Summary
Vi beskriver en simpel metode til at producere høj opløsning time-lapse film af Pseudomonas aeruginosa sværme, der reagerer på bakteriofage (fag) og antibiotika stress ved hjælp af en flatbed dokument scanner. Denne procedure er en hurtig og enkel metode til overvågning af sværmer dynamik og kan tilpasses til at studere motilitet og vækst af andre bakteriearter.
Abstract
Sværmer er en form for overflade motilitet observeret i mange bakteriearter, herunder Pseudomonas aeruginosa og Escherichia coli. Her, tætte populationer af bakterier bevæge sig over store afstande i karakteristiske tendril-formede samfund i løbet af timer. Sværmer er følsom over for flere faktorer, herunder medium fugt, fugtighed, og næringsstofindhold. Hertil kommer, at den kollektive stress respons, som er observeret i P. aeruginosa, der er stresset af antibiotika eller bakteriofage (fag), frastøder sværme fra nærmer sig det område, der indeholder stress. De metoder, der er beskrevet her, omhandler, hvordan du styrer de kritiske faktorer, der påvirker sværmer. Vi introducerer en enkel metode til at overvåge sværmer dynamik og den kollektive stress respons med høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af en flatbed dokument scanner, og beskrive, hvordan man kompilere og udføre en kvantitativ analyse af sværme. Denne enkle og omkostningseffektive metode giver præcis og velkontrolleret kvantificering af sværmning og kan udvides til andre typer pladebaserede vækstanalyser og bakteriearter.
Introduction
Sværmning er en kollektiv form for koordineret bakteriel motilitet , der øger antibiotikaresistens og produktion af virulensfaktorer i værten1,2,3. Denne flercellede adfærd opstår på halvfaste overflader, der ligner dem af slimhinder, der dækker epitelmembraner i lungerne4,5. Biosurfactants er almindeligt produceret af sværmer populationer til at overvinde overfladen spændinger på overflader og produktionen af disse er reguleret af komplekse celle-celle signalsystemer, også kendt som kvorum sensing6,7,8. Mange arter af bakterier er i stand til sværmer, herunder Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, og Escherichia coli9,10,11,12. De sværmer mønstre skabt af bakterier er forskellige og påvirkes af de fysiske og kemiske egenskaber af overfladen lag, herunder næringsstof sammensætning, porøsitet, og fugt13,14. Ud over overfladeegenskaber påvirker væksttemperatur og luftfugtighed flere aspekter af sværmerdynamik, herunder sværdehastighed og mønstre12,13,14,15. De vækstvariabler, der påvirker sværmer, skaber udfordringer, der påvirker eksperimentel reproducerbarhed og evnen til at fortolke resultater. Her beskriver vi en simpel standardiseret metode til at overvåge dynamikken i bakterielsværme gennem time-lapse imaging. Metoden beskriver, hvordan man styrer kritiske vækstbetingelser, der i væsentlig grad påvirker udviklingen af sværmer. Sammenlignet med traditionelle metoder til sværmanalyse gør denne time-lapse billeddannelsesmetode det muligt at spore motiliteten af flere sværme samtidigt i længere tid og med høj opløsning. Disse aspekter forbedrer dybden af data, der kan opnås ved overvågning sværme og lette identifikationen af faktorer, der påvirker sværme.
