림 1A2). 필요한 경우, 박리를 용이하게하기 위해 씨앗에 슬롯을 잘라 가위를 사용합니다.
- 결핵 종자의 살균
- 껍질을 벗긴 씨앗 100-200개에 100 mL의 멸균 된 원추형 플라스크에 넣습니다.
- 30s에 대한 75 % 에탄올을 사용하여 씨앗을 소독.
- 에탄올을 5% 하이포아염소산나트륨으로 교체하고 15분 동안 소독하십시오.
참고: 8분 동안 1 g/L의 농도로 수은 비염산염을 사용하여 소독하면 부적절한 살균의 경우 하이포염화나트륨을 대체하는 대체 살균제로 사용될 수 있습니다.
주의: 수은 염화물은 유해하며 환경 친화적 인 물질이 아닙니다. 어떤 경우에도 수은 비염화물을 사용하는 경우, 연기 찬장에서 작동하고 유해 폐기물 용기에 증착. - 하이포염화나트륨을 붓습니다.
- 멸균 탈이온수를 사용하여 씨앗을 5회 세척합니다.
- 씨앗을 멸균 된 이중 종이로 건조시고.
- 결핵 모종의 준비
- 300 mL 식물 조직 배양 병에 50 mL 무라시게와 스쿠그 (MS) 기저 배지 (1962)를 30Table 1g/L 자당 과 7 g/L 한천 분말 (MSSA)으로 보충하였다.
- 오토클레이브를 하기 전에 pH를 5.8로 조정합니다.
- MSSA 배지 1병당 10개의 씨앗을 고르게 분배합니다.
- 7-10일 동안 빛의 조건하에서 25°C±1°C에서 배양실에서 종자발하였다.
- 멸균 이식의 준비
- 2개의 코틸레온이 펼쳐지면TB(그림 1C)의견고한 모종을 선택합니다.
- 뿌리에서 모종을 잘라(그림 1C 적색 대시 화살촉),매체와의 접촉을 피.
- 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
- hypocotyls0.8-1 cm 세그먼트로 잘라, 약 0.5 cm 조각으로 코일레온을 전단.
- 이러한 이식을 MSSA 배지상에서 24시간 동안 광 조건하에 배양한다.
- 100 mL 멸균 원추형 플라스크로 옮기면 감염될 준비가 되었습니다.
2. 변형을위한 A. 뿌리 줄기 유전자의 준비
참고: A. 뿌리 줄기 균주 ACCC10060 친절 하 게 약용 식물 개발 연구소에 의해 제공 하 고 -80 °C에서 보존. A. 뿌리줄기유전자는 GFP를 수반하는 b4 유전자를 운반하는 T-DNA를 보유한 이진 벡터 pK7GWIWG2D(II)로 변형시켰으며, 칸 저항 유전자를 선택 가능한 마커로서. 유전자 b4는 아직 출판되지 않은 전사 인자 bHLH 패밀리의 일원이다. 결핵 털이 많은 뿌리의 잠재력을 평가하기 위해, A. 뿌리 줄기 유전자는 MYB116 유전자를 함유하는 이진 벡터 pK7WG2D로 변형하여 유전자 발현 수준 및 대사 분석에서 플라보노이드와 같은 이차 대사 산물의 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 활성화 된 A. 뿌리 줄기는 이식과 동시에 잘 준비되어야합니다.
- A. 뿌리 줄기 유전자의 활성화
- 얼음에 A. 뿌리 줄기를 해동
- 박테리아를 찍어 효모 만니톨 배지(YEB)에 15 g/L 한천 파우더, 50 mg/L 리팜피신, 50 mg/L 스펙티노마이신(YEBARS, pH 7.0)으로 보충했습니다.
- 박테리아를 28°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
- 단일 클론 식민지를 선택하고 위에서 설명한 것과 동일한 방식으로 다른 페트리 접시에 배양하십시오.
- 단일 클론 콜로니를 선택하고 100 mL 살균 된 원추형 플라스크에서 50 mg / L 리팜피신과 50 mg / L 스펙노신 (YEBRS, pH 7.0)을 보충한 100 mL 살균 원추형 플라스크에서 28 °C및 200 rpm에서 16-18 h까지OD0값 에 도달합니다.
- OD600 값이 약 0.5에 도달할 때까지 4-5시간 동안 200 rpm의 YEBRS 배지의 20 mL을 함유하는 다른 100-mL 원추형 플라스크에서 상기 배양배양물 의 2%-4%를 배양한다(도1D).
3. 결핵 이식의 감염 및 검열
참고 :이 프로토콜의 목적은 유전적으로 변형 된 털이 많은 뿌리를 얻는 것입니다. 야생형 뿌리는 형질전환 발현을 평가하기 위해 음성 대조군으로서 사용되었다. 본 프로토콜에서, A. 뿌리줄기유전자는 b4의 유전자를 미리 운반하는 FtMYB116 또는 pK7GWIWG2D(II)의 유전자를 운반하는 pK7WG2D 중 하나이다.
