Summary
我们提出了脑死亡诱导的鼠模型，以评估其病理生理学效应对器官的影响，以及固体器官移植背景下的连续移植的影响。
Abstract
虽然活体捐献和循环后死亡捐赠为器官移植提供了替代机会，但捐献者脑死亡后捐献（BD）仍然是实体移植的主要来源。不幸的是，大脑功能的不可逆丧失已知会导致多种病理生理变化，包括血液动力学和荷尔蒙修饰，最终导致全身炎症反应。允许在体内系统地研究这些影响的模型很少。我们提出了BD诱导的鼠模型，可以帮助调查BD对异体质量的破坏性影响。通过常见的胡萝卜动脉实施动脉内血压测量，并通过气管切开术进行可靠的通气后，BD 通过气球导管稳步增加颅内压力诱导。BD诱导后四小时，可以采集器官进行分析或进一步移植程序。我们的战略使人体内的BD能够全面分析，从而深入了解固体器官移植中BD相关的影响，并有可能为优化器官预置铺平道路。
Introduction
移植是目前治疗终末期器官衰竭的唯一治疗方法。到目前为止，脑死亡（BD）患者一直是器官捐献的主要来源，尽管活体捐献和循环后死亡后捐赠是有价值的选择1。BD的定义是一个不可逆转的昏迷（与已知的原因），没有脑干反射和呼吸暂停2。不幸的是，BD器官在长期移植生存中表现出低劣的结果，而人类白细胞抗原（HLA）不匹配和冷缺血时间3。同时，对这种抗原无关危险因素进行了深入的研究，结果产生了BD引起的病理生理变化的三个主要方面：血液动力学、荷尔蒙和炎症4。
迄今为止，啮齿动物的BD实验模型大多使用大鼠进行。为了更深入地了解BD之后固体器官的免疫后果，我们旨在建立BD的鼠模型，因为目前只有小鼠模型才能对遗传或免疫因素进行全面调查。在此背景下，鼠标系统提供了种类更丰富的分析工具。
此处描述的BD感应原理基于颅骨下插入的气球导管的膨胀引起的颅内压力增加。增加的颅内压力模仿BD的生理机制，通过阻断脑脑、小脑和脑干的灌注55，6。6为了保证周围器官充分灌注，在手术过程中必须测量血压。同时用于此目的的导管用于盐水管理，以便通过液体替代来稳定血压。由于BD伴随着自发呼吸的停止，必须确保充足的通风。电热毯能维持生理核心体温。
综上所述，该模型将能深入研究BD诱发损伤的影响、白细胞迁移7、恭维激活8、缺血再灌注损伤9等因素。
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Protocol
动物实验是按照国家医学研究学会制定的《动物实验室护理原则和国家科学院编制、国家卫生研究院出版的实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物第86-23号，1985年修订版）进行的。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部的批准（BMWF-66.011/0071-II/3b/2012）。
1. 动脉导管化
- 根据当地惯例（如丁丙诺啡），用内腹注射氯胺酮和西拉辛10和镇痛剂麻醉小鼠。 用钳子捏住后四肢，以确认麻醉的正确深度。
注：在这项研究中，使用8~12周的男性C57BL/6N小鼠（体重20~25克）。作者测试了同龄的男性BALB/c，但没有成功，但没有尝试过其他菌株（见讨论）。 - 使用电动剃须刀去除感兴趣区域（头部、颈部）的头发。确保不留松发，防止伤口污染。随后用70%乙醇/氯西丁/贝塔丁对手术现场进行消毒，并将小鼠的苏佩放在头部面向外科医生的手术现场。
- 用解剖剪刀做颈椎中线切口。
- 解剖下颌腺和颈部肌肉组织，并分离它们，以暴露常见的胡萝卜动脉。使用主要通过钳子进行钝剖面。
- 放置三个 8-0正确的常见胡萝卜动脉下的丝结扎。
- 在近端连扎上加紧，使动脉张力变大，使水流暂停。
- 关闭最直端的连字。
- 通过切口颅面上的一个小、预先形成的皮肤孔插入动脉导管。如果导管看起来太大，无法减少血液回流，则挤压和变形导管的流明。用所有三个连字固定。
- 将导管固定到皮肤上，以避免脱位。使用缝合线（例如，5-0单丝，不可吸收），将导管连接到预成型皮肤孔区域的皮肤。
2. 气管切除术
- 使用钳子直接切除前气管肌肉。
- 放置两个 8-0气管下的丝绸连扎。
- 尽可能使用微剪刀进行气管化，避免单侧通风。在两个气管软骨之间使用水平切割线。
