Summary
Vi detalj en enkel metod för att producera högupplösta time-lapse filmer av Pseudomonas aeruginosa svärmar som svarar på bakteriofage (fag) och antibiotika stress med hjälp av en flatbed dokument scanner. Detta förfarande är en snabb och enkel metod för övervakning av svärmande dynamik och kan anpassas för att studera motilitet och tillväxt av andra bakteriearter.
Abstract
Svärmang är en form av ytmotilitet observerats i många bakteriearter inklusive Pseudomonas aeruginosa och Escherichia coli. Här rör sig täta populationer av bakterier över stora avstånd i karakteristiska tendrilformade samhällen under flera timmar. Svärmande är känslig för flera faktorer, inklusive medelfukt, fuktighet och näringsinnehåll. Dessutom avvisar den kollektiva stressresponsen, som observeras i P. aeruginosa som är stressad av antibiotika eller bakteriofage (fag), svärmar från att närma sig det område som innehåller stressen. De metoder som beskrivs här tar upp hur man kontrollerar de kritiska faktorer som påverkar svärmande. Vi introducerar en enkel metod för att övervaka svärmande dynamik och den kollektiva stressresponsen med hög tidsmässig upplösning med hjälp av en flatbäddsdokumentskanner, och beskriver hur man sammanställer och utför en kvantitativ analys av svärmar. Denna enkla och kostnadseffektiva metod ger exakt och välkontrollerad kvantifiering av svärmande och kan utvidgas till andra typer av plattbaserade tillväxtanalyser och bakteriearter.
Introduction
Swarming är en kollektiv form av samordnad bakteriell motilitet som ökar antibiotikaresistens och produktion av virulensfaktorer i värden1,2,3. Detta multicellulära beteende uppstår på halvfasta ytor som liknar de av slemhinnor som täcker epitelmembran i lungorna4,5. Biosurfactants produceras vanligen av svärmande populationer för att övervinna ytspänningen på ytor och produktionen av dessa regleras av komplexa cellcellssignaleringssystem, även känd som kvorumkännande6,,7,8. Många arter av bakterier kan svärma, inklusive Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, och Escherichia coli9,10,11,12. De svärmande mönster som skapas av bakterier är olika och påverkas av de fysiska och kemiska egenskaperna hos ytskiktet inklusive näringssammansättning, porositet och fukt13,14. Förutom ytegenskaper påverkar tillväxttemperatur och luftfuktighet flera aspekter av svärmande dynamik, inklusive svärmande hastighet och mönster12,,13,14,15. Tillväxtvariablerna som påverkar svärmanna skapar utmaningar som påverkar experimentell reproducerbarhet och förmåga att tolka resultat. Här beskriver vi en enkel standardiserad metod för att övervaka dynamiken i bakteriell svärmar genom time-lapse imaging. Metoden beskriver hur man kontrollerar kritiska tillväxtförhållanden som väsentligt påverkar utvecklingen av svärm. Jämfört med traditionella metoder för svärm analys, denna time-lapse imaging metod gör det möjligt att spåra motilitet av flera svärmar samtidigt under längre tidsperioder och med hög upplösning. Dessa aspekter förbättrar djupet av data som kan erhållas från övervakning svärmar och underlätta identifiering av faktorer som påverkar svärmande.
Svärmande i P. aeruginosa underlättas genom produktion och utsläpp av rhamnolipids och 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic syror i det omgivande området6,16. Införandet av stress från sub-dödliga koncentrationer av antibiotika eller infektion av fagvirus påverkar organisationen av svärmar. I synnerhet, dessa påfrestningar inducera P. aeruginosa att släppa kvorum avkänning molekylen 2-heptyl-3-hydroxy-4-kinolon, även känd som Pseudomonas kinolon signal (PQS)17,18. I svärm analyser som innehåller två populationer av svärmar, PQS produceras av stress-inducerad befolkningen stöter obehandlade svärmar från att komma in i området som innehåller stress (figur 1). Denna kollektiva stressrespons utgör en fara kommunikation signalering system som varnar P. aeruginosa om närliggande hot18,19. Effekterna av stress på P. aeruginosa, aktivering av den kollektiva stressrespons, och avsky av svärmar kan visualiseras med hjälp av time-lapse imaging metod som beskrivs här. Det protokoll som beskrivs här förklarar hur man: (1) förbereda agar plattor för svärmande, (2) kultur P. aeruginosa för två typer av analyser (traditionella svärmande analyser eller kollektiva stressrespons analyser) (Figur 1), (3) förvärva time-lapse bilder, och (4) använda ImageJ för att sammanställa och analysera bilderna.
