Summary

Bakteriyel Sürülerin Hızlandırılmış Görüntülemesi ve Kolektif Stres Tepkisi

Published: May 23, 2020
doi:

Summary

Biz psödomonas aeruginosa sürüleri bakteriyofaj (faj) ve antibiyotik stres bir flatbed belge tarayıcı kullanarak yanıt yüksek çözünürlüklü zaman atlamalı filmler üretmek için basit bir yöntem detay. Bu prosedür, sürü dinamiklerini izlemek için hızlı ve basit bir yöntemdir ve diğer bakteri türlerinin hareketliliğini ve büyümesini incelemek için uyarlanabilir.

Abstract

Swarming Pseudomonas aeruginosa ve Escherichia colidahil olmak üzere birçok bakteri türlerinde gözlenen yüzey hareketliliği bir şeklidir. Burada, yoğun bakteri popülasyonları, saat boyunca karakteristik tendril şekilli topluluklarda büyük mesafeler boyunca hareket eder. Swarming orta nem, nem ve besin içeriği de dahil olmak üzere çeşitli faktörlere duyarlıdır. Buna ek olarak, antibiyotik veya bakteriyofaj (faj) tarafından stresli P. aeruginosa gözlenen kolektif stres yanıtı, stres içeren alana yaklaşan sürüleri iter. Burada açıklanan yöntemler, sürücürün nasıl kontrol altına alınabildiğini ele adamaktadır. Düz yataklı belge tarayıcısı kullanarak sürü dinamiklerini ve kolektif stres tepkisini yüksek zamansal çözünürlükle izlemek ve sürülerin nicel analizini nasıl derleyip gerçekleştirebileceğimizi açıklamak için basit bir yöntem sıyoruz. Bu basit ve uygun maliyetli yöntem, sürünün hassas ve iyi kontrollü bir şekilde ölçülmesini sağlar ve diğer plaka bazlı büyüme tahlillerine ve bakteri türlerine de genişletilebilir.

Introduction

Swarming antibiyotik direnci ve ev sahibi1virülans faktörlerin üretimini artırır koordine bakteriyel hareketlilik kolektif bir şeklidir1 ,2,3. Bu çok hücreli davranış akciğerlerde epitel zarları kapsayan mukoza katmanları benzer yarı katı yüzeylerde oluşur4,5. Biyosürfamaddeler genellikle yüzeylerde yüzey gerilimi aşmak için kalabalık popülasyonlar tarafından üretilen ve bunların üretimi karmaşık hücre-hücre sinyal sistemleri tarafından düzenlenir, ayrıca çoğunluk algılama olarak bilinen6,7,8. Bakteri birçok tür sürü yeteneğine sahiptir, Pseudomonas aeruginosadahil, Staphylococcus aureus, ve Escherichia coli9,10,11,12. Bakteriler tarafından oluşturulan sürü desenleri çeşitlidir ve besin bileşimi, gözeneklilik ve nem13,14dahil olmak üzere yüzey tabakasının fiziksel ve kimyasal özelliklerinden etkilenir. Yüzey özelliklerine ek olarak, büyüme sıcaklığı ve ortam nemi sürü dinamiği çeşitli yönlerini etkiler, swarming oranı ve desenleri de dahil olmak üzere12,13,14,15. Sürüleri etkileyen büyüme değişkenleri, deneysel tekrarlanabilirliği ve sonuçları yorumlama yeteneğini etkileyen zorluklar yaratır. Burada, zaman atlamalı görüntüleme yoluyla bakteri sürülerinin dinamiklerini izlemek için basit bir standart yöntemi tanımlıyoruz. Yöntem, swarming ilerlemesini önemli ölçüde etkileyen kritik büyüme koşullarının nasıl kontrol edilebildiğini açıklar. Geleneksel sürü analizi yöntemleriyle karşılaştırıldığında, bu hızlandırılmış görüntüleme yöntemi, uzun süreler boyunca ve yüksek çözünürlükte aynı anda birden fazla sürünün hareketliliğini izlemeyi sağlar. Bu hususlar, sürülerin izlenmesinden elde edilebilen verilerin derinliğini artırır ve sürüleri etkileyen faktörlerin belirlenmesini kolaylaştırır.