- 插入通风管，用两个准备好的连字固定。
注：气管的近端不需要加扎。 - 用跑步缝合线关闭皮肤（例如，6-0 单丝，不可吸收）。
- 以 150/分钟的频率和 200 μL 的潮汐体积为鼠标通风。
3. 脑死亡诱导
- 将鼠标排列到易发位置。
- 使用手术剪刀和钳子从头骨上取下皮肤以容纳皮肤。
- 在左皮层上方进行1毫米口径的钻孔。在打破内部紧凑骨骼和杜拉母体之前停止钻孔。
- 用钝力穿透头骨的最终组织桥，去除锋利的边缘。
- 插入气球导管，使其完全位于颅腔内。确保气球预填充盐水，并疏散所有空气。
- 在注射器泵的帮助下，在 10~15 分钟（总体积为 0.8~1.2 mL）内，以 ±0.1 mL/min 开始膨胀。
注：小鼠将表现出肌阵挛，肌阵挛，进一步的癫痫发作活动和前喘。 - 一旦老鼠的尾巴变得僵硬并竖立起来，就宣布老鼠的大脑死亡。
注：BD由典型的初始血压峰值（反射反射）、脑干反射和自发呼吸的缺乏证实。在实验期间应避免定期呼吸暂停测试，因为小鼠可能因缺氧而变得循环不稳定。 - 停止气球导管的膨胀。
- 在鼠标上铺上加热毯，避免体温过低。
4. 在 BD 期间
- 定期监测和记录血压。排除具有长期下压相的小鼠（平均动脉压力 [MAP] < 50 mmHg，持续 30 分钟）。
- 每30分钟注入0.1mL盐水，以稳定小鼠的血压。
注：在本研究中，每只小鼠总共施用0.8 mL的盐水。 - BD持续时间4小时后，收获小鼠器官/组织。如果鼠标的心脏在实验结束时未跳动，则将鼠标从实验中排除。
5. 沙姆程序
- 执行步骤 1.1_3.3。
注：请勿打开内部紧凑骨骼。请勿插入或充气气球导管。 - 靠近老鼠，不断观察动物。反复用钳子捏住后四肢，以确认麻醉的正确深度。如果小鼠出现觉醒迹象，则进行皮下麻醉（大约起始剂量的1/2），根据我们的经验，大约在麻醉后2⁄3小时后发生。
- 应用与BD小鼠相同的静脉盐水。
注：假老鼠在停止通风后将恢复自发呼吸。BD 鼠标不会。在建立模型时应进行呼吸暂停测试，但在实验期间应避免由于不必要的生理压力。
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Representative Results
鼠BD模型成功执行超过100次，成功率超过90%。此外，心肾介入后器官移植已安全进行7项。
BD 诱导各种病理生理学变化，可能使用此模型进一步研究。如图1所示，血压显示初始高血压峰值，然后是长时间的期。为了避免低血压的有害生理影响，排除了血压长期不足的小鼠（MAP < 50 mmHg 超过30分钟）。
另一个公认的观察是BD诱导导致免疫系统的激活。在BD持续时间4小时后，在mRNA水平上观察到免疫标记物的器官特异性调节（图2），以及免疫细胞迁移7。
图1：BD诱导或假程序后平均动脉压力（MAP）的侵入性测量。在BD诱导时，BD动物（白色方块）的血压明显高于假动物（黑色方块），后者通过描述良好的细胞因子风暴来解释;此后，血压水平正常化变得明显，随后出现了从BD诱导90分钟后开始的压力水平下降的时期（n = 19只动物/群 = SD）。通过双向抗功能法和邦费罗尼测试后测试了统计显著差异;[p < 0.01， =p < 0.001.请点击此处查看此图形的较大版本。
图2：BD诱导激活免疫系统，在移植前造成直接器官损伤。我们显示了天然细胞毒性触发受体1（NCR1也是NK-p46）的代表性结果，该结果由于mRNA水平的BD而增加肾脏。肝脏或心脏没有变化。数据以 n = 7+8 动物/组的平均 = SE 表示。使用曼-惠特尼U测试测试了BD和sham之间的统计显著差异;[p = 0.0037.请点击此处查看此图形的较大版本。
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Discussion
BD是多器官捐赠者异体移植质量的危险因素，需要大量的病理生理变化，这些变化只能使用体内模型进行充分评估。血动力学变化、细胞因子风暴、荷尔蒙变化及其对器官移植质量和生存的最终影响不能在体外分析。大多数基础移植和免疫学研究都依赖于复杂的诊断工具，这些工具仅在小鼠模型中广泛提供。小鼠模型已经导致在BD相关研究77，8，98,9中的各种新见解。
