Summary
本文展示了一种用于纯化寡核苷酸物和生产寡核苷酸调节介质的有效方法，可用于共培养实验。
Abstract
在中枢神经系统中，寡核苷酸以其在轴向髓中的作用而闻名，通过盐性传导加速作用电位的传播。此外，越来越多的报告表明，寡核苷酸与神经元在骨髓外相互作用，特别是通过可溶性因子的分泌。在这里，我们提出了一个详细的协议，允许从胶质细胞培养物中也含有星形细胞和微胶质细胞的寡核体系细胞进行纯化。该方法依赖于在37°C处过夜摇动，这允许选择性地分离上覆的寡核瘤细胞和微胶质细胞，并通过差分粘附消除微胶质。然后，我们描述了寡核苷酸的培养物和寡核苷酸条件介质（OCM）的生产。我们还在共培养实验中提供OCM治疗或寡核苷酸的动力学，以及纯化海马神经元，研究寡核苷酸-神经元相互作用。
Introduction
寡核苷酸（OLs）是中枢神经系统（CNS）的胶质细胞，产生围绕轴xon的骨髓素。OLs源自寡核苷酸前体细胞（OPCs），在胚胎中枢神经系统的心室区增殖，然后迁移和分化成完全成熟的OLs（即骨髓形成细胞）1。OPCs在早期发育期间是丰富的，但也坚持在成人大脑中，在那里他们代表主要的增殖细胞群2。单个 OL 在非兴奋部分（即节点间）中产生多个阳极，并且每个骨髓环的边缘附着在构成参数域的斧子上，这对骨髓素1、3的绝缘特性至关重要。在副节点之间是称为Ranvier节点的未骨髓间隙。这些节点富含电压门控钠通道（Nav），允许通过盐性传导4再生和快速传播作用电位。这种紧密的相互作用也使得斧道能量支持通过神经元从OLs5，6的乳酸盐。
寡核苷酸系细胞的成熟和骨髓过程由它们与神经元的相互作用7严格调节。事实上，OLs和OPCs，也叫NG2细胞，表达神经递质的受体阵列，并能接收兴奋和抑制神经元的输入，使它们能够感知神经元活动，可以触发其增殖和/或分化到骨髓细胞2。反过来，OPCs/OP将微囊和蛋白质分泌到细胞外空间，单独或协同地介导神经调节和神经保护功能8，9，10，11，12。然而，控制寡核遗传细胞和神经元之间多种相互作用模式的分子机制尚未完全破译。
此外，在几个CNS病理条件下，OLs主要受到影响，从而干扰它们与神经元的相互作用。例如，在多发性硬化症 （MS） 中，神经功能障碍是由中枢神经系统中的焦脱髓引起，其次是 OLs 损失，可导致斧道损伤和相关残疾积累。重组可以发生，尽管在大多数情况下还不够。过去十年的进展，由于免疫疗法的发展，已经降低了复发率，但促进再骨髓化至今仍是一个未满足的需求。因此，更好地了解OLs的作用、功能和影响对于开发针对各种CNS条件的新疗法特别感兴趣。
在这里，我们描述了OLs纯化和培养的方法。这使得能够精确检查调节其发展和生物学的内在机制。此外，这种高度丰富的OLs培养物允许生产寡核苷酸条件介质（OCM），这种介质可以添加到纯化神经元培养物中，从而深入了解OLs分泌因子对神经元生理学和连通性的影响。此外，我们描述了如何实现一个体外共培养系统，其中纯化的寡核苷酸和神经元结合在一起，允许解决调节（再）髓化的机制。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本实验中对大鼠的护理和使用符合机构政策和准则（UPMC、INSERM和欧洲共同体理事会指令86/609/EEC）。以下协议是为12只幼崽的标准垃圾建立的。
1. 烧瓶的准备（±5分钟）
注：在无菌条件下在层流罩中进行解剖的前一天执行以下步骤。
- 使用 5 mL 的聚乙烯胺（PEI，100 mg/L，参见补充文件 1中的协议）涂上 150 厘米2瓶 （T150） 与过滤帽（1 瓶，用于 2 只小狗）。
- 将烧瓶储存在4°C处过夜。