- A. 뿌리 줄기 유전자의 재서스펜션
- 2.1.6단계에서 얻어진 배양을 50 mL 멸균 원심관으로 옮김을 옮김을 옮김.
- 4,000 x g에서 20°C에서 10분 동안 회전합니다.
- 상판액을 제거하고 30 g/L 수크로오스 및 300 μM 아세토시링곤(AS)(MSSAS, pH 5.8)을 OD600에서 0.2로 보충한 MS 배지로 세균 펠릿을 다시 중단시켰다.
- 이식의 감염
- 3.1.3단계에서 수득된 세균 현탁액을 10분 동안 1.4.6단계로 제조된 이식액을 함유하는 원추형 플라스크내로 주입한다(도1E).
- 이식물을 꺼내서 멸균 된 이중 종이를 사용하여 건조시십시오.
4. A. 뿌리 줄기유전자를 가진 이식물의 공동 배양
- 30 g/L 자당과 100 μM AS (MSSAAS 배지, pH 5.2)로 보충 된 7 g / L 한천 분말을 사용하여 고화되는 MS 매체에 멸균 9cm 직경 의 필터 종이를 놓습니다.
- 암흑에서 3일 동안 25°C에서 필터 용지에 이식을 중첩시(도1F).
5. 유도 및 선택적 문화
- 500 mg/L 세포조시메와 50 mg/L 카나마이신(칸)(MSSACK, pH 5.8)으로 보충된 MSSA 배지에 약 20개의 감염된 이식을 놓습니다(그림1G).
- 25 °C ± 1 °C에서 빛 조건 하에서 수직으로 배양하십시오. 털이 많은 뿌리는 배양 후 약 1주 후에 발생합니다(그림1H 흑대시 화살촉은 털이 많은 뿌리의 발생을 나타낸다).
참고: 필요한 경우 15일마다 MSSACK 배지를 교체하십시오.
6. 결핵 털이 많은 뿌리 를 피하
참고 : 이 절차는 활발한 털이 많은 뿌리를 수확하는 것을 목표로합니다. 정기적으로 전파하는 동안 털이 뿌리의 성장을 관찰하고 적시에 오염되고 비활성화 된 뿌리를 제거하십시오. 필요한 경우 다음 단계를 반복하여 털이 많은 뿌리를 전파합니다. 그것은 약 소요 10-14 수확에 subculturing에서 일.
- 흰색 모양과 급속한 성장을 보여주는 털이 뿌리를 선택합니다.
- 2-3cm의 조각으로 잘라.
- 깨끗한 벤치에 명확하게 번호를 매십시오.
- 이를 100 mL의 멸균된 원추형 플라스크에서 30 g/L 수크로오스 및 50 mg/L 칸(MSSK, pH 5.8)을 25°C에서 80°C의 회전 속도로 보충하여 5 0mL를 함유하는 멸균원원하순 플라스크를 25°C에서 플라스크의 바닥으로 오버퍼될 때까지 배양한다(도1I).
7. 변형 된 털뿌리의 식별과 보존
참고 : 변형 된 털이 많은 뿌리는 형태학 및 유전자 수준의 양상에 따라 식별 할 수 있습니다. 식별은 또한 이 프로토콜에서 다루지 않는 털이 많은 뿌리 게놈 및 저항에 따라 수행될 수 있다. 이 절차는 주로 리포터 유전자 및 표적 유전자 식별에 초점을 맞춥니다.
- 황갈색과 오염된 털뿌리를 제거하고 흰 털이 있는 뿌리를 선택합니다.
- 청색/광 이중 자외선 트랜스밀레이터 아래에 녹색 형광이 있는지 평가합니다.
- 번호가 매겨진 튜브에서 강한 형광 신호를 나타내는 털이 많은 뿌리를 선택하거나 흡수성 종이로 건조한 후 표시된 tinfoil을 사용하여 감싸십시오.
- 액체 질소로 동호우를 친 다음 추가 조사를 위해 모든 수확을 -80 °C에 저장하십시오.
- 유전자 식별
- 액체 질소에 미세 분말로 털이 뿌리의 triturate 0.1 g.
- 식물 게놈 DNA 키트의 제조자의 지시에 따라 변형된 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)방법(25)을 이용하여 결핵의 독립적인 형질전환 라인의 게놈 DNA를 제조한다.
- 표 2에열거된 100 ng의 게놈 DNA 템플릿 및 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행한다.
- 다음과 같이 증폭 주기를 수행합니다: 5분 동안 94°C에서 의 예치, 30초동안 94°C에서의 변성, 30초동안 55°C에서 어닐링, 30초동안 72°C에서 프라이머 연장. 36 사이클 후 72°C에서 10분 동안 최종 연장 단계를 마친 후, 1% 아가로즈 겔에서 증폭 제품을 분석하였다.