在20世纪，BD研究的第一个模型是在11、12,12的猪身上开发的，但直到1996年，第一个大鼠模型被描述为13。又花了14年时间，维也纳集团于2010年6月首次公布了BD的鼠型。虽然每个单独的步骤对于训练有素的微外科医生来说并不具有挑战性，但这里描述的模型仍然很脆弱，可能需要数周时间才能确定。
该协议的关键步骤如下。使用无菌的一次性物品（特别是动脉导管和连接管），以避免不必要的免疫刺激。避免任何失血，因为阶段可能会变得无法控制。使用小管用于血压测量或减少流明，以避免血液回流。固定通风管以及动脉导管，以避免转动鼠标或癫痫发作活动期间错位。井眼不得锋利，不应过大。气球导管应与井眼接触。否则，脑组织可能会突出和阻碍颅内压力的预期升高。在BD期间，稳定地管理静脉输液。如果小鼠在2~3小时后过早出现低血压（MAP < 50 mmHg），额外的液体复苏不太可能持续维持血压。
大多数问题发生在通过气球导管本身的BD感应期间，或在BD期间变得明显。所有不准确之处的常见终点将是尽管流体管理，但低血压。根据血压稳定性，BD 持续时间可以延长或缩短。在文献中，从3~6小时到6-6小时的不同时期已经实现66、7、8。7,8BD 诱导的成功也可能因小鼠菌株而异。虽然小鼠菌株之间的解剖变异应该受到限制，但我们无法在BALB/c小鼠中建立相同的模型。虽然这项努力仅限于少数小鼠，并且没有测试其他菌株，但我们建议使用C57BL/6，这已经用于以前的大多数研究88，9。9作者没有令人满意的解释，为什么模型在BALB/c应变中不起作用。 迄今只有一份出版物展示了使用大型（35克）雌性OF-1小鼠6的BD模型。
总之，此处描述的鼠标模型是研究 BD 引起的多种病理生理变化的宝贵工具。尽管具有挑战性，但模型可以在合理的时间范围内进行优化，以标准化的方式执行，成功率高。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
n.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arterial catheter (BD Neoflon 26G) | BD | 391349 | |
| Blood Pressure Transducers (APT300) | Harvard Apparatus Inc. | 73-3862 | |
| Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N° 3 | Edwards Lifesciences Corporation | 120403F | |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe | Harvard Apparatus Inc. | 55-7020 | |
| Ketansol | Graeub | 6680110 | |
| Micro scissor | FST | 15018-10 | |
| Needle holder | FST | 12060-02 | |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8698H | |
| Pump 11 Elite Infusion Only Single | Harvard Apparatus Inc. | 70-4500 | |
| Scissor | FST | 14075-11 | |
| Stereotactic microscope | Olympus | SZX7 | |
| Transpore Tape | 3M | 1527-1 | |
| Underpads | Molinea.A | 274301 | |
| Ventilator for mice (MiniVent Model 845) | Harvard Apparatus Inc. | 73-0043 | |
| Xylasol | Graeub | 7630109 |
References
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