Kort, P. aeruginosa från en övernattning kultur är fläckig i mitten av en svärmande agar platta medan P. aeruginosa som är infekterade med eller behandlas med antibiotika ses på satellitpositioner. Utvecklingen av P. aeruginosa svärmar övervakas på en konsument dokument flatbäddsskanner som placeras i en fuktreglerad 37 °C inkubator. Skannern styrs av en programvara som automatiskt skannar plattorna med jämna mellanrum under svärmtillväxtperioden, vanligtvis 16–20 timmar. Denna metod ger samtidiga time-lapse videor på upp till sex 10 cm svärma plattor. Bilderna sammanställs i filmer och avsky av svärmar av stress-inducerad populationer kvantifieras med hjälp av fritt tillgängliga ImageJ programvara. Särskild hänsyn tas till att säkerställa konsekvens och reproducerbarhet mellan olika svärma experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda Swarming Agar Plattor för P. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Förbered 1 L 5x M8 minsta medium i en glasflaska genom att tillsätta 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4och 2,5 g NaCl i 500 ml dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Justera den slutliga volymen till 1 L med ytterligare ddH2O. Autoklav för att sterilisera och förvara flytande media vid rumstemperatur.
- Förbered 100 ml 1 M MgSO4 (magnesiumsulfat) i en glasflaska genom att tillsätta 24,6 g MgSO4•7H2O i 50 ml ddH2O. Justera slutvolymen till 100 ml med ytterligare ddH2O. Autoklav för att sterilisera. Förvaras i rumstemperatur.
- Förbered 100 ml 20% casaminosyror i en glasflaska genom att tillsätta 20 g casaminosyror i 50 ml ddH2O. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ytterligare ddH2O. Autoklav för att sterilisera. Förvaras i rumstemperatur.
- Förbered 100 ml 20% glukos i en glasflaska genom att tillsätta 20 g glukos i 50 ml ddH2O. Justera den slutliga volymen till 100 ml med ytterligare ddH2O. Sterilisera genom filtrering med 0,22 μm filter. Förvaras i rumstemperatur.
- För att göra 10 svärma agar plattor, tillsätt 1 g agar i 100 ml ddH2O och justera den slutliga volymen till 160 ml med ytterligare ddH2O i en 250 ml Erlenmeyer kolv. Sterilisera genom autoklavering.
- Omedelbart efter autoklavering, placera agarlösningen i ett 55 °C vattenbad i 15 min.
- Ta bort agarlösningen från vattenbadet och tillsätt 40 ml 5x M8 minimimedia, 200 μL 1 M MgSO4,2 ml 20% glukos och 5 ml 20% casaminosyror15. Fortsätt till steg 1.6 omedelbart efter blandning.
OBS: De slutliga koncentrationerna är 0,5% agar, 1 mM MgSO4,0,2% glukos och 0,5% casamino syror.
- Använd en 25 ml pipett för jämn volym och tillsätt 20 ml av den svärma agarlösningen per 10 cm i diameter Petriskål.
OBS: En fast volym av agarlösning är viktig, eftersom volymen påverkar torktiden och fukthalten i agar. Undvik bubblor när du gör den svärma agar plattor. - Låt agar att stelna genom att placera de svärmande agarplattorna i en enda stapel med lock på i 1 h på bänken vid rumstemperatur. Slå på avfuktaren för att minska den relativa luftfuktigheten i rummet till 40–50% 1 h före nästa steg.
- Torka de svärmande agarplattorna i ytterligare 30 minuter med locken av i en laminär flödeshuva på 300 ft3/min med 40–50% relativ luftfuktighet vid rumstemperatur. Torka insidan av locken genom att placera dem uppåt i laminära flödeshuven. Förvara vimlar agarplattor vid 4 °C i upp till 24 timmar.