- 핵산 염색으로 젤을 염색하고 자외선 아래에서 가시화하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
아그로박테리움 뿌리줄기-매개 결핵 털뿌리 형질전환
본 연구는 A. 뿌리줄기유전자를사용하여 유전적으로 변형된 털뿌리를 얻기 위해 설립된 단계별 프로토콜을 설명한다. 결핵 종자의 접종으로부터 확인된 털이 많은 뿌리를 수확하는 데 약 5-6주가 걸렸으며, 몇 가지 주요 단계는 그림1(A-H)에도시되어 있습니다. Figure 1 간단히, 멸균된 껍질을 벗긴 종자(도1B)를접종하여 더 빠른 멸균 발아를 달성하였다. A. 뿌리 줄기 (그림 1D)및 멸균 이식은 각각 활성화및 사전에 준비되어야한다. 이는 활성화된 A. 뿌리줄기유전자(도 1E),동문화(도1F),및 선택적 배양(도1G)을가진 이식의 감염을 포함하는 몇 가지 주요 단계에 따른다. 감염된 이식은 고화 된 MS 배지상에 고르게 배치되어야하며 공간은 상이한 형질전환 라인을 쉽게 분리하기 위해 그들 사이에 유지되어야합니다. 털이 많은 뿌리는 이종의 상처 부위에서 소굴성 방식으로 푹신한 백색색으로나타난다(도 1H). 털이 많은 뿌리는 고도로 분지되고 연동된 매트릭스를 형성하고 필요에 따라 전파될 수있다(도 1I). 수확된 털이 많은 뿌리는 유전자 기능 또는 유전자- 또는 단백질-단백질 상호작용을 조사하는 데 사용될 수 있다. 양자 택일로, 결핵 털이 뿌리는 지정된 생물 반응기에서 루틴과 같은 이차 대사 산물을 산출하기 위하여 거대하게 전파될 수 있습니다.
결핵에서 형질전환털뿌리를 유도하는 방법은 유전자 GFP 및 b4(전사 인자 bHLH 패밀리의 일원, 아직 출판되지 않은)를 운반하는 이진 벡터(pK7GWIWG2D(II))를 사용하여 입증되었다.pK7GWIWG2D (II) 리포터 유전자 GFP는 청색/광 이중 자외선 트랜스일루미네이터 하에서 신호를 시각화하거나 표적 유전자를 식별함으로써 비형질성 모발과 형질전환 성 뿌리를 쉽게 구별하기 위해사용되었다(도 3).Figure 3 변형된 털이 많은 뿌리는 청색 또는 자외선 아래에서 조명될 때 녹색 형광을 나타내고(도 2A에서검은 색 화살촉을 사용하여 표현됨), 반면 변형되지 않은 털뿌리는 녹색 형광을 나타내지 않았다(그림2B). 그림 2C에도시된 바와 같이 높은 GFP 신호를 가진 털이 많은 뿌리가 요새 동안 전파되었습니다.
이진 벡터가 결핵 게놈으로 성공적으로 변형되었는지 여부를 추가로 확인하기 위해 유전자 식별이 수행되었습니다. 간략하게, 결핵 털이 많은 뿌리의 식물 게놈 DNA는 변형된 CTAB 방법25에기초하여 PCR 분석을 위해 제조되었다. PCR은 도 3에각각 존재했던 유전자(Kan,Kan GFP,및 b4)를증폭시킴으로써 수행되었다. 프라이머는 표 2에나열되어 있습니다. 모든 형질전환 선에서 3개의 유전자의 존재(도 3,레인 5-11)는이진 벡터가 성공적으로 결핵 게놈으로 변형되었음을 나타냈다. 칸 및 GFP는 야생형 뿌리(도3,레인 3)및 실험적 음성 대조군(도3,레인 4)에서결석한 반면, b4는 야생형 뿌리에서 검출되었다. 이들 3개의 유전자는 의심할 여지 없이 양성 대조군(도3,레인 2)에서제시되었으나 음성 대조군(도3,레인 4)에서분명히 결석하였다.
전술한 털이 많은 뿌리 시스템을 이용한 결핵에서 의한 발적 인자 FtMYB16의 평가
FtMYB116털뿌리 유도의 전술한 프로토콜을 채택하여 발현되었다. 이것은 유전자 FtMYB116을 이진 벡터 pK7WG2D내로 사전 삽입한 다음 유전자 과발현을 달성하기 위해 A. 뿌리 줄기 유전자로 감염시킴으로써 달성되었다. 간략하게, 0.1 g의 털이 많은 뿌리는 액체 질소를 사용하여 미세한 분말로 삼조되었다. 총 RNA는 식물 RNA 격리키트(26)의제조자의 지시에 따라 추출되었다. 이어서 역전사 PCR 및 실시간 PCR을 수행하여 FtMYB116 및 루틴 합성 경로 관련 유전자를 증폭시. 이어서 루틴 합성 관련 유전자 발현 및 루틴의 수율에 대한 FtMYB116의 조절 효과가 확인되었다.