Sværmer i P. aeruginosa lettes gennem produktion og frigivelse af rhamnolipider og 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic syrer i det omkringliggende område6,16. Indførelsen af stress fra sub-dødelige koncentrationer af antibiotika eller infektion med fagvirus påvirker tilrettelæggelsen af sværme. Især disse belastninger fremkalde P. aeruginosa at frigive kvorum sensing molekyle 2-heptyl-3-hydroxy-4-quinolon, også kendt som Pseudomonas quinolon signal (PQS)17,18. I sværmanalyser, der indeholder to populationer af sværme, afviser PQS, der er produceret af den stressinducerede population, ubehandlede sværme i at komme ind i det område, der indeholder stress (figur 1). Denne kollektive stress reaktion udgør en fare kommunikation signalsystem, der advarer P. aeruginosa om nærliggende trusler18,19. Virkningerne af stress på P. aeruginosa, aktivering af den kollektive stress respons, og frastødning af sværme kan visualiseres ved hjælp af time-lapse billeddannelse metode, der er beskrevet her. Den protokol, der er beskrevet her, forklarer, hvordan man: (1) forberede agar plader til sværmer, (2) kultur P. aeruginosa for to typer af assays (traditionelle sværmer assays eller kollektive stress respons assays) (Figur 1), (3) erhverve time-lapse billeder, og (4) bruge ImageJ til at kompilere og analysere billederne.
Kort, P. aeruginosa fra en overnatning kultur er spottet i midten af en sværmer agar plade, mens P. aeruginosa, der er inficeret med eller behandlet med antibiotika er spottet på satellit positioner. Udviklingen af P. aeruginosa sværmer overvåges på et forbrugerdokument flatbed scanner, der er placeret i en fugtighed-reguleret 37 °C inkubator. Scanneren styres af en software, der automatisk scanner pladerne med jævne mellemrum i løbet af sværmvækstperioden, typisk 16-20 timer. Denne metode giver samtidige time-lapse videoer på op til seks 10 cm sværmende plader. Billederne er samlet i film og frastødning af sværme af stress-induceret befolkninger kvantificeres ved hjælp af frit tilgængelige ImageJ software. Der lægges særlig vægt på at sikre konsistens og reproducerbarhed mellem forskellige sværmede eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse Sværmer Agar Plader til P. aeruginosa Sværmer Time-lapse Imaging
- Der tilføres mindst 1 L 5x M8-medie i en glasflaske ved at tilsætte 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4og 2,5 g NaCl i 500 ml dobbeltdestilleret vand (ddH2O). Det endelige volumen justeres til 1 L med ekstra ddH2O. Autoklave for at sterilisere og opbevare flydende medier ved stuetemperatur.
- 100 ml 1 M MgSO4 (magnesiumsulfat) fremstilles i en glasflaske ved at tilsætte 24,6 g MgSO4•7H2O i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumen til 100 ml med ekstra ddH2O. Autoklave til sterilisering. Opbevares ved stuetemperatur.
- 100 ml 20% casaminosyrer fremstilles i en glasflaske ved at tilsætte 20 g casaminosyrer i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumen til 100 ml med ekstra ddH2O. Autoklave til sterilisering. Opbevares ved stuetemperatur.
- 100 ml 20% glukose fremstilles i en glasflaske ved tilsætning af 20 g glukose i 50 ml ddH2O. Juster det endelige volumen til 100 ml med ekstra ddH2O. Steriliser ved filtrering med 0,22 μm filter. Opbevares ved stuetemperatur.
- For at lave 10 sværmende agarplader tilsættes 1 g agar i 100 ml ddH2O og det endelige volumen justeres til 160 ml med ekstra ddH2O i en 250 ml Erlenmeyer kolbe. Steriliser ved autoklavering.
- Umiddelbart efter autoklaving anbringes agaropløsningen i et 55 °C vandbad i 15 min.
- Agaropløsningen fjernes fra vandbadet, og der tilsættes 40 ml 5x M8-mindstemedier, 200 μL på 1 M MgSO4,2 ml 20% glukose og 5 ml 20% casaminosyrer15. Fortsæt til trin 1.6 umiddelbart efter blanding.
BEMÆRK: De endelige koncentrationer er 0,5% agar, 1 mM MgSO4,0,2% glukose og 0,5% casaminosyrer.
- Ved hjælp af en 25 ml pipette for ensartet volumen tilsættes 20 ml af den sværmende agaropløsning pr. 10 cm diameter Petriskål.