- Förbered svart 10 cm Petriskållock för bildbehandling genom att jämna ut lockets insida med sandpapper. Lägg locken i en förpackningslåda och placera förpackningen under en kemisk huva. Spraya inuti locken med svart sprayfärg. Låt locken torka.
Svarta lock kan återanvändas för ytterligare experiment. Det är viktigt att locken är målade så att de inte reflekterar ljus under skanningen.
2. Tillväxt av P. aeruginosa och plätering villkor
- Förbered 400 ml lysogenybuljong (LB) genom att tillsätta 10 g LB-Miller pulver blanda i 400 ml ddH2O. För 2% LB-agar Petri rätter, tillsätt ytterligare 8 g agar. Autoklav för att sterilisera.
- Häll 20 ml smält LB-agar medium i 10 cm diameter Petri rätter och låt dem stelna vid rumstemperatur över natten. Förvara flytande media i rumstemperatur och agarplattor vid 4 °C.
- Streak P. aeruginosa på en LB-agar Petri skål från ett fryst lager lagras vid -80 °C med sterila slingor eller träpinnar. Inkubera petriskålen upp och ner över natten vid 37 °C. Förvara LB-agar plattan vid 4 °C i upp till 1 vecka.
- Välj en enda koloni från petriskålen med en steril ögla eller träpinne, inokulera den i 2 ml LB-medium och inkubera kulturen till mättnad över natten (16–18 h) vid 37 °C i ett rulltrummaset vid 100 varv/min.
- Pipet 5 μL nattkultur från steg 2.4 med hjälp av en P20 pipet och plats i mitten av den svärmande agarplattan genom att närma sig pipetspetsen i en vinkel (10–45°) 2,5 cm ovanför spottyta, pipettera ner till det första stoppet och vidröra agar med endast vätskedroppen (figur 1B).
- Undvik att vidröra agar med pipet spetsen eftersom det skadar agar. Använd en mall för att placera platsen konsekvent över olika svärma agar plattor (Kompletterande figur S1).
- För traditionella svärmande analyser, använd endast mittpunkten och hoppa till steg 2.8. För kollektiva stressresponsanalyser fortsätter att steg 2.6 (för faginfektion) eller steg 2.7 (för antibiotikastrens).
- För faginfektion, blanda 30 μL nattkultur av P. aeruginosa från steg 2.4 med 6 μL av 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir20. Fortsätt omedelbart till nästa steg.
- Pipet 6 μL av P. aeruginosa-fagblandningen från steg 2.6 med hjälp av en P20 pipet och fläck på 6 lika långt satellitlägen på en koncentrisk cirkel på 2,8 cm radie som är centrerad vid petriskålen genom att närma sig pipetspetsen i en vinkel (10 till 45°) 2,5 cm ovanför spottytragen, pipettera ner till det första stoppet och vidrör agar med endast vätskedroppen (bild 1C).
- Undvik att vidröra agar med pipet spetsen eftersom det skadar agar. Använd en pläteringsmall för konsekvens(tilläggsfigur S1). Fortsätt till steg 2.8.
- För antibiotikabehandlingar, blanda 30 μL nattkultur P. aeruginosa från steg 2.4 med 6 μL 3 mg/ml gentamycin, 10 μL 100 mg/mL kanamycin, eller 7,5 μL 100 mg/ml fosfomycin. Fortsätt omedelbart till nästa steg.
- Pipet 6 μL antibiotikabehandlad P. aeruginosa från steg 2.7 med hjälp av en P20 pipett och plats på 6 lika långt satellitpositioner på en 2,8 cm radie koncentrisk cirkel om mitten av skålen genom att närma sig pipettspetsen i en vinkel (10 till 45 °) 2,5 cm ovanför spottyta, pipettning ner till det första stoppet, och vidröra agar med endast vätskedroppen (figur 1D).
- Undvik att vidröra agar med pipet spetsen eftersom det skadar agar. Använd en pläteringsmall för konsekvens(tilläggsfigur S1). Fortsätt till steg 2.8.
- Sätt tillbaka de genomskinliga petriskålslocken mot svarta lock i steg 1.9 (bild 2A).