도 4A는 결핵 털이 많은 뿌리의 형질전환선에서 FtMYB116의 상대적 발현을 나타낸다. 대조군과 비교하여, FtMYB116의 상대적 발현은 모두 3개의 독립적인 형질전환 라인에서 상당한 증가를 나타내었다. 도 4B 및 도 4C는 FtMYB116 과발현을 통해 대사 수준에서 루틴 및 케르세틴의 생합성촉진을 도시한다. 형질전환에서 루틴과 케르세틴의 함량은 야생형에 비해 현저히(p< 0.01) 증가하였고, 각각 40 mg/g/g에 이르렀으며, 이는 야생형의 8배에 달했다. 모든 3개의 형질전환선에서 CHS, F3H, F3'H및 FLS의 상대적인 유전자 발현은 대조군에 있는 이들보다 현저하게 높았다(도4D). 함께, 이러한 결과 결핵에 털이 루트 변환을 생성 하 고 유전자 발현 및 이차 대사 산물의 신진 대사 수율을 조사 하기 위해이 연구에서 설명 된 전략을 성공적으로 사용할 수 있습니다 확인.
그림 1: A. 뿌리 줄기-결핵에서매개형 형질전환 털뿌리를 유도하는 과정. 임계 단계의 대표적인 이미지가 표시된다:(A1)및(A2)종자 털을 벗겨내기 전후를 나타낸다; (B)는MSSA 배지를 함유하는 조직 병에 접종된 각 10개의 종자들을 나타낸다; (c)접종 후 7-10일 동안 결핵의 모종을 나타내고, 적색 대시 화살촉은 절단점을 나타낸다; (D)및(E) 각각 A. 뿌리줄기유전자(OD 600= 0.5)의 제제및 이식액의 감염을 나타낸다; (F)및(G)각각 MSSAAS 배지에 활성화된 A. 뿌리줄기유전자와 선택적 배양을 통해 COCULTURING을 상징하는; 털이 뿌리에서 나온다(H), 검은 대시 화살촉에 의해 도시 된 바와 같이; (I)털이 많은 뿌리 형성의 전파를 나타낸다; 검은 색 대시 화살촉은 유도 된 털이 뿌리를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: GFP 리포터 유전자를 운반하는 이진 벡터의 형질전환. (a)청색/빛 이중 자외선 트랜스일루미에이터 하에서 검사된 선택적 배양 후 유도된 털뿌리를 나타낸다. (B)및(C)는각각 변형 된 털이 많은 뿌리의 야생 형 뿌리와 전파를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 7개의 독립적인 형질전환선에서 결핵의 야생형 뿌리및 털이 많은 뿌리로부터 분리된 게놈 DNA로부터유전자(Kan, GFP,및 b4)의PCR 증폭. (A):칸,(B):GFP,(C):b4. 레인 1: 분자 크기 마커 (흰색 화살표촉은 750 bp를 나타냄), 레인 2: 플라스미드 (이진 벡터 pK7GWIWG2D (II) 운반 칸, GFP,및 b4 유전자) 양성 대조군으로, 레인 3: 야생형 뿌리, 레인 4: 정제 된H2O를 네거티브 대조군으로, 차선 5-11: 7 개의 독립적 인 형질전환 선. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 결핵 털이 많은 뿌리의 형질전환 라인에서 FtMYB116의 상대발현. (a)및(B)루틴 및(C)케르세틴의 생합성에 대한 FtMYB116의 과발현의 자극적 효과(이 수치는 동외5)로부터변형되었다. 실험은 삼중항에서 수행되었고 3회 실시하였다. "**"는 학생의 t-test를사용하여 p< 0.01에서 유의한 차이를 나타냅니다. (D)형질전환선에서 플라보노이드 합성 경로와 관련된 유전자의 발현. 상대발식 레벨은 액틴 컨트롤의 수준으로 정규화되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(n = 3)로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 미디어 | 중간 성분 | ||
| MSSA | 무라시게와 스쿠그(MS) 배지에 자당을 30 g/L, 한천 분말을 7 g/L, pH 5.8로 함유 | ||
| 예바 (예바) | 효모 만니톨 미디엄 (YEB) 15 g/L에서 한천 분말을 함유하고, 리팜피신을 50 mg/L, 50 mg/L에서 스펙노마이신, pH 7.0 | ||
| 예브르 (예브르주) | 50 mg/L에서 리팜피신을 함유하는 YEB, 50 mg/L에서 스펙티노마이신, pH 7.0 | ||
| MSSAS | 30 g/L에서 자당을 함유하는 MS 배지, 300 μM에서 아세토시링곤(AS), pH 5.8 | ||
| MSSAA | 30g/L의 자당을 함유하는 MS 배지, 7g/L의 한천 분말, 100μM에서의 AS, pH 5.2 | ||
| MSSACK | 30 g/L에서 자당을 함유하는 MS 배지, 7g/L의 한천 분말, 500 mg/L의 세포조석, 50 mg/L에서 의 한미약(칸) 50 mg/L, pH 5.8 | ||
| MSSK | 30 g/L에서 자당을 함유하는 MS 배지, 50 mg/L에서 칸, pH 5.8 | ||
표 1: 미디어 및 그 성분.