- 在解剖当天用无菌蒸馏水冲洗涂覆烧瓶3次。
2. 介质的准备（约10分钟）
注：在无菌条件下在层流罩中执行步骤。
- 制备500 mL培养基，包括Dulbecco的改性鹰培养基（DMEM），辅以10%的胎儿小牛血清（FCS）和青霉素链霉素（100 IU/mL）。
- 在50 mL管中制备20.6 mL的酶消化介质，包括20 mL的DMEM、200 μL的DNase（50μg/mL）、200 μL的木瓜（30 U/mL）和200 μL-半胱氨酸（0.24毫克/mL）。
- 使用 0.22 μm 过滤器对介质进行过滤消毒。
- 将介质保持在室温 （RT） 下层流罩中的介质，直到解剖。
3. 解剖准备（约10分钟）
注：在无菌条件下在层流罩中执行步骤。
- 在不带钙和镁的情况下制备100 mL的磷酸盐缓冲盐水（PBS;1x）。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。
- 准备50 mL的冰冷1x PBS溶液，辅以750μL45%葡萄糖。使用 0.22 μm 过滤器进行过滤灭菌。
- 将 100 mm 培养皿与 1x PBS 填充，用于清洁仪器和三个 60 mm 培养皿，并带有冰冷的 PBS-葡萄糖，用于组织采集。将培养皿放在冰上，直到解剖。
4. 解剖
注：解剖从男性和女性的威斯塔大鼠幼崽在产后天（P）2。
- 为了提供无菌环境，请确保用 100% 乙醇清洁工作台。用100%乙醇消毒所有手术工具。
- 用70%乙醇轻轻喷洒小狗的脖子。
- 使用大型手术剪刀将动物斩首，并将头部放入含有冰冷PBS-葡萄糖的100毫米培养皿中。
- 使用弯曲的钳子将动物的头部保持在眼睛水平。使用小手术剪刀在头骨底部做一个小切口，并切下脑中线后的头骨。
- 使用钳子轻轻地从中线剥离头骨的两个部分。
- 使用小手术勺将大脑从头腔中取出。将大脑放入含有冰冷PBS-葡萄糖的60毫米培养皿中。
- 在显微镜下观察时，使用细钳去除脑小脑、脑干和脑球状球。
- 使用细钳来分离两个脑半球。使用细钳去皮。将脑皮质放入 60 毫米培养皿中放在冰上。
注： 冰冷的 PBS 对于正确去除脑膜炎至关重要。
5. 组织分离
注：在无菌条件下在层流罩中执行步骤。
- 使用锋利的手术刀细切脑皮。将切碎的组织转移到含有酶消化培养基的50 mL管中。
- 在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育30分钟。
- 使用 p1000 微移液器轻轻去除酶消化介质，同时确保皮质组织保持在 50 mL 管的底部。
- 使用 p1000 微移液器添加 1 mL 的 DMEM-10% FCS，并轻轻对组织进行三聚。
- 使用 70 μm 过滤器和 1 mL 注射器的活塞将皮质组织过滤到 50 mL 管中。
注：使用 DMEM-10% FCS 可以冲洗内管壁上的残余组织多次。 - 用 DMEM-10% FCS 填充 50 mL 管。在 RT 下以 423 x g离心 5 分钟，小心地去除上清液，用 2 mL 的 DMEM-10%FCS 重新悬浮细胞颗粒。
- 用p1000微移液器轻轻三聚细胞颗粒，然后用p200微移液器轻轻三聚。用适当的 DMEM-10%FCS 体积稀释细胞悬浮液。
注： 两个大脑 = 一个 T150 = 5 mL 的 DMEM-10%FCS。 - 板 5 mL 的细胞悬浮在 T150 上的密度为 1 x 105细胞/cm2。在每个 T150 中添加 20 mL 的暖 DMEM-10% FCS。在37°C以下的5%CO2下孵育。