BEMÆRK: Et fast volumen af agaropløsning er vigtigt, da volumen påvirker tørretiden og vandindholdet i agaren. Undgå bobler, når du foretager de sværmende agarplader. - Lad agaren størkne ved at placere de sværmede agarplader i en enkelt stak med låg på i 1 time på bænken ved stuetemperatur. Tænd affugteren for at reducere den relative luftfugtighed i rummet til 40-50% 1 time før næste trin.
- Tør de sværmede agarplader i yderligere 30 minutter med lågene af i en laminar strømhætte ved 300 ft3/min med 40-50% relativ luftfugtighed ved stuetemperatur. Tør det indre af lågene ved at placere dem med forsiden op i laminar flow hætte. Opbevar hlidte agarplader ved 4 °C i op til 24 timer.
- Forbered sorte 10 cm Petri skål låg til billedbehandling ved at udjævne indersiden af låget med sandpapir. Læg lågene i en emballagekasse og læg emballagen under en kemisk hætte. Spray inde i lågene ved hjælp af sort spraymaling. Lad lågene tørre.
BEMÆRK: Sorte låg kan genbruges til yderligere forsøg. Det er vigtigt, at lågene males, så de ikke reflekterer lys under scanningen.
2. Vækst af P. aeruginosa og plating betingelser
- Forbered 400 ml lysogenbouillon (LB) ved at tilføje 10 g LB-Miller pulvermix i 400 ml ddH2O. For 2% LB-agar Petri retter, tilsæt yderligere 8 g agar. Autoklave at sterilisere.
- Hæld 20 ml smeltet LB-agar medium i 10 cm diameter Petri skåle og lad dem størkne ved stuetemperatur natten over. Opbevar flydende medier ved stuetemperatur og agarplader ved 4 °C.
- Stribe P. aeruginosa på en LB-agar Petri skål fra en frossen bestand opbevaret ved -80 °C ved hjælp af sterile sløjfer eller træpinde. Inkuber petriskålen på hovedet natten over ved 37 °C. LB-agarpladen opbevares ved 4 °C i op til 1 uge.
- Vælg en enkelt koloni fra petriskålen med en steril løkke eller træpind, podet det ind i 2 ml LB medium, og inkuberkulturen til mætning natten over (16-18 h) ved 37 °C i en trommetromle indstillet til 100 rpm.
- Pipetteres 5 μL nattenskultur fra trin 2.4 ved hjælp af en P20-pipet og ser i midten af den hægmende agarplade ved at nærme sig pipetspidsen i en vinkel (10-45°) 2,5 cm over pletstedet, pipettere ned til det første stop og ved kun at berøre den flydende dråbe (Figur 1B).
- Undgå at røre agaren med pipetspidsen, da den beskadiger agaren. Brug en skabelon til at placere pletten konsekvent på tværs af forskellige sværmer agar plader (supplerende figur S1).
- For traditionelle sværmer assays, skal du kun bruge centrum stedet og springe til trin 2,8. For kollektiv stress respons assays fortsætte med at trin 2,6 (for faginfektion) eller trin 2,7 (for antibiotika stress).
- For faginfektion blandes 30 μL nattenskultur af P. aeruginosa fra trin 2.4 med 6 μL på 1 x 1012 pfu/ml DMS3vir20. Fortsæt straks til næste trin.
- Pipet 6 μL af P. aeruginosa-fagblandingen fra trin 2.6 ved hjælp af en P20 pipet og spot på 6 lige fjerne satellit positioner på en 2,8 cm radius koncentrisk cirkel, der er centreret på Petri skålen ved at nærme sig pipet spidsen i en vinkel (10 til 45 °) 2,5 cm over pletblødning område, pipettering ned til det første stop, og røre agar med kun den flydende dråbe (Figur1
- Undgå at røre agaren med pipetspidsen, da den beskadiger agaren. Brug en belægningsskabelon for konsistens (Supplerende figur S1). Fortsæt til trin 2.8.