| 뇌관 | 시퀀스 (5'-3') | |
| GFP-F | 카카아그트카그GTCCG | |
| GFP-R | 아그트카CT가가트GCCGC | |
| b4-F | AAATCTTCTGTGG | |
| b4-R | ATGCCATCatTGCCAAG | |
| 칸에프 ()에프 (것)에 | ATTCGGCATATGGGCAC | |
| 칸-R | 트가카가아아아아GCGGCCA | |
표 2: 프라이머 시퀀스.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
결핵은 유전 및 대사 수준1,,2,5,27,,28에서이차 대사 산물과 관련된 여러 연구에서 사용되어 왔다.5, 털이 많은 뿌리 문화는 대사 산물 생산을위한 고유 한 공급원으로, 대사 공학(29)에 중추적 인 역할을하고 관련 유전자를 삽입하여 신진 대사 경로를 변경하는 데 사용할 수 있습니다. Kim등.2는 처음에 페놀 화합물의 생산을 달성하기 위해 A. 근성-매개형질전환에 의한 결핵 뿌리 배양물의 확립을 도입했다. 결핵털뿌리에서 얻은 루틴의 함량은 야생형 뿌리보다 10배 이상 높았다. 본 연구에서, FtMYB16의 도입은 루틴 관련 유전자의 높은 발현을 주도하고 결핵 털이 뿌리에 루틴의 생산을 급증. 이러한 기술은 결핵 뿌리,5,30,31에서 FtF3H 및 FtFLS와 같은 페닐프로판노이드 관련 유전자의 표현형 특성 및 발현에 적합한 것으로 확인되었다., Zhang et al.32는 일련의 FtMYB 전사 요인을 과발현하여 루틴의 생산을 조사하기 위해 결핵 털뿌리를 사용했습니다. Zhou 등33 결핵 털이 많은 뿌리에서 FtMYB11의 과발현으로 인해 루틴의 함량이 감소하는 것을 관찰했다. 우리의 사실 인정과 함께 이 결과는 FtMYB 전사 인자와 루틴 생합성 관련 유전자 사이 상호 작용에 털이 뿌리 변환의 실행 가능한 효력을 표시합니다.
결핵 털이 많은 뿌리의 유도에 대한 단계별 프로토콜에 관한 제한된 데이터가 있지만, 우리는 이진 벡터를 운반하는 A. rhizogenes를 사용하여 효율적이고 안정적인 방식으로 형질전환 결핵 털 뿌리를 얻기 위해 처음으로 본원에서 단계별 프로토콜을 기술한다. 이러한 실험 과정에서, 수많은 요인 신중 하 게 최적의 유도 된 털이 뿌리를 얻기 위해 고려 되어야. 첫째, 이식의 선택은 결정 요인이다. 결핵 품종은 털이 많은 뿌리의 형태와 페놀 화합물의 생산에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. Thwe 등30은 페닐프로판노이드 생체 합성 경로에서의 유전자 발현 및 페놀 화합물의 함량이 결핵 품종 사이에서 다양한다는 것을 예시하였다. 그(것)들은 또한 그것의 안토시아닌 내용13때문에 깊은 붉은 보라색 인 1개의 품종에 있는 털이 많은 뿌리를 찾아냈습니다. 우리의 연구에서, 2 그냥 전개 된 자두와 hypocotyls 는 이식물로 선택되었다. 이는 젊고 부드러운 잎이 털이 많은 뿌리 유도율2,,30을선호하는 반면, 고도로 분화되고 오래된 식물 세포는 털이 많은 뿌리 유도에 악영향을 미치기 때문이다. 둘째, A. 뿌리 줄기 유전자의 변형은 털이 뿌리 유도에 큰 영향을 미친다. 상이한 세균성 균주는변종(34)에의해 수용된 상이한 플라스미드에 의해 조명될 수 있는 털이 많은 뿌리의 형태및 유도 효율면에서 상이한 변형 능력을 나타낸다. Aye등.35 여러 A. 뿌리 줄기 균주 (R1000, R1200, 15834, LBA9402, 및 A4)의 TB 털이 뿌리 유도 및 페닐프로파노이드 생합성의 효과를 비교하고 결핵에서 털이 뿌리 생산을위한 가장 유망한 변형이 R1000이었다는 것을 발견했다. 이러한 발견은김외2에 의해 뒷받침되었으나, Aye 등의 연구에서 제외되었지만, 우리의 연구에서 사용된 ACCC10060균은 만족스러운 감염 효율을 나타내었다. 우리의 프로토콜을 사용하여 얻은 털이 많은 뿌리의 푹신한 흰색 외관은 살비아 miltiorrhiza36에서생성된 털이 많은 뿌리와 일치하며, 이와 동일한 균주 ACCC10060이 이진 벡터pK7GWIWG2D(II)를 운반하는 것을 표적 유전자를 침묵시키기 위해 사용되었다. 셋째, 선택적 배양에서 물질의 전처리 및 cefotaxime의 농도를 포함하여 degerming또한 털이 뿌리 유도에 중요한 역할을한다. 어떤 단계에서 불완전한 소독은 털이 뿌리 변환의 실패로 이어질 수 있습니다. 또한, 세균 농도는 형질전환된 뿌리의 생산에 상당한 영향을 미친다. 높은 농도는 경쟁 억제에 의해 식물 세포를 줄일 수 있습니다., 반면 낮은 농도 낮은 가용성을 일으킬 수 있습니다4.