- 在6天体外（DIV）后，用温暖的DMEM-10%FCS更新一半的培养基。
6. 摇动准备
- 在无菌条件下在层流罩中摇动前一天进行摇动准备。
- 通过在烧瓶中加入新鲜的温文化介质，在37°C下孵育5%CO2，更新一半的培养基。
7. 摇动
- 与 PEI 一起涂上三个 100 mm 培养皿。将它们储存在4°C过夜。
- 用石蜡薄膜盖住烧瓶盖，并将烧瓶放入塑料袋中。在37°C下，在250rpm下摇动含有胶质细胞的烧瓶过夜。
注： 第一次晃动在 8 DIV 处执行，一个可以执行最多三个不同的抖动（有关计时，参见图 1）。
8. OL系系细胞收获和培养
注：这些步骤应在无菌条件下在层流罩中执行。
- 在震动后的第二天，根据表1准备博滕斯坦-萨托（BS）介质。
- 用无菌蒸馏水冲洗涂覆的培养皿3次。
- 收获瓶的上清液主要含有OL系系细胞，但也含有一些微胶质细胞，并将其盘在非涂层的100毫米培养皿上。
注：此步骤允许通过在盘表面的差分快速粘附来去除微胶质细胞。 - 在37°C下5%CO2的加湿培养箱中孵育培养15分钟。
- 将每个T150烧瓶填充25 mL的新鲜制备的培养基，并在37°C的加湿培养箱中孵育，在5%CO2下孵育，直到第二次晃动。
- 将上清液从培养皿转移到新的非涂层 100 mm 培养皿中，以允许残留微胶质细胞粘附。
- 在37°C下5%CO2的加湿培养箱中孵育培养15分钟。
- 去除含有非粘附性OL谱系细胞的上清液，并将其转移到50 mL管中（50 mL管的2个培养皿中上清液）。丢弃用微胶质镀的培养皿。
- 在423 x g下将上清液离心5分钟。小心地去除上清液，用1mL的BS培养基重新悬浮细胞颗粒。将所有颗粒汇集在一个公共的 50 mL 管中，使用 BS 介质将体积调节到 10 mL。
- 确定显微镜下的细胞密度计数细胞。
注： 应获得介于 3 x 105/mL 和 5 x 105/mL 之间的单元密度。 - 如果细胞密度高于或等于 4 x 105/mL，则添加 20 mL 的 BS，以获得 30 mL 的最终体积;如果细胞密度小于 4 x 105/mL，则仅添加 10 mL 的 BS，以获得 20 mL 的最终体积。
- 板 2 或 3 预涂 100 mm 培养皿，带 10 mL 的细胞悬浮液。在37°C以下的5%CO2下孵育。
- 清除培养皿中的碎片，在 2 小时后刷新所有 BS 介质。
注：在清除前后检查显微镜下的培养物，以验证细胞密度和碎片清除效率。 - 在37°C下5%CO2的加湿培养箱中孵育2天。
注：在显微镜下检查培养。汇合应为 70% 到 80%。
9. OCM 生产
注：在无菌条件下，在层流罩中执行这些步骤。
- 根据表2准备NB-B27低介质。
- 使用 10 mL 的热 NB-B27low 介质更新培养基。在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育2天。
- 收获OCM，即含有OL分泌因子的上清液。使用 0.22 μm 过滤器对 OCM 进行过滤消毒。
注：将 OCM 储存在 4°C 下，最多存放 2 个月。
10. OCM 添加
注：步骤应在无菌条件下在层流罩中执行。OCM可添加到根据以下协议14制备的纯化海马神经元培养物中，并在分离后24小时添加抗米质剂尿氨酸和5-氟氧尿氨酸（5μM）36小时。
- 在3DIV时，去除所有含有抗线粒剂的神经元培养基，并加入500μL的新鲜热OCM。
- 每3天更新一半的介质，用新鲜制作的热NB-B27。
注：此类区域性可维护多达 21 DIV。
11. 在纯化海马神经元培养中添加OL
