Summary
Häri visar vi en effektiv metod för rening av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium som kan användas för samkulturexperiment.
Abstract
I det centrala nervsystemet är oligodendrocyter kända för sin roll i axonmyelination, som påskyndar spridningen av åtgärder potentialer genom saltatory resistiv. Dessutom tyder ett ökande antal rapporter på att oligodendrocyter interagerar med nervceller bortom myelination, särskilt genom utsöndringen av lösliga faktorer. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som tillåter rening av oligodendroglial härstamning celler från gliaceller kulturer som också innehåller astrocyter och mikrogliala celler. Metoden bygger på att över natten skaka vid 37 °C, vilket möjliggör selektiv avskildhet av de överliggande oligodendroglialcellerna och mikrogliacellerna, och eliminering av mikroglia genom differentialvidhäftning. Vi beskriver sedan kulturen av oligodendrocyter och produktion av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM). Vi tillhandahåller också kinetik av OCM behandling eller oligodendrocytes tillägg till renade hippocampus nervceller i co-kultur experiment, studera oligodendrocyte-neuron interaktioner.
Introduction
Oligodendrocytes (OLs) är gliaceller i centrala nervsystemet (CNS) som genererar myelin inslagning runt axoner. Oem-filer härstammar från oligodendrocyte prekursorceller (OPCs) som förökar sig inom ventrikulärt zoner i embryonala CNS och sedan migrera och differentiera till helt mogna OP (dvs. myelinbildande celler)1. Opcs är rikliga under tidig utveckling, men också kvarstår i den vuxna hjärnan där de representerar den stora proliferativecellpopulationen 2. En enda OL ensheathes flera axoner i icke-retbara sektioner (dvs. internoder), och kanten på varje myelin slinga fäster vid axon bildar paranodal domän som är avgörande för isolerande egenskaper myelin1,3. Mellan paranoderna finns små omyelinerade luckor som kallas noderna i Ranvier. Dessa noder är rika på spänningsgated natriumkanaler (Nav), vilket möjliggör regenerering och snabb spridning av åtgärder potentialer genom saltatory conduction4. Denna snäva interaktion möjliggör också axonal energi stöd genom neuronal upptag av laktat från OLs5,6.
Mognaden av oligodendroglial härstamning celler och myelinationprocessen är tätt regleras av deras interaktioner med nervceller7. Faktum är att OPOch och OPCs, även namngivna NG2-celler, uttrycka en rad receptorer för signalsubstanser, och kan få input från excitatoriska och hämmande nervceller, så att de kan känna neuronal aktivitet som kan utlösa deras spridning och / eller differentiering i myelinating celler2. I sin tur utsöndrar OPCs/OLs mikrovesicles och proteiner i det extracellulära utrymmet som ensam eller synergistiskt medla neuromodulativa och nervskyddande funktioner8,9,10,11,12. Emellertid, de molekylära mekanismer som styr flera typer av interaktioner mellan oligodendroglial härstamning celler och nervceller är ännu inte helt dechiffreras.
Dessutom, i flera CNS patologiska tillstånd, OEM påverkas främst, vilket stör deras interaktion med nervceller. Till exempel, i multipel skleros (MS), neurologisk dysfunktion orsakas av fokal demyelination i CNS, sekundär till OLs förlust som kan leda till axonal skada och relaterade funktionshinder ackumulering. Remyelination kan ske, om än inte tillräckligt i de flesta fall13. Framsteg under det senaste årtiondet, på grund av utvecklingen av immunterapier, har minskat återfallsfrekvensen, men att främja remyelination är hittills ett otillfredsställt behov. Som sådan är en bättre förståelse av OEM-faktorer, funktioner och influenser av särskilt intresse för utvecklingen av nya terapier för ett brett spektrum av CNS-villkor.