- Til antibiotikabehandlinger blandes 30 μL natten kultur P. aeruginosa fra trin 2.4 med 6 μL på 3 mg/ml gentamycin, 10 μL af 100 mg/ml kanamycin, eller 7,5 μL af 100 mg/ml fosfomycin. Fortsæt straks til næste trin.
- Pipet 6 μL af antibiotika behandlet P. aeruginosa fra trin 2.7 ved hjælp af en P20 pipette og spot på 6 lige langt satellit positioner på en 2,8 cm radius koncentrisk cirkel om midten af skålen ved at nærme pipet spidsen i en vinkel (10 til 45 °) 2,5 cm over spotting område, pipettering ned til det første stop, og røre agar med kun væsken ( dropFigur 1D).
- Undgå at røre agaren med pipetspidsen, da den beskadiger agaren. Brug en belægningsskabelon for konsistens (Supplerende figur S1). Fortsæt til trin 2.8.
- Udskift de klare petriskållåg med sorte låg i trin 1.9 (Figur 2A).
- Anbring de sværmede agarplader på en scanner i en rugemaskine, der er indstillet til 37 °C med et 10 L vandbad for at opretholde luftfugtigheden ved 75 %(Figur 1E, figur 2B).
FORSIGTIG: Forstyr ikke plettede celler på de sværmede agarplader. Hold altid skiltene opad.
3. Billederhvervelse med scanner
- Formindsk den omgivende belysning af petriskålene ved at fastgøre sort mat stof til en rack 40-60 cm over den flatbed dokumentscanner. Fastgør den ved hjælp af lynlåse (Figur 2B).
- Scanneren vil blive kontrolleret ved hjælp af en scanning software og en automatisk scripting software.
- I scanningssoftwaren skal du vælge Hjemtilstand (Figur 3A). Tag billeder i farver ved at vælge Farve under Billedtype. Hvis du vil angive billedkvaliteten, skal du vælge Andet under Destination og justere opløsningen til 300 dpi. Bevar standardstørrelsen for billederne ved at vælge Original til Målstørrelse. Lad alle indstillinger under Billedjusteringer være umarkeret for standardbilledkvaliteten.
BEMÆRK: Målstørrelsen er som standard indstillet til Original. Hvis du vil vælge andre indstillinger for Målstørrelse, skal du klikke på Eksempel først.
- I scanningssoftwaren skal du vælge Hjemtilstand (Figur 3A). Tag billeder i farver ved at vælge Farve under Billedtype. Hvis du vil angive billedkvaliteten, skal du vælge Andet under Destination og justere opløsningen til 300 dpi. Bevar standardstørrelsen for billederne ved at vælge Original til Målstørrelse. Lad alle indstillinger under Billedjusteringer være umarkeret for standardbilledkvaliteten.
- Indstil den gemte sti af billeder ved at klikke på mappeikonet til højre for Scan for at åbne Indstillinger for gem fil (Figur 3A).
- Vælg mappedestinationen for lagring af billeder ved at vælge Andet under Placering, og klik på Gennemse. Vælg en mappe for at gemme billederne.
- Navngiv billederne i tekstboksen Præfiks. Angiv Startnummer 001 for at begynde navngivningssekvensen for billederne. Indstil filformatet til JPEG ved at vælge JPEG (*.jpg) for Tekst under Billedformat, og klik på Indstillinger for at justere for detaljer. Indstil billedformatkvaliteten ved at justere komprimeringsniveauet til 16, Kodning til Standard, og markér Integrer ICC-profil. Klik på OK for at lukke vinduet (Figur 3B).
- Lad den første indstilling være umarkeret ("Overskriv filer med samme navn"), og markér de tre næste indstillinger ("Vis denne dialogboks før næste scanning", "Åbn billedmappe efter scanning" og "Vis dialogboksen Tilføj side efter scanning"). Klik på OK for at lukke vinduet
- Kontroller billedkvaliteten ved at klikke på Eksempel. Eksempelvinduet vises, og scanningsikonet bliver funktionelt (Figur 3C).