注：在无菌条件下，在层流罩中执行以下步骤。OLs 可以添加到纯化海马培养物中，获得的方式与上述相同。
- 根据表3准备共同培养媒介。
- 在 70% 到 80% 的汇合处检索 OL 培养体。用 2 mL 的 1x 热 PBS 冲洗。
- 要分离细胞，将 2 mL 0.25% 胰蛋白酶添加到 100 mm 培养皿中。
- 在37°C下5%CO2下在加湿培养箱中孵育5分钟。
- 加入2 mL的DMEM-10%FCS以阻止酶反应。收获含有OL系系细胞的上清液。
- 在RT下以423 x g离心5分钟。小心地去除上清液，并在温暖的共培养基培养基中重新悬浮细胞颗粒，以获得1.25 x 105细胞/mL的浓度。
- 通过去除200μL的神经元培养基，并在24孔板每孔（2.5 x 104细胞/孔）添加200μL细胞悬浮液，为纯化的海马神经元培养添加OL。
- 每2-3天刷新一半的共同培养媒介。
注： 共培养可以维护多达 24 DIV。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在此协议中，OL系系细胞通过摆脱星形细胞和微胶质从胶质培养中纯化。对OL培养物的纯度和质型检查可以通过用胶质标记物进行免疫染色来评估。对不同标记物表达的分析表明，OL培养物大多是O4+细胞的90%~4%，85%~7%NG2+细胞，4.7%~2.1%的PLP+细胞，7.2%~2.5%的细胞为GFAP+星细胞（均值=S.D.，n= 3; 图 2.此外，4.6% ~ 0.7% 的细胞为 CD11b+微胶质细胞（均值 = S.D.，未显示）。
从这些培养物产生的OCM可以在3DIV中加入到纯化海马神经元培养物中。这种治疗促进节点蛋白的聚类，包括与神经法辛186和Ankyrin G相关的Nav通道，沿着海马的Axon在骨髓前，在17 DIV（图3A，B）。值得注意的是，电生理记录显示，这些簇与运动电位14的传导增加有关。此外，在OCM处理的海马神经元中，磷酸化中间丝蛋白H的表达增加（图3A）。因此，寡核分泌因子与神经元成熟和生理有关。
海马神经元的骨髓可以通过在14 DIV中添加OL来研究。从 20 DIV 到 24 DIV，骨髓标记物的免疫染色，如骨髓基本蛋白 （MBP） 允许骨髓段的可视化（图4）。
图1：OL系系细胞分离和OCM生产的协议时间线。解剖P2 Wistar大鼠的脑皮质（步骤4）后，对培养胶质细胞进行组织分离（步骤5）。在 8、12 和 15 DIV（即晃动前数天）时，使用温暖的 DMEM-10% FCS（步骤 6）续订半介质。第二天，在 37°C（步骤 7.2）下，在 250 rpm 下摇动胶质培养物过夜。在37°C下5%CO2（步骤8.3至8.7）下，在37°C下收集含有OL系系细胞和很少微胶质细胞的上清液，并在加湿培养箱中盘15分钟。在423 x g下将上清液离心5分钟，用BS重新悬浮细胞颗粒，并在37°C的加湿培养箱中孵育2天，在5%CO2（步骤8.8至8.12）下孵化2天。要生产OCM，在NB-B27low（步骤9）中孵育2天。要分离用于共培养实验的URL，请使用胰蛋白酶分离细胞（步骤11.3）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：醇系细胞在培养物中的表型。使用共聚焦显微镜获取图像。提供最大强度投影。（A） OL 培养体主要包含预 OL（即仅表示 NG2（红色）或 O4（绿色）和 NG2（红色）;表示两个标记的单元格用黄色星表示），但也包含一些未成熟的 OL（即仅表示 O4 而不是 NG2;白星）。