- Placera de svärmande agarplattorna på en skanner i en inkubator inställd på 37 °C med ett 10 L vattenbad för att bibehålla luftfuktigheten vid 75 % (figur 1E, figur 2B).
VARNING: Stör inte fläckiga celler på de svärmande agarplattorna. Håll plattorna uppåt hela tiden.
3. Bild förvärv med Scanner
- Minska den omgivande belysningen av petriskålarna genom att fästa svart matttyg på ett rack 40–60 cm ovanför flakdokumentskannern. Säkra den med dragkedjor (figur 2B).
- Skannern kommer att styras med hjälp av en skanningsprogramvara och ett automatiskt skriptprogram.
- I skanningsprogrammet väljer du Hemläge (bild 3A). Ta bilder i färg genom att välja Färg under Bildtyp. Om du vill ställa in bildkvaliteten väljer du Annat under Mål och justerar upplösningen till 300 dpi. Behåll standardstorleken för bilderna genom att välja Original för målstorlek. Lämna alla alternativ under Bildjusteringar omarkerade för standardbildkvalitet.
Målstorleken är inställd på Original som standard. Om du vill välja andra alternativ för Målstorlek klickar du på Förhandsgranska först.
- I skanningsprogrammet väljer du Hemläge (bild 3A). Ta bilder i färg genom att välja Färg under Bildtyp. Om du vill ställa in bildkvaliteten väljer du Annat under Mål och justerar upplösningen till 300 dpi. Behåll standardstorleken för bilderna genom att välja Original för målstorlek. Lämna alla alternativ under Bildjusteringar omarkerade för standardbildkvalitet.
- Ställ in spara sökvägen för bilder genom att klicka på mappikonen till höger om Skanna för att öppna Filsparinställningar(Bild 3A).
- Välj mappmål för att spara bilder genom att välja Annat under Plats och klicka på Bläddra. Välj en mapp för att spara bilderna.
- Namnge bilderna i textrutan Prefix. Ange startnummer 001 för att börja namnge sekvensen för bilderna. Ställ in filformatet på JPEG genom att välja JPEG (*.jpg) för typ under Bildformat och klicka på Alternativ för att justera för Detaljer. Ange bildformatkvaliteten genom att justera komprimeringsnivån till 16, Kodning till Standard och kontrollera Bädda in ICC-profil. Klicka på OK för att stänga fönstret (bild 3B).
- Lämna det första alternativet avmarkerat ("Skriv över alla filer med samma namn") och markera nästa alternativ 3 ("Visa den här dialogrutan före nästa genomsökning", "Öppna bildmappen efter skanning" och "Visa dialogrutan Lägg till sida efter skanning"). Klicka på OK för att stänga fönstret
- Kontrollera bildkvaliteten genom att klicka på Förhandsgranska. Förhandsgranskningsfönstret visas och ikonen Skanna blir funktionell (bild 3C).
- Använd skriptprogramvaran för att automatisera bildinhämtningen. Det angivna skriptet klickar på Skanna i skanningsfönstret och OK i fönstret Spara filer med 30 minuters intervall.
- Importera skriptet genom att klicka på Aktivitet | Importera och välj både Single_scan.tsk och Idle_scanning.tsk (TSK-filer som tillhandahålls som tilläggsfiler 1 och 2). Se figur 3D.
OBS: Single_scan.tsk klickar på knappen Skanna i fönstret Skanna och OK i fönstret Spara filer. Idle_scanning.tsk aktiverar Single_scan.tsk var 30:e minut. Man kan ändra skanningsfrekvensen genom att ändra aktiveringen av Idle_scanning.tsk. - Aktivera automatisk skanning med 30 minuters intervall genom att välja både inaktiv skanning (importerad) och Enkel skanning (importerad),högerklicka på Inaktiv skanning (importerad)och vänsterklicka på Aktiverad(Bild 3D, Tilläggsbild S2).
Automatisk skanning körs tills användaren manuellt stoppar skriptet. Om du vill stoppa skriptet väljer du Inaktiv skanning (importerad),högerklickar på Inaktiv skanning (importerad)och vänsterklickar på Aktiverad. Bocken kommer att tas bort.