Här beskriver vi metoderna för ATT förena och kultur. Detta möjliggör exakt undersökning av inneboende mekanismer som reglerar deras utveckling och biologi. Dessutom tillåter sådana starkt berikade OEM-kulturer produktionen av oligodendrocyte-konditionerat medium (OCM), som kan läggas till renade neuronkulturer för att få insikt i effekterna av OLs-utsöndrade faktorer på neuronal fysiologi och anslutning. Dessutom beskriver vi hur man genomför ett in vitro-samkultursystem där renade oligodendrocyter och nervceller kombineras tillsammans, vilket gör det möjligt att ta itu med de mekanismer som reglerar (re)myelination.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Omsorg en och användning av råttor i detta experiment överensstämmer med institutionell politik och riktlinjer (UPMC, INSERM och Europeiska rådets direktiv 86/609/EEG). Följande protokoll fastställs för en standardkull på 12 valpar.
1. Beredning av kolvarna (~5 min)
OBS: Utför följande steg dagen före dissekering i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Täck de 150 cm2 kolvarna (T150) med filterlock (1 kolv för 2 valpar) med 5 ml polyetomimin (PEI, 100 mg/L, se protokoll i tilläggsfil 1).
- Förvara kolvarna vid 4 °C över natten.
- Skölj debelagda kolverna 3 gånger med sterilt destillerat vatten på dissekeringsdagen.
2. Förberedelse av media (~10 min)
OBS: Utför stegen i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Förbered 500 ml odlingsmedium, bestående av Dulbeccos modifierade Eagle medium (DMEM) kompletterat med 10% av fetala kalvserum (FCS) och penicillin-streptomycin (100 IU/mL).
- Förbered 20,6 ml enzymnedbrytningsmedium i ett 50 ml-rör, bestående av 20 ml DMEM, 200 μL DNase (50 μg/ml), 200 μL papain (30 U/mL) och 200 μL L-cystein (0,24 mg/ml).
- Filtrera-sterilisera mediet med ett 0,22 μm filter.
- Håll media i laminarflödeshuven vid rumstemperatur (RT) tills dissekering.
3. Förberedelse för dissekering (~10 min)
OBS: Utför stegen i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Förbered 100 ml fosfatbuffrad saline utan kalcium och magnesium (PBS; 1x). Filtrera-sterilisera med ett 0,22 μm filter.
- Förbered 50 ml iskallt 1x PBS-lösning kompletterat med 750 μL 45% glukos. Filtrera-sterilisera med ett 0,22 μm filter.
- Fyll en 100 mm Petri skål med 1x PBS för rengöringsinstrument och tre 60 mm Petrirätter med iskall PBS-glukos för vävnadsskörd. Lägg petriskålarna på is tilldissekering.
4. Dissekering
OBS: Dissekering utförs från manliga och kvinnliga Wistar råtta valpar på postnatal dag (P) 2.
- För att ge en steril miljö, se till att rengöra bänken med 100% etanol. Sterilisera alla kirurgiska verktyg med 100% etanol.
- Spraya försiktigt halsen på valpen med 70% etanol.
- Använd stora kirurgiska saxar för att halshugga djuret och placera huvudet i en 100 mm Petri maträtt som innehåller iskall PBS-glukos.
- Använd böjda pincett för att bibehålla djurets huvud i ögonhöjd. Använd små kirurgiska saxar för att göra ett litet snitt vid basen av skallen och skär skallen efter hjärnan mittlinjen.
- Använd pincett för att försiktigt skala av de två delarna av skallen från mittlinjen.
- Använd en liten kirurgisk sked för att ta bort hjärnan från huvudet hålighet. Lägg hjärnan i en 60 mm Petri maträtt som innehåller iskall PBS-glukos på is.
- Visning under ett steromikroskop, använd fina pincett för att ta bort lillhjärnan, hjärnstammen och luktlökar från hjärnhalvor.
- Använd fina pincett för att separera de två hjärnhalvorna. Använd fina pincett för att skala av hjärnhinnorna. Lägg cerebrala kortiklar i en 60 mm-petriskål på is.
OBS: Iskall PBS är avgörande för korrekt meninges borttagning.
5. Vävnadsdissociation
OBS: Utför stegen i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Använd en skarp skalpell för att finhacka cerebrala kortiklar. Överför den malet vävnaden till ett 50 ml-rör som innehåller enzymnedbrytningsmedium.
- Inkubera i 30 min i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Använd en p1000 micropipette för att försiktigt ta bort enzymmatsmältningsmediet samtidigt som man ser till att den närvävnaden finns kvar på botten av 50 ml-röret.