（B） 在 OL 系系细胞培养中很少发现成熟的 OL（即 PLP+; 绿色）和很少的星形细胞（GFAP+细胞;红色）。比例尺 = 25 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3：代表性应用程序。（A，B）在3DIV处用OCM处理并固定在17DIV的海马神经元，表达磷酸化中间丝蛋白H（Smi31;绿色;面板A）。GABAergic神经元，由谷氨酸脱血酶异构体67 kDa （GAD67） 表达 （白色） 识别，显示在斧头初始段的 Ankyrin G 和 Nav钠通道（分别为红色;面板 A 和 B）的显示积累，并沿其斧头形成 Ankyrin G 和 Nav簇（面板 A 和 B）。比例尺 = 25 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4：代表性应用程序。OL系系细胞添加到海马神经元培养在14 DIV骨髓一些海马斧突，这里固定在23 DIV（MBP作为骨髓标记;绿色）。在骨髓段之间观察到Ranvier（Nav;红色）的节点。比例尺 = 25 μm.请点击此处查看此图的较大版本。
| 博滕斯坦-萨托 （BS） 媒体 | 最终浓度 |
| 杜尔贝科的改良鹰介质 | |
| 青霉素-链霉素 | 100 IU/mL |
| 阿波-转移人类 | 100 μg/mL |
| BSA（牛血清白蛋白） | 100 μg/mL |
| 胰岛素 | 5 μg/mL |
| Pdgf | 10 纳克/千米 |
| 孕 激素 | 62 纳克/升 |
| 二盐酸普辛 | 16 μg/mL |
| 硅酸钠 | 40 纳克/升 |
| T3 （3，3'，5-三聚氰酸钠盐） | 30 纳克/升 |
| T4 （L-甲状腺素） | 40 纳克/升 |
表1：博滕斯坦-萨托（BS）介质的准备。
| NB-B27 低介质 | 最终浓度 |
| 神经巴沙 | |
| B27 补充 | 0.5 倍 |
| L-谷氨酰胺 | 0.5 mM |
| 青霉素-链霉素 | 100 IU/mL |
| NB-B27 介质 | 最终浓度 |
| 神经巴沙 | |
| B27 补充 | 1x |
| L-谷氨酰胺 | 0.5 mM |
| 青霉素-链霉素 | 100 IU/mL |
表2：NB-B27low和NB-B27介质的准备。
| 共同文化媒体 | 最终浓度 |
| 杜尔贝科的改良鹰介质 | 1 卷 |
| 神经巴沙 | 1 卷 |
| B27 补充 | 1x |
| 青霉素-链霉素 | 100 IU/mL |
| 阿波-转移人类 | 50 μg/mL |
| 素 | 10 纳克/千米 |
| BSA（牛血清白蛋白） | 50 μg/mL |
| 塞洛黄原体 | 100 纳克/升 |
| 氢皮质酮 | 0.05 μM |
| 胰岛素 | 5 μg/mL |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | 5 μg/mL |
| 孕 激素 | 6.2 纳克/升 |
| 普特雷辛 | 16 μg/mL |
| 重组人类CNTF | 0.1 纳克/升 |
| 硅酸钠 | 5 纳克/升 |
| T3 （3，3'，5-三聚氰酸钠盐） | 40 纳克/升 |
| 维生素B12 | 27.2 纳克/升 |
表3：共同文化媒体的准备。