- Brug scriptsoftwaren til at automatisere billedanskaffelsen. Det medfølgende script klikker på Scan i vinduet Scan og OK i vinduet Indstillinger for gem fil med 30 min.
- Importer scriptet ved at klikke på Opgave | Importere og vælge både Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk (TSK filer, der leveres som supplerende filer 1 og 2). Se figur 3D.
BEMÆRK: Single_scan.tsk klikker på knappen Scan i vinduet Scan og OK i vinduet Indstillinger for gem fil. Idle_scanning.tsk aktiveres Single_scan.tsk hver 30. Man kan ændre scanningsfrekvensen ved at ændre aktiveringen af Idle_scanning.tsk. - Aktiver automatisk scanning med 30 min intervaller ved at vælge både inaktiv scanning (importeret) og Enkelt scanning (importeret),højreklikke på Inaktiv scanning (importeret)og venstre klikke på Aktiveret (Figur 3D, Supplerende figur S2).
BEMÆRK: Automatisk scanning kører, indtil brugeren manuelt stopper scriptet. Hvis du vil stoppe scriptet, skal du vælge Inaktiv scanning (importeret),højreklikke på Inaktiv scanning (importeret)og venstreklikke på Aktiveret. Markeringen fjernes.
- Importer scriptet ved at klikke på Opgave | Importere og vælge både Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk (TSK filer, der leveres som supplerende filer 1 og 2). Se figur 3D.
4. Udarbejdelse af time-lapse billeder og måling swarm frastødning
- Udfør filmredigering og billedanalyse ved hjælp af ImageJ.
- Importere alle de scannede billeder til ImageJ ved at klikke på Fil | Import | Billede Sekvens og vælge billederne. Markér Konverter til RGB i vinduet Sekvensindstillinger for at holde billederne i farver. Antal billeder angiver antallet af markerede billeder.
- Hold Start billede på 1 for at starte fra det første billede i mappen og Skaler billeder på 100% for at bevare den oprindelige størrelse af billederne. Lad Brug virtuel stak umarkeret. Klik på OK, og vent på, at billederne indlæses (Figur 4A).
- Indstil videokomprimeringsniveauet til 100 ved at klikke på Rediger | Indstillinger | Input/output... og justere JPEG-kvaliteten til 100.
- Gem filen som en .avi ved at klikke på Fil | Gem som | AVI. Juster komprimeringen til JPEG og Billedhastigheden til 5 fps (Figur 4B). Gem .avi-tidsforløbet i den ønskede mappe.
- Hvis du vil kvantificere sværmfrastødende afstande, skal du åbne et billede nær slutningen af sværmperioden i ImageJ. Klik på Fil | Åbn og vælg billedet. Juster skalaen ved at klikke på Analysér | Indstil Skaler og indstilling Af afstand i pixel til 118, Kendt afstand til 1, Pixelhøjdeforhold til 1,0 og Længdeenhed til cm (Figur 4C). Lad Global være umarkeret. Klik på OK for at lukke vinduet.
- Klik på lige ikon og måle fra midten af kolonien på satellitposition en kant af sværmer befolkning. Vælg Analysér | Mål for at få et nyt vindue til at dukke op med målingerne (Længde) (Figur 4D).