더욱이, 성장 배지와 같은 배양 조건, 적절한 전조 및 cocultureturing 시간, 및 기타 생체 또는 비생물적 인자는 털이 많은 뿌리 인덕턴에서 중요한 역할을 한다. 황외. 37 권장 1/2 최대 결핵 털이 뿌리를 달성 하기 위해 공동 육성에 대 한 30 g/L의 농도에서 자 당을 포함 하는 MS 매체. 이는 털이 많은 뿌리 형성에 적합한 높은 염염 배지에 의해 설명될 수 있는 반면, 낮은 염염 배지는 과도한 세균증식(34)을선호한다. AS는 A. 뿌리줄기-아그로박테리움(34)34 및 38의 vir 영역의 전사에 의해 다수의 식물 종에서 매개형 변형을 용이하게 할 수 있는 페놀 화합물의 A. rhizogenes일종으로,5.739,,40의pH를 가진 배지에서 효과적으로 유도될 수 있었다. 따라서, AS의 100 μM으로 보충된 pH 5.2를 가진 동배 배지를 추천합니다. 황외. 37 보고 결핵 털이 뿌리 는 흰색과 옅은 노란색에서 하루 후 갈색으로 설정 24. 따라서, 그들은 24 일마다 털이 많은 뿌리를 배양; 그러나 털이 많은 뿌리의 갈색을 피하기 위해 매일 밤 을 subculturing 것이 좋습니다. 또한, 빛, 호르몬, 온도 및 UV 방사선과 같은 환경 조건은 매우 자극적이거나 우울한 신호 변환41,,42에의해 플라보노이드 생합성 관련 유전자의 발현에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이전 연구는 결핵 털이 뿌리에서 루틴 관련 유전자 발현을 모니터링하는 데 원붉은 빛의 중요성을입증했다 5.
A. 근위대유전자-매개형형형형은 이진 벡터에 삽입된 임의의 외인성 유전자가 과발현을 달성하기 위해 변형된 털이 많은 뿌리클론(34)으로 전달될 수 있다는 장점이 있으며, RNA침묵(43)을통한 기능 상실, 또는 전사체 분석에 의한 새로운 대사 유전자의 발견5. 털이 많은 뿌리는 이차 대사 산물, 재조합 단백질 및 심지어 항체44를생산할 수있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 이는 주로 호르몬이 없는 배지에서 의한 쉽고 빠른 성장, 덜 비싸고, 완전한식물(21)으로의재생을 위한 요건이 없고, 시작 식물재료(31)에비해 이차 대사산물의 상대적으로 높은 수율이 때문이다. 이러한 뿌리는 또한 그들의 생합성 용량 및 표현형을 유지하는 장기, 안정및 특징적인 뿌리 클론을 확립하기 위해 원래의 이식으로부터 분리될 수 있다. 전부, 이러한 결과에 따라, 이 프로토콜은 이차 대사 산물의 생산을 조사하기 위해 변형 된 털뿌리를 생산하는 신속하고 뚜렷하고 효율적인 방법을 제공하고 다른 식물에서 털이 뿌리 유도에 대한 참조를 제시합니다. 그러나, 생리활성 화합물의 엄청난 수율을 생성하는 털이 많은 뿌리 배양을 탐구하는 잠재력은 산소의공급과같은 특정 파라미터가 우려되어야 하는 적절한 생물반응기 시스템에 의존한다4,8. 이 프로토콜은 털이 많은 뿌리에서 유래된 이차 대사산물의 생산에 국한되고, 이차 대사산물의 색과 내용물의 차이와 같은 기능성 유전자의 가시화된 표현형을 조사하는 것이다; 그러나, 털이 많은 뿌리로부터 재생된 식물의 수득에 관계없이 전체 식물의 현상학적 변화는 본 연구에서 평가될 수 없었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개할 이해상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중앙 공공 복지 연구 기관 ZXKT17002에 대한 기본 연구 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2*Taq PCR MasterMix | Aidlab, China | PC0901 | |
| Agar powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8190 | |
| Applied Biosystems 2720 thermo cycler | ThermoFisher Scientific, US | A37834 | |
| AS | Solarbio Life Science, Beijing, China | A8110 | Diluted in DMSO, 100 mM |
| binary vectors | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | / | pK7WG2D/pK7GWIWG2D (II) |
| Cefotaxime,sodium | Solarbio Life Science, Beijing, China | C8240 | Diluted in Water, 200 mg/mL |
| CF15RXII high-speed micro | Hitachi, Japan | No. 90560201 | |
| Diposable Petri-dish | Guanghua medical instrument factory, Yangzhou, China | / | |
| DYY-6C electrophoresis apparatus | Bjliuyi, Beijing China | ECS002301 | |
| EASYspin Plus Plant RNA Kit | Aidlab, China | RN38 | |
| ELGA purelab untra bioscience | ELGA LabWater, UK | 82665JK1819 | |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | biotek, US | / | |
| Gateway BP/LR reaction enzyme | ThermoFisher Scientific (invitrogen), US | 11789100/11791110 | |
| HYG-C multiple-function shaker | Suzhou Peiying Experimental Equipment Co., Ltd. China | / | |
| Kan | Solarbio Life Science, Beijing, China | K8020 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| MLS-3750 Autoclave sterilizer | Sanyo, Japan | / | |
| MS salts with vitamins | Solarbio Life Science, Beijing, China | M8521 | |
| NaCl | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8210 | |
| Other chemicals unstated | Beijing Chemical Works, China | ethanol, mercury bichloride, etc. | |
| PHS-3C pH meter | Shanghai INESA Scientific Instrument Co., Ltd, China | a008 | |
| Plant Genomic DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO., LTD | DP305 | |
| Rifampin | Solarbio Life Science, Beijing, China | R8010 | Diluted in DMSO, 50 mg/mL |