- Använd en p1000 micropipette för att lägga till 1 ml DMEM-10% FCS och triturate försiktigt vävnaden.
- Använd ett 70 μmfilter och en kolv av en 1 ml spruta för att filtrera kortvävnaden till ett 50 ml-rör.
OBS: Man kan skölja restvävnad på innerrörsväggen flera gånger med DMEM-10% FCS. - Fyll 50 ml-röret med DMEM-10%FCS. Centrifugera vid 423 x g i 5 min på RT. Ta försiktigt bort supernatant och resuspend cell pellet med 2 ml DMEM-10%FCS.
- Triturate försiktigt cellpellet med p1000 micropipette och sedan med en p200 micropipette. Späd cellsuspensionen med lämplig volym dmem-10%FCS.
OBS: Två hjärnor = en T150 = 5 ml DMEM-10%FCS. - Platta 5 ml av cellsuspensionen på en T150 vid en densitet av 1 x 105 celler/cm2. Lägg till 20 ml varm DMEM-10%FCS till varje T150. Inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Förnya hälften av kulturmediet efter 6 dagar in vitro (DIV) med varma DMEM-10%FCS.
6. Skakningar förberedelse
- Utför skakningsberedning dagen innan du skakar i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Förnya hälften av odlingsmediet genom att tillsätta färskt varmt odlingsmedium i kolven och inkubera vid 37 °C under 5 % CO2.
7. Skakningar
- Täck tre 100 mm Petrirätter med PEI. Förvara dem vid 4 °C över natten.
- Täck kolvlocket med paraffinfilm och lägg kolvarna i en plastpåse. Skaka kolvar som innehåller gliaceller över natten vid 250 rpm vid 37 °C.
OBS: Första skakningar utförs vid 8 DIV och man kan utföra upp till tre olika skakningar (se figur 1 för timing).
8. OL härstamning celler skörd och kultur
OBS: Dessa steg bör utföras i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Dagen efter skakningar, förbereda Bottenstein-Sato (BS) medium enligt tabell 1.
- Skölj belagda Petriskålar 3 gånger med sterilt destillerat vatten.
- Skörda kolvarnas supernatant som huvudsakligen innehåller OL härstamningsceller men också vissa mikrogliala celler och platta den på icke-belagda 100 mm Petrirätter.
OBS: Detta steg gör det möjligt att avlägsna mikrogliala celler genom differentialsnabb vidhäftning på skålen ytan. - Inkubera Petrirätterna i 15 min i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Fyll varje T150 kolv med 25 ml varmt nyförberett odlingsmedium och inkubera i en befuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2 tills den andra skakningen.
- Överför supernatanten från Petrirätterna till nya icke-belagda 100 mm Petri-rätter för att möjliggöra vidhäftning av kvarvarande mikrogliala celler.
- Inkubera Petrirätterna i 15 min i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Ta bort supernatant, som innehåller icke-anhängare OL härstamning celler, och överföra den till 50 ml rör (supernatant från 2 Petri rätter för en 50 ml rör). Kasta Petri rätter pläterade med mikroglia.
- Centrifugera supernatanten i 5 min vid 423 x g. Ta försiktigt bort supernatant och resuspend cell pellet med 1 ml BS medium. Pool alla pellets i ett vanligt 50 ml-rör och justera volymen till 10 ml med BS medium.
- Bestäm celldensitetsräkningsceller under ett mikroskop.
OBS: En celldensitet mellan 3 x 105/ml och 5 x 105/ml ska erhållas. - Lägg till 20 ml BS om celltätheten är högre än eller lika med 4 x 105/ml för att få en slutlig volym på 30 ml, eller lägg till endast 10 ml BS om celltätheten är mindre än 4 x 105/ml för att få en slutlig volym på 20 ml.
- Platta två eller tre förbelagda 100 mm Petrirätter med 10 ml cellfjädring. Inkubera i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Rensa skräp från Petri rätter genom att uppdatera alla BS medium 2 h senare.