- Importera skriptet genom att klicka på Aktivitet | Importera och välj både Single_scan.tsk och Idle_scanning.tsk (TSK-filer som tillhandahålls som tilläggsfiler 1 och 2). Se figur 3D.
4. Sammanställa Time-lapse Bilder och mäta Swarm Repulsion
- Utför filmredigering och bildanalys med ImageJ.
- Importera alla skannade bilder till ImageJ genom att klicka på Arkiv | Import | bildsekvens och markera bilderna. I fönstret Sekvensalternativ markerar du Konvertera till RGB för att hålla bilderna i färg. Antal bilder anger antalet valda bilder.
- Håll startbilden vid 1 för att starta från den första bilden i mappen och Skala bilder med 100% för att spara ursprungliga storleken på bilderna. Lämna Använd virtuell stack avmarkerad. Klicka på OK och vänta tills bilderna läses in (Bild 4A).
- Ställ in videokomprimeringsnivån till 100 genom att klicka på Redigera | Alternativ | Ingång/utgång... och justera JPEG-kvaliteten till 100.
- Spara filen som en .avi genom att klicka på Arkiv | Spara som | AVI. Justera komprimering till JPEG och bildhastighet till 5 fps (bild 4B). Spara .avi-time-lapse i önskad mapp.
- För att kvantifiera avskyavvikelseavvikelser öppnar du en bild nära slutet av den svärma perioden i ImageJ. Klicka på Arkiv | Öppna och markera bilden. Justera skalan genom att klicka på Analysera | Ange Skala och ställa in Avstånd i pixlar till 118, Känt avstånd till 1, Pixel-proportioner till 1,0 och Längdenhet till cm (bild 4C). Lämna Global omarkerad. Stäng fönstret genom att klicka på OK.
- Klicka på den raka ikonen och mät från mitten av kolonin vid satellitpositionen till kanten av den svärmande befolkningen. Välj Analysera | Mät för att få ett nytt fönster att visas med måtten (Längd) (bild 4D).
OBS: Använd "+" för att zooma in närmare och "-" för att zooma ut.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stegen för att växa P. aeruginosa, betona cellerna, och bild den svärmande agar plattor är representerade i figur 1. Vi inokulerade en enda koloni av vild typ P. aeruginosa UCBPP-PA14 stam från en LB-agar platta i 2 ml LB buljong över natten vid 37 °C och fläckig 5 μL i mitten av den svärma agar plattan. Time-lapse imaging av denna platta avslöjar inledande tillväxt i form av en koloni i mitten och sedan sprida tendrils radiellt från kolonin (Video 1). För kollektiva stressresponsanalyser blandas förutom att upptäcka P. aeruginosa i mitten 30 μL av samma över natten-odling med 6 μL av 1 x 1012 pfu/mL DMS3vir eller 6 μL av 3 mg/ml gentamycin vid ett förhållande av 5:1 och 6 μL är fläckig vid satellitpositionerna. Svärmar flytta från mitten av svärmande agar plattor till periferin och stöts bort av en stresssignal som avges av de bakterier som var infekterade med fager (Video 2, övre vänstra plattan) eller behandlas med gentamycin (Video 2, övre högra plattan). Fager (Video 2,nedre vänstra plattan) eller gentamycin (Video 2,nedre högra plattan) fläckig ensam vid satellitpositioner inte orsakar svärmande populationer för att undvika dessa områden.