| Spectinomycin | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8040 | Diluted in Water, 100 mg/mL |
| Sucrose | Solarbio Life Science, Beijing, China | S8270 | |
| Trans2K DNA Marker | TransGen Biotech, Beijing, China | BM101-01 | |
| Tryptone | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0042 | |
| Whatman diameter 9 cm Filter paper | Hangzhou wohua Filter Paper Co., Ltd | / | |
| Yeast Extract powder | Solarbio Life Science, Beijing, China | LP0021 |
References
- Fabjan, N., et al. Tartary Buckwheat ( Fagopyrum tataricum Gaertn .) as a Source of Dietary Rutin and Quercitrin. Agricultural and Food Chemistry. 51, 6452-6455 (2003).
- Kim, Y. K., et al. Production of Phenolic Compounds in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Journal of Crop Science & Biotechnology. 12 (1), 53-57 (2009).
- Yao, Y., et al. D-chiro-inositol-enriched tartary buckwheat bran extract lowers the blood glucose level in KK-Ay mice. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (21), 10027-10031 (2008).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Zhang, D., et al. The light-induced transcription factor FtMYB116 promotes accumulation of rutin in Fagopyrum tataricum. Plant, Cell & Environment. 42, (2018).
- Chilton, M. -D., et al. Agrobacterium thizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells. Nature. 295 (4), 129 (1982).
- Guillon, S., Trémouillaux-Guiller, J., Kumar Pati, P., Gantet, P. Hairy Roots: a Powerful Tool for Plant Biotechnological Advances. Bioactive Molecules and Medicinal Plants. , 271-283 (2008).
- Srivastava, S., Srivastava, A. K. Hairy root culture for mass-production of high-value secondary metabolites. Critical Reviews in Biotechnology. 27 (1), 29-43 (2007).
- Veena, V., Taylor, C. G. Agrobacterium rhizogenes: Recent developments and promising applications. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (5), 383-403 (2007).
- Ramachandra Rao, S., Ravishankar, G. A. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnology Advances. 20 (2), 101-153 (2002).
- Palazón, J., et al. Growth and Ginsenoside Production in Hairy Root Cultures of Panax ginseng using a Novel Bioreactor. Planta Med. 69 (04), 344-349 (2003).
- Staniszewska, I., Królicka, A., Maliński, E., Łojkowska, E., Szafranek, J. Elicitation of secondary metabolites in in vitro cultures of Ammi majus L. Enzyme and Microbial Technology. 33 (5), 565-568 (2003).
- Uddin, M. R., Li, X., Won, O. J., Park, S. U., Pyon, J. Y. Herbicidal activity of phenolic compounds from hairy root cultures of Fagopyrum tataricum. Weed Research. 52, 25-33 (2011).
- Christey, M. C., Braun, R. H. Production of hairy root cultures and transgenic plants by Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation. Methods in Molecular Biology. 286, Clifton, N.J. 47-60 (2005).
- Olhoft, P. M., et al. A novel Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation method of soybean [Glycine max (L.) Merrill] using primary-node explants from seedlings. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant. 43 (6), 536-549 (2007).
- Kereszt, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of soybean to study root biology. Nature Protocols. 2 (4), (2007).
- Pistelli, L., et al. Bio-Farms for Nutraceuticals: Functional Food and Safety Control by Biosensors. , Chapter 13 (2010).
- Gangopadhyay, M., Sircar, D., Mitra, A., Bhattacharya, S. Hairy root culture of Plumbago indica as a potential source for plumbagin. Biologia Plantarum. 52 (3), 533-537 (2008).