BEMÆRK: Brug "+" til at zoome tættere ind og "-" for at zoome ud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Trinene til at vokse P. aeruginosa, stress cellerne, og billedet de sværmer agar plader er repræsenteret i figur 1. Vi podede en enkelt koloni af vildtype P. aeruginosa UCBPP-PA14 stamme fra en LB-agar plade i 2 ml LB bouillon natten over ved 37 °C og spottet 5 μL i midten af sværmede agar plade. Time-lapse billeddannelse af denne plade afslører indledende vækst i form af en koloni i midten og derefter spredning af tendrils radialt fra kolonien (Video 1). For kollektive stressresponsanalyser blandes 30 μL af samme nattenskultur ud over at spotte P. aeruginosi i midten med 6 μL på 1 x 1012 pfu/ml DMS3vir eller 6 μL på 3 mg/ml gentamycin i et forhold på 5:1, og 6 μL ses ved satellitpositionerne. Sværme bevæger sig fra midten af de sværmende agarplader til periferien og frastødes af et stresssignal, der udsendes af de bakterier, der var inficeret med fager (Video 2, øverste venstre plade) eller behandlet med gentamycin (Video 2, øverste højre plade). (Video 2, nederste venstre plade) eller gentamycin(Video 2, nederst e-højre plade) spottet alene på satellitpositioner ikke forårsager sværmer befolkninger for at undgå disse områder.
Figur 1: Skematisk af P. aeruginosa sværmer assay og kollektiv stress respons. (A) P. aeruginosaceller dyrkes natten over (16-18 timer til OD600 på ca. 1,5) i LB-bouillon ved 37 °C og(B)plettet midt i den sværmede agarplade. Natten kulturer blandes med (C) fager eller (D) antibiotika og spottet på satellit positioner for kollektiv stress respons assays. (E) Op til 6 plader afbildes på en scanner med 30 min mellemrum i 16-18 timer ved 37 °C. Efter 18 timer undgår P. aeruginosa sværmer populationer (F) celler inficeret med eller(G)celler behandlet med antibiotika (gentamycin). (H) P. aeruginosa populationer sværmer over sværmer agar plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Scanneropsætning inde i kuvøsen. (A) Sorte petriskåle, der er fremstillet i punkt 1. Disse låg bruges under scanning en reduktion af lysrefleksioner og erstatte klare petriskållåg. (B) Flatbed-dokumentscanneren anbringes i en rugemaskine, der er indstillet til 37 °C. Der er anbragt seks plader med sorte låg på scanneren (venstre billede). Sort mat stof er fastgjort til rack et 60 cm over scanneren for yderligere at reducere refleksioner og omstrejfende lys (højre billede). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Automatisk billedanskaffelse fra flatbeddokumentscanneren ved hjælp af scannings- og automatisk scripting-softwaren. (A) Skærmbillede af hovedscanningsvinduet. Valg af billedtype (farve) og opløsning (300 dpi). Den røde firkant angiver mappeikonet for at åbne vinduet Indstillinger for gem fil. Bemærk, at der kan trykkes på knappen Eksempel, men knappen Scan er deaktiveret. (B) Skærmbillede af vinduet Indstillinger for fillagring for at indstille mappedestinationen til at gemme billeder, navngive billederne og vælge billedernes format (til venstre). Vinduet Indstillinger for ekstra-fil bruges til at indstille billedformatkvaliteten (til højre). (C) Skærmbillede af scanningsvindue efter at have klikket på Eksempel. Knappen Scan kan klikkes på, når der er anskaffet et eksempel. Programmet kan nu automatiseres ved hjælp af scripting software (Materialer). (D) Skærmbillede af scriptsoftwarevinduerne, der angiver den importknap, der bruges til at importere automatiseringsscripts (til venstre). Når Single_scan.tsk og Idle_scanning.tsk er importeret, vises disse som opgaver i hovedvinduet (til højre). Når du har markeret begge opgaver og højreklikket på dem, vises knappen Aktiveret. Venstre klik Aktiver starter scripts til automatisk at scanne med 30 min intervaller (højre). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Billedanalyse af sværmer undgåelse ved hjælp af ImageJ. (A) Trin til at importere en billedsekvens fra scannerbillederne med tiden. Klik på fil | Import | Billedsekvens i hovedvinduet ImageJ (til venstre) åbner vinduet Sekvensindstillinger (til højre) og åbner alle de scannede billeder. Den røde firkant angiver den markerede indstilling for at indlæse billeder i RGB-format. Alle andre indstillinger er som standard. (B) Trin til at gemme time-lapse video i AVI-format. Valg af fil | Gem som | AVI bringer op Gem som AVI vindue. Komprimering er indstillet til JPEG og Frame Rate til 5 fps. (C) Indstilling af skalaenheder for billeder. Valg af Analysér | Angiv skalering ser vinduet Angiv skalering. For 300 dpi-billeder er den relevante skala 118 pixels/cm. (D) Måling af undgåelse fra sværmede populationer. En gul linje er trukket fra midten af de stressede kolonier til kanten af tendrils. Valg af Analysér | Målpunkt rapporterer linjens længde i et nyt vindue med navnet Resultater. Ctrl + M er en tastaturgenvej, der udfører målingen uden at markere menupunkterne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Repræsentative sværme af P. aeruginosa. P. aeruginosa sværmer populationer på sværmer agar plader, der er (A) tør, (B) normal, (C) fugtig, og (D) ekstra fugtig. Tør sværmer agar plader hæmmer sværm sats af P. aeruginosa og reducere antallet af tendrils. Fugtig sværmer agar plader forårsage dannelse af store tendrils. Under ekstra fugtige forhold, tendrils form ujævnt i hele sværmer agar plader. Tørretider i laminarflowemhætten og den omgivende luftfugtighed har betydelig indvirkning på fugtindholdet i sværdet plade. Retterne er 10 cm petriskåle. Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Time-lapse film af sværmer. Wild-type P. aeruginosa blev spottet i midten af sværmer plade og blev afbildet på scanneren i løbet af 22 h. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Video 2: Time-lapse film af den kollektive stress respons. Wild-type P. aeruginosa blev spottet i midten af sværmer plade. Satellit positioner blev spottet med P. aeruginosa, der er blandet desuden med (øversttil venstre) eller (øversttil højre) gentamycin, eller spottet udelukkende med (nederst til venstre) eller (nederst til højre) gentamycin. Hvide prikker angiver midten af pletterne. Plader blev afbildet i løbet af 16 h. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente).
Supplerende figur S1: Plating skabelon til at spotte P. aeruginosa celler. Den midterste sorte prik repræsenterer pletområde på 5 μL natten P. aeruginosa kultur. Den inderste cirkels radius er 2,8 cm fra midten af pladen. Skæringspunktet mellem den inderste cirkel og de lige linjer på tværs af den ydre cirkel angiver pletblødningsområdet på 6 μL stresset P. aeruginosa, faginficerede eller antibiotikabehandlede celler. Den ydre cirkel repræsenterer omkredsen af 10 cm petriskål. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur S2: Makrokommandoer til periodisk at begynde at scanne ved hjælp af en scriptsoftware. (A) Makrokommandoerne i Single_scan.tsk flytter markøren til Scanning i scanningsvinduet, klikker på Scan, flytter til OK i vinduet Indstillinger for fillagring og klikker på OK. (B) Kommandoer til at scanne i 30 min intervaller. Opgaven Idle_scanning.tsk starter Single_scan.tsk og er indstillet til at aktivere i 30 min intervaller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol fokuserer på at minimere variabiliteten i sværmer agar plader og giver en enkel og billig metode til at erhverve time-lapse billeder af P. aeruginosa sværmer og reagerer på stress. Denne procedure kan udvides til at billedet andre bakterielle systemer ved at tilpasse mediernes sammensætning og vækstbetingelser. For P. aeruginosa, selv om M9 eller FAB minimal medium kan bruges til at fremkalde sværmer16,21, protokollen præsenteres her bruger M8 medium med casaminosyrer, glukose, og magnesiumsulfat6. P. aeruginosa sværmer er følsom over for medium sammensætning såsom jern tilgængelighed og næringsstoffer kilder, herunder aminosyrer22,23,24. Derfor er udvælgelsen af medier til sværmer agar plader illustrerer et vigtigt aspekt af at sige sværmer motilitet.