Figur 1: Schematisk av P. aeruginosa svärmande analys och kollektiv stressrespons. (A) P. aeruginosaceller odlas över natten (16–18 h till OD600 av ca 1,5) i LB-buljong vid 37 °C och(B)som fläckig i mitten av den svärma agarplattan. Över natten kulturer blandas med(C)fager eller (D) antibiotika och fläckig på satellitpositioner för kollektiva stressrespons analyser. (E)Upp till 6 plattor avbildas på en skanner med 30 min mellanrum för 16–18 timmar vid 37 °C. Efter 18 h, P. aeruginosa svärmar populationer undvika (F) celler infekterade med eller (G) celler som behandlats med antibiotika (gentamycin). H) P. aeruginosa populationer svärmar över den svärma agar plattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Skannerinställning inuti inkubatorn. (A)Svart petriskål lock konstruerade i avsnitt 1. Dessa lock används under skanningen för att minska ljusreflektioner och ersätta tydliga petriskålslock. B)Flakdokumentskannern placeras i en inkubator som är inställd på 37 °C. Sex plattor med svarta lock placeras på skannern (vänster bild). Svart matt tyg är fäst vid racket 60 cm ovanför skannern för att ytterligare minska reflektioner och herrelösa ljus (höger bild). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 3: Automatiserat bildinsamling från fladdriska dokumentskannern med hjälp av skannings- och automatisk skriptprogramvara. (A) Skärmdump av huvudskanningsfönstret. Val av bildtyp (färg) och upplösning (300 dpi). Den röda fyrkanten anger mappikonen för att öppna fönstret Filsparinställningar. Knappen Förhandsgranska kan tryckas in men knappen Skanna är inaktiverad. (B) Skärmdump av fönstret Spara filer för att ange mappmål för att spara bilder, namnge bilderna och välja formatet på bilderna (vänster). Fönstret Plug-In Settings används för att ställa in bildformatets kvalitet (höger). (C)Skärmdump av Scan fönster efter att ha klickat på Förhandsgranska. Knappen Skanna kan klickas när en förhandsgranskning har hämtats. Programmet kan nu automatiseras med hjälp av skriptprogramvara (Material). (D)Skärmdump av skriptprogramvaruerna som anger importknappen som används för att importera automatiseringsskripten (vänster). När Single_scan.tsk och Idle_scanning.tsk importeras visas dessa som uppgifter i huvudfönstret (höger). När du har markerat båda uppgifterna och högerklickat på dem visas knappen Aktiverad. Vänsterklicka Aktivera startar skripten för att automatiskt skanna med 30 min mellanrum (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bildanalys av svärmande undvikande med ImageJ. (A) Steg för att importera en bildsekvens från tidsfördröjningsskannerbilderna. Klicka på Arkiv | Import | Bildsekvens i huvudfönstret ImageJ (vänster) visar fönstret Sekvensalternativ (höger) och öppnar alla skannade bilder. Den röda fyrkanten anger det markerade alternativet för att läsa in bilder i RGB-format. Alla andra alternativ lämnas som standard. (B)Steg för att spara time-lapse video i AVI-format. Välja fil | Spara som | AVI tar upp Spara som AVI fönster. Komprimering är inställt på JPEG och bildhastighet till 5 fps. (C)Ställa in skalenheter för bilder. Välja Analysera | Ställ in Skala för att upprätta fönstret Ange skalning. För 300 dpi-bilder är lämplig skala 118 pixlar/cm.(D)Mätning av undvikande från svärmande populationer. Ett gult fodrar dras från centrera av de stressade kolonierna till kanta av tendrilsna. Välja Analysera | Mått rapporterar längden på raden i ett nytt fönster med namnet Resultat. Ctrl + M är ett kortkommando som utför måttet utan att välja menyalternativen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativa svärmar av P. aeruginosa. P. aeruginosa svärmar populationer på svärmande agarplattor som är(A) torra,(B)normala, (C) fuktig, och (D) extra fuktig. Torr svärmande agar plattor hämmar svärm graden av P. aeruginosa och minska antalet tendrils. Fuktig svärmande agar plattor orsaka bildandet av stora tendrils. Under extra fuktiga förhållanden bildas tendrils ojämnt i de svärmande agarplattorna. Torktider i den laminära flödeshuven och luftfuktigheten i omgivningen har betydande effekter på den svärmande plattans fukthalt. Rätterna är 10 cm petriskålar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1: Time-lapse film av svärmande. Wild-typ P. aeruginosa sågs i mitten av den svärmande plattan och avbildades på skannern under loppet av 22 h. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2: Time-lapse film av den kollektiva stressrespons. Wild-typ P. aeruginosa sågs i mitten av den svärma plattan. Satellitpositioner sågs med P. aeruginosa som blandas dessutom med (övre vänstra) eller (övre högra) gentamycin, eller fläckig enbart med (nedre vänstra) eller (nedre högra) gentamycin. Vita punkter visar mitten av fläckarna. Plattor avbildade under loppet av 16 h. Klicka här för att se den här videon. (Högerklicka för att ladda ner.)