- Okamoto, S., Yoro, E., T, S., K, M. Division Hairy Root Transformation in lotus Japonicus. Bio-Protocol. 3 (12), 14-17 (2013).
- Fathi, R., Mohebodini, M., Chamani, E. High-efficiency Agrobacterium rhizogenes-mediated genetic transformation in Cichorium intybus L. via removing macronutrients. Industrial Crops and Products. 128, 572-580 (2019).
- Fernández-piñán, S., et al. Transformation of Potato and the Promoter Activity of a Suberin Gene by GUS Staining. Journal Of Visualized Experiments. , e1 (2019).
- Chattopadhyay, T., Roy, S., Mitra, A., Maiti, M. K. Development of a transgenic hairy root system in jute (Corchorus capsularis L.) with gusA reporter gene through Agrobacterium rhizogenes mediated co-transformation. Plant Cell Reports. 30 (4), 485-493 (2011).
- Sirikantaramas, S., et al. The gene controlling marijuana psychoactivity. Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. Journal of Biological Chemistry. 279 (38), 39767-39774 (2004).
- Zhou, M. L., et al. Characterization of Functional Genes in Buckwheat. Molecular Breeding and Nutritional Aspects of Buckwheat. , 327-331 (2016).
- Liang, C., et al. A Comparative Analysis of the Chloroplast Genomes of Four Salvia Medicinal Plants. Engineering. 5 (5), 907-915 (2019).
- Wang, J., Zhang, X., Yan, G., Zhou, Y., Zhang, K. Over-expression of the PaAP1 gene from sweet cherry (Prunus avium L.) causes early flowering in Arabidopsis thaliana. Journal of Plant Physiology. 170 (3), 315-320 (2013).
- Li, J., et al. Analysis of Flavonoid Metabolites in Buckwheat Leaves Using UPLC-ESI-MS/MS. Molecules. , (2019).
- Zhu, F. Chemical composition and health effects of Tartary buckwheat. Food Chemistry. 203, 231-245 (2016).
- Kaur, B., Malik, C. P. Hairy root culture -a unique source for metabolites production. Journal of Plant Science Research. 25 (2), 123-141 (2010).
- Thwe, A. A., et al. Metabolomic Analysis and Phenylpropanoid Biosynthesis in Hairy Root Culture of Tartary Buckwheat Cultivars. Plos One. 8 (6), (2013).
- Thwe, A. A., et al. Accumulation of Phenylpropanoids and Correlated Gene Expression in Hairy Roots of Tartary Buckwheat under Light and Dark Conditions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 174 (7), 2537-2547 (2014).
- Zhang, K., et al. Jasmonate-responsive MYB factors spatially repress rutin biosynthesis in Fagopyrum tataricum. Journal of Experimental Botany. 69 (8), 1955-1966 (2018).
- Zhou, M., et al. FtSAD2 and FtJAZ1 regulate activity of the FtMYB11 transcription repressor of the phenylpropanoid pathway in Fagopyrum tataricum. New Phytologist. 216, (2017).
- Giri, A., Narasu, M. L. Transgenic hairy roots: Recent trends and applications. Biotechnology Advances. 18 (1), 1-22 (2000).
- Thwe, A., et al. Effect of different Agrobacterium rhizogenes strains on hairy root induction and phenylpropanoid biosynthesis in tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn). Frontiers in Microbiology. 7, 1-10 (2016).
- Cheng, Q., et al. RNA interference-mediated repression of SmCPS (copalyldiphosphate synthase) expression in hairy roots of Salvia miltiorrhiza causes a decrease of tanshinones and sheds light on the functional role of SmCPS. Biotechnology Letters. 36 (2), 363-369 (2014).
- Huang, X., et al. Efficient Rutin and Quercetin Biosynthesis through Flavonoids-Related Gene Expression in Fagopyrum tataricum Gaertn . Hairy Root Cultures with UV-B Irradiation. Frontiers In Plant Science. 7, 1-11 (2016).
- Godwin, I., Todd, G., Ford-lloyd, B., Newbury, H. J. The effects of acetosyringone and pH on Agrobacterium-mediated transformation vary according to plant species. Plant Cell Reports. 9, 671-675 (1991).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagiu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (19), (1985).
- Bolton, G. W., Nester, E. W., Gordon, M. P. Plant Phenolic Compounds Induce Expression of the Agrobacterium tumefaciens loci needed for virulence. Science. 232 (10), 983-985 (1986).
- Ferri, M., et al. Chitosan treatment induces changes of protein expression profile and stilbene distribution in Vitis vinifera cell suspensions. Proteomics. 9 (3), 610-624 (2009).
- Bourgaud, F., Gravot, A., Milesi, S., Gontier, E. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science. 161 (5), 839-851 (2001).
- Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16 (8), 663-668 (2003).
- Sunil Kumar, G. B., Ganapathi, T. R., Srinivas, L., Revathi, C. J., Bapat, V. A. Expression of hepatitis B surface antigen in potato hairy roots. Plant Science. 170 (5), 918-925 (2006).