OBS: Undersök kulturen under mikroskopföre och efter clearing för att kontrollera celltäthet och effektivitet skräp borttagning. - Inkubera i 2 dagar i BS medium i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2.
OBS: Undersök kulturen under mikroskopet. Sammanflödet bör vara 70% till 80%.
9. OCM produktion
OBS: Utför dessa steg i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden.
- Förbered NB-B27low medium enligt tabell 2.
- Förnya kulturmedium med 10 ml varmt NB-B27low medium. Inkubera i 2 dagar i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Skörda OCM, dvs supernatant innehållande OL utsöndrade faktorer. Filtrera-sterilisera OCM med hjälp av ett 0,22 μm filter.
OBS: Förvara OCM vid 4 °C i högst 2 månader.
10. OCM tillägg
OBS: Steg bör utföras i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden. OCM kan läggas till renade hippocampus neuron kulturer beredda enligt följande protokoll14, och erhålls genom att lägga till, 24 h efter isolering, anti-mitotic agents uridin och 5- fluoroxyuridine (5 μM) för 36 h.
- Vid 3 DIV, ta bort alla neuron odlingsmedium som innehåller antimitotiska medel och tillsätt 500 μl färsk varm OCM.
- Förnya hälften av mediet var tredje dag med nygjord varm NB-B27.
OBS: Sådana kulturer kan upprätthållas upp till 21 DIV.
11. Tillägg av OL till renad hippocampus neuron kultur
OBS: Utför följande steg i en laminarflödeshuva under sterila förhållanden. OLs kan läggas till renade hippocampus kulturer erhålls på samma sätt som beskrivs ovan.
- Förbered samodlingsmedium enligt tabell 3.
- Hämta OL-kulturen på 70% till 80% sammanflödet. Skölj med 2 ml varm 1x PBS.
- För att lossa cellerna, tillsätt 2 ml 0,25% trypsin till en 100 mm Petri maträtt.
- Inkubera i 5 min i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5 % CO2.
- Lägg till 2 ml DMEM-10% FCS för att blockera den enzymatiska reaktionen. Skörda supernatanten som innehåller OL-härstamningsceller.
- Centrifugera vid 423 x g i 5 min på RT. Ta försiktigt bort supernatant och resuspend cellpelleten i varmt co-culture medium för att få en koncentration på 1,25 x 105 celler/ml.
- Tillsätt OL till renad hippocampus nervceller kultur genom att ta bort 200 μL av neuron odling medium och lägga 200 μL cellsuspension per brunn (2,5 x 104 celler/ brunn) av en 24-brunn tallrik.
- Uppdatera hälften av samodlingsmediet var 2-3:e dag.
OBS: Samkulturer kan upprätthållas upp till 24 DIV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I detta protokoll renas OL härstamningsceller från gliakulturer genom att skaka av astrocyter och mikroglia. Renhet och fenotypisk undersökning av OL kulturer kan bedömas genom immunfärgning med gliamarkörer15. Analys av uttrycket av olika markörer visade att OL kulturer var mestadels pre-OLs med 90% ± 4% av O4+ celler, 85% ± 7% NG2+ celler, och 4,7% ± 2,1% av PLP+ celler, medan 7,2% ± 2,5% av cellerna var GFAP+ astrocyter (medelvärde ± SD, n = 3; Bild 2). Dessutom var 4,6 % ± 0,7 % av cellerna CD11b+ mikrogliaceller (medelvärde ± S.D., inte visat).
OCM produceras från sådana kulturer kan läggas till vid 3 DIV till renade hippocampus neuron kulturer. Denna behandling främjar klustring av nodalproteiner, bestående av Nav kanaler som är associerade med Neurofascin 186 och Ankyrin G längs axon av hippocampal GABAergic nervceller före myelination, på 17 DIV(Figur 3A,B). Notera, elektrofysiologiska inspelningar visade att dessa kluster är associerade med en ökad ledning av åtgärder potentialer14. Dessutom ökar uttrycket av fosforylated mellanliggande glödtrådprotein H färgat av Smi31 i OCM-behandlade hippocampus nervceller (figur 3A). Oligodendroglial utsöndrade faktorer är därför inblandade i neuronal mognad och fysiologi.