Kompletterande figur S1: Pläteringsmall för att upptäcka P. aeruginosa-celler. Den mellersta svarta pricken representerar spotting området 5 μL över natten P. aeruginosa kultur. Radien för den inre cirkeln är 2,8 cm från mitten av plattan. Skärningspunkten mellan den inre cirkeln och de raka linjerna över den yttre cirkeln indikerar spotting området 6 μL stressade P. aeruginosa,infekterade eller antibiotika behandlade celler. Den yttre cirkeln representerar omkretsen av 10 cm Petriskål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild S2: Makrokommandon för att regelbundet börja skanna med hjälp av ett skriptprogram. (A) Makrokommandona i Single_scan.tsk flyttar markören till Scan i scan-fönstret, klickar på Skanna, flyttar till OK i fönstret Spara filer och klickar på OK. (B) Kommandon för att skanna i 30 min intervall. Aktiviteten Idle_scanning.tsk startar Single_scan.tsk och är inställd på att aktiveras i 30 min intervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll fokuserar på att minimera variationen i svärmande agar plattor och ger en enkel och billig metod för att förvärva time-lapse bilder av P. aeruginosa svärmar och svarar på stress. Detta förfarande kan utvidgas till att omfatta andra bakteriesystem genom att anpassa mediesammansättningen och tillväxtförhållandena. För P. aeruginosa, även om M9 eller FAB minimalt medium kan användas för att inducera svärmande16,21, det protokoll som presenteras här använder M8 medium med casamino syror, glukos och magnesiumsulfat6. P. aeruginosa svärmar är känslig för medelhög sammansättning såsom järntillgång och näringskällor inklusive aminosyror22,23,24. Därför illustrerar valet av media för svärmande agar plattor en viktig aspekt av analys svärmande motilitet.
Att kontrollera för fuktighet och temperatur i ett öppet laboratorieområde är en av de största utmaningarna för konsekvensen av svärmanalyser. Säsongsmässiga förändringar bidrar till variationer i den svärmande agarplattor fukt, vilket avsevärt kan påverka svärma mönster. Därför krävs konstant kontroll av den relativa luftfuktigheten för att säkerställa optimal plåtkvalitet. Starta avfuktaren 1 h innan du torkar de svärma agarplattorna under den laminära flödeshuven kommer att styra den relativa fuktigheten till konstant 45%, hålla torktiden till 30 min. Om omgivningsfukten inte kan kontrolleras är det en möjlig enkel lösning för att kompensera för fuktiga miljöer att öka torktiden. Under svärmande bör den relativa luftfuktigheten ligga kvar på 70 % i 37 °C-inkubatorn för att förhindra att agarplattorna torkar ut. En vattenbehållare utan tak i inkubatorn kan fungera som en vattenreservoar. Torra svärmande agarplattor saktar ner utvecklingen av svärmande populationer och minskar antalet tendrils medan fuktiga plattor orsakar bred tendrilstruktur (figur 5A–C). Extra fuktiga svärma plattor förhindra klar tendril bildning och orsaka tendrils att sprida sig i ett ojämnt mönster (Fig 5D). Den metod som beskrivs här kan användas för att upprätthålla en konstant fuktig miljö som säkerställer konsekvensen av svärmande på plattor (figur 5B, Video 1). Dessutom, plåtstorlek och agar tjocklek spelar en roll i att behålla fukt i plattan. Vi har använt 10 cm diameter petriskålar och lagt till 20 ml svärmande agar lösning per tallrik för att säkerställa konsistens. Hällplattor utan att mäta volymer rekommenderas inte. På grund av de många variabler som påverkar den svärma analysen rekommenderar vi att du optimerar analysen till lokala laboratorieförhållanden och vi betonar vikten av att utföra flera biologiska replikat på separata satser av plattor för att observera konsekventa och jämförbara svärma mönster.
