我们提出一种用于诱导小鼠脑死亡的模型，以评估脑死亡的病理生理学效应在实体器官移植背景下对器官及其后续移植物的影响。
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方法文章
通过气管切开术进行通气并结合动脉内血压监测的小鼠脑死亡诱导
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
尽管活体捐献和循环死亡后捐献为器官移植提供了替代来源，但脑死亡（BD）后捐献仍是实体器官移植的主要供体来源。然而，脑功能的不可逆丧失已知会引发多种病理生理变化，包括血流动力学及激素水平的改变，最终导致全身性炎症反应。目前能够对这些效应进行体内系统研究的模型十分有限。本文介绍一种小鼠脑死亡诱导模型，有助于深入研究脑死亡对同种异体移植物质量的严重影响。在通过颈总动脉建立动脉内血压监测，并经气管造口实现可靠通气后，利用球囊导管逐步升高颅内压以诱导脑死亡。脑死亡诱导4小时后，可获取器官用于分析或进一步的移植操作。该策略可在小鼠模型中对供体脑死亡进行系统性分析，从而加深对实体器官移植中脑死亡相关效应的理解，并可能为优化器官预处理方案提供新途径。
引言
目前，移植是治疗终末期器官衰竭的唯一治愈性手段。迄今为止，脑死亡（BD）患者一直是器官捐献的主要来源，尽管活体捐献和循环死亡后捐献也是有价值的替代方式1。BD 的定义包括不可逆的昏迷（病因明确）、脑干反射消失以及呼吸停止2。然而，BD 供体器官在长期移植物存活率方面表现较差，这种差异独立于人类白细胞抗原（HLA）配型不匹配和冷缺血时间3。与此同时，针对这一抗原非依赖性风险因素的深入研究已揭示出由 BD 引发的三大主要病理生理改变：血流动力学、内分泌和炎症反应方面的变化4。
迄今为止，啮齿类动物的实验性脑死亡模型主要使用大鼠进行。为了更深入地了解脑死亡后对实体器官的免疫学影响，我们旨在建立一种小鼠脑死亡模型，因为目前只有小鼠模型能够对遗传或免疫因素进行系统性研究。在此背景下，小鼠体系提供了更为丰富的分析工具。
此处所述的脑死亡（BD）诱导原理基于通过将球囊导管插入颅骨下方并充气，从而增加颅内压。升高的颅内压通过阻断大脑、小脑和脑干的灌注，模拟了脑死亡的生理机制5,6。为确保外周器官得到充分灌注，手术过程中必须进行血压监....
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方案
动物实验遵循由美国国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及由美国国家科学院编制、美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，1985 年修订版）。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部（BMWF-66.011/0071-II/3b/2012）批准。
1. 动脉插管
- 通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪10 以及根据当地实践使用的镇痛剂（例如布托啡诺）对小鼠进行麻醉。用镊子夹捏后肢以确认麻醉深度是否合适。
注意：本研究使用8−12周龄的雄性C57BL/6N小鼠（体重20−25 g）。作者曾尝试同龄雄性BALB/c小鼠但未成功，尚未测试其他品系（见讨论部分）。 - 使用电动剃刀去除感兴趣区域（头部、颈部）的毛发。确保无松散毛发残留，以防伤口污染。随后用70%乙醇/氯己定/聚维酮碘对术区进行消毒，并将小鼠仰卧位固定，头部朝向术者。
- 使用解剖剪在颈部正中做一切口。
- 解剖下颌下腺和颈部肌肉组织并将其分离，以暴露颈总动脉。主要使用镊子进行钝性分离。
- 在右侧颈总动脉下方放置三根8-0丝线结扎线。
- 在近端结扎线上放置夹子，并对动脉施加张力，以阻断血流。
- 结扎最远端的结扎线。
- 通过切口颅侧预先制作的皮肤小孔插入动脉导管。若导管管....
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结果
小鼠BD模型已成功实施100余次，成功率超过90%。此外，干预后的心脏和肾脏器官移植也已安全开展。7.
BD 会引发多种病理生理变化，可利用此模型进一步研究。如图1所示，血压首先出现一过性高血压峰值，随后进入持续的低血压阶段。为避免低血压带来的有害生理影响，将长时间血压不足的小鼠（平均动脉压 < 50 mmHg 持续超过 30 分钟）予以排除。
另一个被广泛证实的观察结果是，脑死亡（BD）的诱导会导致免疫系统的激活。在脑死亡持续4小时后，器官特异性免疫标志物在mRNA水平出现上调图2以及观察到免疫细胞的迁移7.
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讨论
脑死亡（BD）是多器官捐献者移植物质量的一个风险因素，其涉及多种病理生理变化，这些变化只能通过体内模型进行充分评估。血流动力学变化、细胞因子风暴、激素水平改变及其对器官移植物质量和存活率的最终影响，无法在体外进行分析4。大多数基础移植研究以及免疫学研究都依赖于复杂的诊断工具，而这些工具目前仅在小鼠模型中广泛可用。小鼠模型已在与脑死亡相关的研究中带来了一系列新见解7,8,9。
尽管在20世纪，BD研究的首批模型已在狒狒、狗和猪中建立11,12，但直到1996年才首次报道了大鼠模型13。又经过了14年，维也纳研究团队于2010年首次发表了BD的小鼠模型6<.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 动脉导管（BD Neoflon 26G） | BD | 391349 | |
| 血压换能器（APT300） | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty 动脉取栓导管 N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| 镊子 | FST | 11271-30 | |
| 带柔性探头的恒温毯系统 | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| 显微剪刀 | FST | 15018-10 | |
| 持针器 | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite 单通道输注泵 | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| 剪刀 | FST | 14075-11 | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX7 | |
| 透气胶带（Transpore Tape） | 3M | 1527-1 | |
| 护理垫 | Molinea.A | 274301 | |
| 小鼠呼吸机（MiniVent Model 845） | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
参考文献
- Hart, A., et al. OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney. American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).
- The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Practice parameters for determining brain death in adults (summary s....
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