Myelination av hippocampus nervceller kan studeras genom tillägg av OL vid 14 DIV. Från 20 DIV till 24 DIV, immunfärgning av myelin markörer, såsom myelin grundläggande protein (MBP) möjliggör visualisering av myelin segment(figur 4).
Bild 1: Protokolltidslinje för OL-härstamningsceller isolering och OCM produktion. Efter dissekera ut cerebrala kortiklar från P2 Wistar råttor (steg 4), utföra vävnad dissociation till odling gliaceller (steg 5). Vid 8, 12 och 15 DIV (dvs. dagar före skakningar), förnya halvmedium med varma DMEM-10% FCS (steg 6). Nästa dag, skaka gliakulturer över natten vid 250 rpm vid 37 °C (steg 7.2). Skörda supernatant innehållande OL härstamningceller och få mikrogliaceller och platta den i 15 min i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2 (steg 8,3 till 8,7). Centrifugera supernatanten i 5 min vid 423 x g, resuspend cellpellet med BS och inkubera i 2 dagar i en fuktad inkubator vid 37 °C under 5% CO2 (steg 8,8 till 8,12). För att producera OCM, inkubera i 2 dagar i NB-B27low (steg 9). För att isolera OEM-filer för samkulturexperiment, koppla bort cellmed trypsin (steg 11.3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: OL härstamning sfenotyp i kulturer. Bilder förvärvades med hjälp av ett confoasmikroskop. Högsta intensitetsprojektioner presenteras. (A)OL kulturer innehåller mestadels pre-OLs (dvs. uttrycker endast NG2 (röd), eller både O4 (grön) och NG2 (röd), celler som uttrycker båda markörerna anges med gula stjärnor), men också några omogna OLs (dvs. bara uttrycka O4 och inte NG2; vita stjärnor). (B)Få mogna OEM-blad (dvs. PLP+, grön) och få astrocyter (GFAP+ celler; röd) finns i OL härstamning cell kulturer. Skala barer = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Representativa ansökningar. (A,B) Hippocampal nervceller behandlas med OCM vid 3 DIV och fast vid 17 DIV express fosforylated mellanliggande glödtråd protein H (Smi31; grön; panel A). GABAergic nervceller, identifieras av glutamat decarboxylase isoform av 67 kDa (GAD67) uttryck (vit), visa ansamling av Ankyrin G och Nav natriumkanaler (röd; paneler A och B, respektive) vid axon ursprungliga segmentet och bilda Ankyrin G och Nav kluster längs yxan (paneler A och B, respektive). Skala barer = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Representativa ansökningar. OL härstamning celler läggas till hippocampus neuron kultur på 14 DIV myelinate några hippocampus axoner, här fast vid 23 DIV (MBP som en myelin markör; grön). Noderna av Ranvier (Nav; röd) observeras mellan myelin segment. Skala bar = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bottenstein-Sato (BS) media | Slutlig koncentration |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/mL |
| apo-Transferrin människa | 100 μg/ml |
| BSA (Bovin serum Albumin) | 100 μg/ml |
| Insulin | 5 μg/ml |
| PDGF (PDGF) | 10 ng/ml |
| Progesteron | 62 ng/ml |
| Putrescine dihydrochloride | 16 μg/ml |
| Natriumselenit | 40 ng/ml |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 30 ng/ml |
| T4 (L-Tyroxin) | 40 ng/ml |
Tabell 1: Förberedelse av Bottenstein-Sato (BS) media.
| NB-B27 lågt medium | Slutlig koncentration |
| Neurobasala | |
| B27 tillägg | 0,5 x |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/mL |
| OBS-B27 media | Slutlig koncentration |
| Neurobasala | |
| B27 tillägg | 1x (1 x) |
| L-glutamin | 0,5 mM |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/mL |
Tabell 2: Beredning av NB-B27low- och NB-B27-media.