Fördelen med time-lapse imaging metod för att spela in svärmande motilitet är förmågan att observera utvecklingen av motilitet utan att behöva störa svärmar. Vår metod skapar bekvämt time-lapses av 6 plattor samtidigt under samma förhållanden, vilket ger både en kontrollerad miljö för samtidig bedömning av flera stammar, flera experimentella förhållanden, eller biologiska replikat. Användningen av sex satellitpositioner på varje skylt underlättar dessutom statistisk analys och användningen av ImageJ möjliggör kvantifiering av svärmande avsky.
Förfarandet beskrivs här är en enkel metod för att studera samspelet mellan sub-populationer av P. aeruginosa: en hälsosam svärmande population och stressade celler. Utöver DMS3vir och gentamycin, ytterligare typer av fager, antibiotika, och konkurrerande bakterier eller svampar kan användas för att studera stress signalering. Även om denna metod fokuserar på P. aeruginosa svärmande motilitet, andra bakteriearter som S. aureus och E. coli uppvisar också svärma mönster, men de kräver anpassade medier för att svärma10,11. Genom att optimera mediekompositioner och plåtvillkor kan denna metod användas för att analysera svärmande, svärma interaktioner mellan bakteriestammar och stressreaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
J.-L.B., A.S., och N.M.H-K. skrev och reviderade manuskriptet. Alla författare designade experimenten. J.-L.B. utförde experimenten och analysen. Detta arbete stöddes av NIH tilldelning K22AI112816 och R21AI139968 bidrag till A.S. och university of California. N.M.H-K. stöds av Lundbeckstipendium R220-2016-860 och R251-2017-1070. Finansiärerna hade ingen roll i beslutet att lämna in arbetet för publicering. Vi har inga konkurrerande intressen att deklarera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bacto agar, dehydrated | BD Difco | 214010 | For LB-agar plate and swarming agar plate |
| Casamino acids | BD Difco | 223050 | For swarming media |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. For swarming media |
| Fosfomycin disodium salt | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Stock concentration: 200 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Gentamycin sulfate | Sigma-Aldrich | G1914 | Stock concentration: 3 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 60615 | Stock concentration: 100 mg/mL. Dissolved in ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | For LB broth and LB-agar plates |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | For swarming media |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P0662 | For 5x M8 media |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For 5x M8 media |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Chemical | S373 | For 5x M8 media |
| Strains | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 strain |
| DMS3vir | O'Toole lab | DMS3vir20 | Bacteriophage |
| Supplies | |||
| Aluminium oxide sandpaper | 3M | 150 Fine | For black lids |
| Black fabric | Joann | PRD7089 | Black fabric |
| Black spray paint | Krylon | 5592 Matte Black | For black lids |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Glass storage bottles | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1,000 mL |
| 8 inches zip ties | Gardner Bender | E173770 | For attaching black matte fabric |
| Petri dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher | FB0875712 | 100 mm x 15 mm polystyrene plates |
| Wooden sticks | Fisher | 23-400-102 | For streaking and inoculating bacteria |
| Equipment | |||
| Autoclave | Market Forge Industries | STM-E | For sterilizing reagents |
| 25 mL pipette | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Dehumidifier | Frigidaire | FAD704DWD 70-pint | For maintaing room relative humidity at about 45% |
| ImageJ | NIH | v1.52a | Software for image analysis |
| Incubator | VWR | 89032-092 | For growth of bacteria at 37 °C |
| Isotemp waterbath | Fisher | 15-462-21Q | For cooling media to 55 °C |
| Laminar flow hood | The Baker Company | SG603A | For drying plates |
| P-20 pipet | Gilson | F123601 | Spotting on swarming agar plates |
| Pipette Controller | BrandTech | accu-jet | To pipet 20 mL for swarming agar plates |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | For growth of bacteria at 100 rpm |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 Photo | Scanner for imaging plates |
| Scanner automation software | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | For 30 min internals imaging |
| Scanner image acquisition software | Epson | v9.9.2.5US | Software for imaging plates |
References
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
- Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
- Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
- Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
- Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O'Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
- Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, Reading, England. Pt 8 2005-2013 (2003).
- Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
- Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
- Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
- Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
- Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
- Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, Clifton, N.J. 67-72 (2014).
- Tremblay, J., Richardson, A. -P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
- Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
- Bru, J. -L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
- van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
- Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
- Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
- Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
- Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
- Bernier, S. P., Ha, D. -G., Khan, W., Merritt, J. H., O'Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).