Styring af fugtighed og temperatur i et åbent laboratorieområde er en af de største udfordringer for konsistensen af sværmanalyser. Sæsonmæssige ændringer bidrager til variabilitet i sværmer agar plader fugt, som kan påvirke sværmer mønstre. Derfor er konstant kontrol af den relative luftfugtighed nødvendig for at sikre optimal pladekvalitet. Start affugteren 1 time før tørring af sværmer agar plader under laminar flow hætte vil styre den relative luftfugtighed til en konstant 45%, holde tørretid til 30 min. Hvis omgivende fugt ikke kan styres, er en forøgelse af tørretiden en potentiel enkel løsning til at kompensere for fugtige miljøer. Under sværmingen bør den relative luftfugtighed forblive på 70 % i inkubatoren på 37 °C for at forhindre agarpladerne i at tørre ud. En ikke-udjævnet bin vand i kuvøsen kan tjene som et vandreservoir. Tørre sværmer agar plader bremse udviklingen af sværmer befolkninger og reducere antallet af tendrils mens fugtige plader forårsage bred tendril struktur (Figur 5A-C). Ekstra fugtige sværmer agar plader forhindre klar tendril dannelse og forårsage tendrils at sprede sig i et ujævnt mønster (Fig 5D). Den metode, der er beskrevet her, kan bruges til at opretholde et konstant fugtigt miljø, der sikrer konsistens af sværmer på plader (Figur 5B, Video 1). Derudover spiller pladestørrelse og agartykkelse en rolle i fastholdelsen af fugt i pladen. Vi har brugt 10 cm diameter Petri skåle og tilføjet 20 ml sværmer agar opløsning per plade for at sikre konsistens. Det anbefales ikke at hælde plader uden at måle volumener. På grund af de mange variabler, der påvirker sværden assay, anbefaler vi at optimere analysen til lokale laboratorieforhold, og vi understreger vigtigheden af at udføre flere biologiske replikater på separate partier af plader til at observere konsekvente og sammenlignelige sværmer mønstre.
Fordelen ved time-lapse billeddannelse metode til at registrere sværmer motilitet er evnen til at observere udviklingen af motilitet uden at skulle forstyrre sværme. Vores metode skaber bekvemt tidsforskydninger af 6 plader samtidigt under de samme forhold, hvilket giver både et kontrolleret miljø til samtidig vurdering af flere stammer, flere forsøgsbetingelser eller biologiske replikater. Brugen af seks satellitpositioner på hver plade letter desuden statistisk analyse og brugen af ImageJ gør det muligt at kvantificere swarming frastødning.
Den procedure, der er beskrevet her, er en simpel metode til at studere samspillet mellem sub-populationer af P. aeruginosa: en sund sværmer befolkning og stressede celler. Ud over DMS3vir og gentamycin kan yderligere typer af fager, antibiotika og konkurrerende bakterier eller svampe bruges til at studere stresssignalering. Selv om denne metode fokuserer på P. aeruginosa sværmer motilitet, andre bakteriearter som S. aureus og E. coli også udviser sværmer mønstre, men de kræver tilpassede medier til sværm10,11. Ved at optimere mediekompositioner og pladebetingelser kan denne metode anvendes til at analysere sværmende, sværmer interaktioner mellem bakteriestammer og stressreaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., og N.M.H-K. skrev og reviderede manuskriptet. Alle forfattere designede eksperimenterne. J.-L.B. udførte eksperimenterne og analysen. Dette arbejde blev støttet af NIH award K22AI112816 og R21AI139968 tilskud til AS og University of California. N.M.H-K. blev støttet af Lundbeck-stipendierne R220-2016-860 og R251-2017-1070. Finansieringsgiverne havde ingen rolle i beslutningen om at forelægge arbejdet til offentliggørelse. Vi har ingen konkurrerende interesser at erklære.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