| Samkulturmedia | Slutlig koncentration |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | 1 vol |
| Neurobasala | 1 vol |
| B27 tillägg | 1x (1 x) |
| Penicillin-Streptomycin | 100 IE/mL |
| apo-Transferrin människa | 50 μg/ml |
| Biotin | 10 ng/ml |
| BSA (Bovin serum Albumin) | 50 μg/ml |
| Ceruloplasmin | 100 ng/ml |
| Hydrokortison | 0,05 μm |
| Insulin | 5 μg/ml |
| N-Acetyl-L-cystein | 5 μg/ml |
| Progesteron | 6.2 ng/ml |
| Putrescin (på sätt) | 16 μg/ml |
| Rekombinant Human CNTF | 0,1 ng/ml |
| Natriumselenit | 5 ng/mL |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine natriumsalt) | 40 ng/ml |
| Vitamin B12 | 27.2 ng/mL |
Tabell 3: Förberedelse av samkulturmedia.
Kompletterande fil 1. Klicka här för att se den här filen (Högerklicka för att ladda ner).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här ger vi ett detaljerat protokoll för att få mycket berikade oligodendroglial härstamning cellkulturer från blandade gliakulturer, anpassade från en tidigare publicerad metod16, och den efterföljande produktionen av OL-konditionerade medium. Denna skakteknik är inte dyr, kan upprepas tre gånger och är optimal för att få hög mängd renade OLs, som celler odlade i Bottenstein-Sato (BS) medium som innehåller PDGFα föröka sig. Gliaceller framställs med hjälp av cerebrala kortiteter av Wistar råttor på P2, en tidpunkt där en stor majoritet av de oligodendroglial härstamning celler är pre-oligodendrocytes uttrycka NG2 och O415. Notera, OL härstamning mognad är liknande på P2 i mus och råtta, och detta protokoll kan också användas för att isolera musen pre-oligodendrocytes17.
Efter att ha skakat de blandade gliacellkulturerna består fristående celler huvudsakligen av oligodendrogliala härstamningsceller, men också några mikrogliala celler och få astrocyter. Mikrogliala celler avlägsnas genom differentialvidhäftning på obelagda petriskålar. Observera att borttagningseffektiviteten kan förbättras genom att utföra ytterligare ett vidhäftningssteg. Men cirka 5% av mikrogliala celler finns fortfarande i berikade oligodendroglial cell kulturer, samt 5% till 9% av astrocyter. Det är möjligt att minska kontaminering från astrocyter till mindre än 5% genom att utföra ytterligare ett immun-panorering steg med O4 antibody-belagda Petri rätter; för ett detaljerat protokoll se kompletterande information i Freeman m.fl.14. Avlägsnande av skräp 2 h efter plätering oligodendroglial celler är ett kritiskt steg, som bygger på styrkan i flödet tillämpas med pipet. I detta steg är det viktigt att undersöka kulturen under mikroskopet före och efter clearing för att kontrollera effektiviteten eftersom förekomsten av för mycket skräp kan försämra cellens livskraft och tillväxt. Notera, det är också viktigt att använda nytillverkade BS medium, annars kan förändra oligodendrocytes överlevnad. Dessutom överlever renade celler endast upp till 6 dagar efter plätering. I själva verket är det känt att andra gliaceller och nervceller främja OPC överlevnad och spridning eller differentiering genom utsöndrade faktorer eller direkta kontakter2,18.
Andra metoder tillåter OLs isolering omedelbart efter hjärndissociation, med hjälp av immunmärkning med O4 antikroppar följt av fluorescerande-aktiverad cell sortering genom flödecytometri (FACS) eller magnetisk-aktiverad cell sortering (MACS). Dessutom kan GFP-positiva OPCs eller GFP-positiva oligodendrocyter renas genom fluorescerande-aktiverad cellsortering från PDGFαR:GFP eller PLP:GFP-möss, respektive19,20. Dessa sorteringsmetoder är mer relevanta för att studera fysiologiskt tillstånd av oligodendrocyter jämfört med kulturer som behandlas med tillväxtfaktorer som kan förändra deras fenotyp. Noterbart är att fluorescerande aktiverad cellsortering har använts för genprofileringsmetoder i normalt fysiologiskt tillstånd och demyelinatingsförhållanden21. Eftersom cellöverlevnaden kan ändras genom cellsortering är det bättre att utföra funktionella analyser omedelbart efter sortering.