补充文件1。请点击此处查看此文件（右键单击下载）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这里，我们提供了一个详细的协议，以获得高度丰富的寡核苷酸细胞培养从混合胶质培养，改编自以前出版的方法16，并随后生产OL条件介质。这种摇动技术不贵，可重复三次，是获得高量纯化OL的最佳方法，因为在含有PDGF®的博滕斯坦-萨托（BS）培养的细胞中培养。胶质细胞是在P2时使用威斯塔大鼠的脑皮质制备的，此时绝大多数的寡核瘤系细胞是表达NG2和O415的预寡核苷酸细胞。值得注意的是，OL系成熟在小鼠和大鼠的P2中相似，该协议也可用于分离小鼠前核苷酸细胞17。
在摇动混合胶质细胞培养物后，分离细胞主要由寡核苷酸系细胞组成，但也包括一些微胶质细胞和少数星形细胞。微胶质细胞通过在未涂布的培养皿上的差分粘附去除。值得注意的是，通过执行额外的粘附步骤，可以提高去除效率。然而，大约5%的微胶质细胞仍然存在于丰富的寡核细胞培养物中，以及5%至9%的星形细胞。通过使用 O4 抗体涂层培养皿执行额外的免疫平移步骤，有可能将星形细胞的污染降低到 5% 以下;有关详细协议，请参阅弗里曼等人第14号的补充信息。电镀寡核胶细胞后2小时清除碎屑是一个关键步骤，它依赖于与移液器一起施加的流量强度。在此步骤中，在清除之前和之后检查显微镜下的培养物，以验证效率，因为存在过多的碎屑可能会损害细胞的存活和生长。值得注意的是，使用新鲜制造的BS介质也很重要，否则可能会改变寡核苷酸的存活率。此外，纯化细胞在电镀后仅存活6天。事实上，众所周知，其他胶质细胞和神经元通过分泌因子或直接接触2，18促进OPC生存和增殖或分化。
其他方法允许在大脑分离后立即分离OLs，使用带有O4抗体的免疫标签，然后通过流式细胞测定（FACS）或磁活细胞分选（MACS）对荧光激活细胞进行分类。此外，GFP阳性OPCs或GFP阳性寡核苷酸细胞可以通过荧光活性细胞从PDGF_R：GFP或PLP：GFP小鼠，分别19，20进行纯化。与治疗生长因子的培养物相比，这些分拣方法更适用于研究寡核苷酸物质的生理状态，而生长因子可以改变其表型。值得注意的是，荧光活化细胞分拣已用于在正常生理状态和脱骨髓条件下的基因分析方法21。由于细胞存活率可以通过细胞分拣改变，因此最好在分拣后立即进行功能性检测。
我们已经表明，OL培养物可以分离，并添加到纯化海马神经元培养在14 DIV。这种OL-神经元共培养允许研究骨髓的早期步骤，从共同培养的第一周开始（Dubesy，未发表的结果）。OL-海马神经元骨髓共培养的其他模型已经通过在排序22、23后立即添加寡核苷酸细胞来实现。此外，我们制作了OCM来进一步剖析OL-神经元相互作用，并解决OL分泌因子在神经元培养中的作用。通过使用这一技术，我们证明了海马GABAergic神经元亚型（即，帕夫巴平和/或索马他汀+）可以形成沿其斧突的节点蛋白，这是由OCM在骨髓14、24之前诱导的。OCM的质谱分析已经解开了几种分泌的蛋白质，并导致了寡核结胶接触蛋白-1的鉴定，该蛋白与细胞外基质蛋白协同作用，调解了节点聚类24的早期步骤。初级培养物是有用的模型，允许评估寡核苷酸细胞分化和与神经元的相互作用。然而，其他方法也已经开发，以评估OL功能和骨髓，脱骨髓和再骨髓从前体小脑细胞切片培养25，26，并在体内研究，特别是斑马鱼和斑马模型27，这是需要临床前研究的最后步骤。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者中没有一个存在相互竞争的利益或相互冲突的利益。
Acknowledgments
作者要感谢雷米·朗扎诺在手稿编辑方面明智的建议。这项工作由ICM、INSERM、ARSEP基金会向NSF提供赠款和布韦特-拉布鲁耶尔价格资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