Vi har visat att OL kulturer kan lossna och läggas till renade hippocampus neuron kulturer på 14 DIV. Sådan OL-neuron samkultur tillåter studie t.ex. Andra modeller av OL-hippocampus neuron myelinating co-kultur har uppnåtts genom att lägga oligodendrocytes omedelbart efter sortering22,23. Dessutom producerade vi OCM för att ytterligare dissekera OL-neuron interaktioner och ta itu med rollen som OL-utsöndrade faktorer på neuron kulturer. Genom att använda denna teknik, visade vi att hippocampal GABAergic neuron subtypes (dvs. parvalbumin+ och / eller somatostatin+) kan bilda kluster av nodalproteiner längs deras axon som induceras av OCM före myelination14,24. Masspektrometri analys av OCM har nystas upp flera utsöndrade proteiner och ledde till att identifiera oligodendroglial Contactin-1 som i synergi med extracellulära matrisproteiner förmedlar tidiga steg av nodal klustrade24. Primära kulturer är användbara modeller som gör det möjligt att bedöma oligodendroglial härstamning cell differentiering och interaktioner med nervceller. Men andra metoder har också utvecklats för att utvärdera OL funktioner och myelination, demyelination och remyelination från ex vivo cerebellar organotypic slice kulturer25,26, och in vivo studier, särskilt med zebrafisk och tadpole modeller27 som behövs i slutskedet av prekliniska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande intressen eller motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Rémi Ronzano för hans kloka råd i manuskriptredigering. Detta arbete finansierades av ICM, INSERM, ARSEP stiftelse bidrag till NSF, och Bouvet-Labruyère pris.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-fluorodeoxyuridine | Sigma | F0503 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| DNase (Deoxyribonuclease I) | Worthington | LS002139 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221-M | |
| Ethanol 70% | VWR Chemicals | 83801.360 | |
| Fetal Calf Serum | ThermoFisher | 10082147 | |
| L-cysteine | Sigma | C7352 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Papain | Worthington | LS003126 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline without calcium and magnesium | ThermoFisher | A1285601 | |
| Polyethylenimine(PEI) | Sigma | P3143 | |
| Tetraborate decahydrate | Sigma | B9876 | |
| Trypsin | Sigma | Sigma | |
| Uridine | Sigma | U3750 | |
| Bottenstein-Sato (BS) media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| PDGF | Peprotech | AF-100-13A | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| T4 (L-Thyroxine) | Sigma | T1775 | |
| Co-culture media | |||
| apo-Transferrin human | Sigma | T1147 | |
| B27 supplement | ThermoFisher | 17504044 | |
| Biotin | Sigma | B4639 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma | A4161 | |
| Ceruloplasmin | Sigma | 239799 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | ThermoFisher | 31966021 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H4001 | |
| Insulin | Sigma | I5500 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A8199 | |
| Neurobasal | ThermoFisher | 21103049 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Putrescin | Sigma | P5780 | |
| Recombinant Human CNTF | Sigma | 450-13 | |
| Sodium selenite | Sigma | S5261 | |
| T3 (3,3',5-Triiodo-L-thyronine sodium salt) | Sigma | T6397 | |
| Vitamin B12 | Sigma | V6629 | |
| Tools | |||
| 0.22 µm filter | Sartorius | 514-7010 | |
| 1 mL syringe | Terumo | 1611127 | |
| 100 mm Petri dish | Dutscher | 193100 | |
| 15 mL tube | Corning Life Science | 734-1867 | |
| 50 mL tube | Corning Life Science | 734-1869 | |
| 60 mm Petri dish | Dutscher | 067003 | |
| 70 µm filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Binocular microscope | Olympus | SZX7 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14008-14 | |
| Scalpel | Swann-morton | 233-5528 | |
| Shaker | Infors HT | ||
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Small surgical spoon | Bar Naor Ltd | BN2706 | |
| T150 cm2 flask with filter cap | Dutscher | 190151 | |
| Animal | |||
| P2 Wistar rat | Janvier | RjHAn:WI |
References
- Zalc, B. The acquisition of myelin: a success story. Novartis Foundation Symposium. 276, 15-21 (2006).
- Habermacher, C., Angulo, M. C., Benamer, N. Glutamate versus GABA in neuron-oligodendroglia communication. Glia. 67 (11), 2092-2106 (2019).
- Sherman, D. L., Brophy, P. J. Mechanisms of axon ensheathment and myelin growth. Nature Reviews. Neuroscience. 6 (9), 683-690 (2005).
- Freeman, S. A., Desmazières, A., Fricker, D., Lubetzki, C., Sol-Foulon, N. Mechanisms of sodium channel clustering and its influence on axonal impulse conduction. Cellular and molecular life sciences: CMLS. 73 (4), 723-735 (2016).
- Lee, Y., et al. Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration. Nature. 487 (7408), 443-448 (2012).
- Nave, K. A. Myelination and the trophic support of long axons. Nature Reviews. Neuroscience. 11 (4), 275-283 (2010).
- Monje, M. Myelin Plasticity and Nervous System Function. Annual Review of Neuroscience. 41, 61-76 (2018).
- Birey, F., et al. Genetic and Stress-Induced Loss of NG2 Glia Triggers Emergence of Depressive-like Behaviors through Reduced Secretion of FGF2. Neuron. 88 (5), 941-956 (2015).
- Frühbeis, C., et al. Neurotransmitter-triggered transfer of exosomes mediates oligodendrocyte-neuron communication. PLoS Biology. 11 (7), e1001604 (2013).
- Jang, M., Gould, E., Xu, J., Kim, E. J., Kim, J. H. Oligodendrocytes regulate presynaptic properties and neurotransmission through BDNF signaling in the mouse brainstem. eLife. 8, (2019).
- Sakry, D., et al. Oligodendrocyte precursor cells modulate the neuronal network by activity-dependent ectodomain cleavage of glial NG2. PLoS Biology. 12 (11), e1001993 (2014).
- Sakry, D., Yigit, H., Dimou, L., Trotter, J. Oligodendrocyte precursor cells synthesize neuromodulatory factors. PloS One. 10 (5), e0127222 (2015).
- Stadelmann, C., Timmler, S., Barrantes-Freer, A., Simons, M. Myelin in the Central Nervous System: Structure, Function, and Pathology. Physiological Reviews. 99 (3), 1381-1431 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Acceleration of conduction velocity linked to clustering of nodal components precedes myelination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), E321-E328 (2015).
- Baumann, N., Pham-Dinh, D. Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system. Physiological Reviews. 81 (2), 871-927 (2001).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (3-4), 251-260 (2011).
- Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B., Astrocyte, Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).
- Klinghoffer, R. A., Hamilton, T. G., Hoch, R., Soriano, P. An allelic series at the PDGFalphaR locus indicates unequal contributions of distinct signaling pathways during development. Developmental Cell. 2 (1), 103-113 (2002).
- Spassky, N., et al. The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents. Developmental Neuroscience. 23 (4-5), 318-326 (2001).
- Moyon, S., et al. Demyelination Causes Adult CNS Progenitors to Revert to an Immature State and Express Immune Cues That Support Their Migration. Journal of Neuroscience. 35 (1), 4-20 (2015).
- Gardner, A., Jukkola, P., Gu, C. Myelination of rodent hippocampal neurons in culture. Nature Protocols. 7 (10), 1774-1782 (2012).
- Thetiot, M., et al. An alternative mechanism of early nodal clustering and myelination onset in GABAergic neurons of the central nervous system. bioRxiv. , 763573 (2019).
- Dubessy, A. L., et al. Role of a Contactin multi-molecular complex secreted by oligodendrocytes in nodal protein clustering in the CNS. Glia. 67 (12), 2248-2263 (2019).
- Barateiro, A., Fernandes, A. Temporal oligodendrocyte lineage progression: in vitro models of proliferation, differentiation and myelination. Biochimica Et Biophysica Acta. 1843 (9), 1917-1929 (2014).
- Thetiot, M., Ronzano, R., Aigrot, M. S., Lubetzki, C., Desmazières, A. Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), (2019).
- Mannioui, A., Zalc, B. Conditional Demyelination and Remyelination in a Transgenic Xenopus laevis. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.). 1936, 239-248 (2019).