P. aeruginosa swarming üretimi ve rhamnolipidler ve 3-(3-hidroksyalkanoyloxy) alkanoik asitlerinçevreye,6,16salınımı ile kolaylaştırılır. Faj virüsü ile antibiyotik veya enfeksiyon alt öldürücü konsantrasyonları stres giriş sürüleri organizasyonu etkiler. Özellikle, Bu stresler P. aeruginosa prosing molekül 2-heptyl-3-hidroksi-4-kinolon, ayrıca Pseudomonas quinolone sinyal (PQS) 17 olarak bilinen serbest bırakmak için neden17,18. İki sürü popülasyonu içeren sürü tahlillerinde, strese bağlı popülasyon tarafından üretilen PQS, işlenmemiş sürüleri stres içeren alana girmekten uzaklaştırır(Şekil 1). Bu toplu stres tepkisi yakındaki tehditler hakkında P. aeruginosa uyarır bir tehlike iletişim sinyal sistemi oluşturur18,19. P. aeruginosaüzerinde stresin etkileri , kolektif stres yanıtı aktivasyonu, ve sürülerin itme burada açıklanan hızlandırılmış görüntüleme yöntemi kullanılarak görselleştirilebilir. Burada açıklanan protokol nasıl açıklanabilir: (1) swarming için agar plakaları hazırlamak, (2) kültür P. aeruginosa tahliller iki tür (geleneksel swarming tahliller veya toplu stres tepkisi tahlilleri) (Şekil 1), (3) zaman atlamalı görüntüleri elde, ve (4) görüntüleri derlemek ve analiz etmek için ImageJ kullanın.

Kısaca, P. aeruginosa bir gecede kültürden bir sürü agar plaka ortasında tespit edilirken P. aeruginosa faj ile enfekte veya antibiyotik ile tedavi uydu pozisyonlarında tespit edilir. P. aeruginosa sürüsünün ilerlemesi, nem le ilgili 37 °C inkübatöre yerleştirilen bir tüketici belgesi nde yassı bir tarayıcıda izlenir. Tarayıcı, genellikle 16-20 saat boyunca, düzenli aralıklarla plakaları tarayan bir yazılım tarafından kontrol edilir. Bu yöntem, altı 10 cm’ye kadar sürühalinde eşzamanlı zaman atlamalı videolar verir. Görüntüler filmlerhalinde derlenir ve sürülerin strese bağlı popülasyonlar tarafından itilmesi serbestçe kullanılabilir ImageJ yazılımı kullanılarak ölçülür. Farklı sürü deneyleri arasında tutarlılık ve tekrarlanabilirlik sağlamak için özel önem verilir.

Protocol

1. P. aeruginosa Swarming Time-lapse Görüntüleme için Swarming Agar Plakaları Hazırlanması 500 mL çift distile suya 64 g Na2HPO4•7H2O, 15 g KH2PO4ve 2,5 g NaCl ekleyerek cam2şişede 5x M8 minimum ortam 1 L hazırlayın. Sıvı ortamı oda sıcaklığında sterilize etmek ve depolamak için son hacmi ilave ddH2O. Otoklav ile 1 L’ye ayarlayın. 50 mL ddH’da 24,6 g MgSO4•7H2O ekleyerek…

Representative Results

P. aeruginosabüyümek için adımlar, hücreleri stres, ve görüntü swarming agar plakaları Şekil 1temsil edilmektedir. Biz 37 ° c gecede LB suyu 2 mL bir LB-agar plaka bir LB-agar plaka vahşi tip P. aeruginosa UCBPP-PA14 suşu tek bir koloni aşılanmış ve swarming agar plaka merkezinde 5 μL tespit. Bu plakanın hızlandırılmış görüntüleme merkezinde bir koloni şeklinde ilk büyüme ortaya koymaktadır ve daha sonra koloniden radyal tendrils yayılıyor(Video …

Discussion

Bu protokol, agar plakaları sürühalindeki değişkenliği en aza indirmeye ve P. aeruginosa swarming ve strese yanıt veren hızlandırılmış görüntüleri elde etmek için basit ve düşük maliyetli bir yöntem sağlamaya odaklanır. Bu prosedür, ortam kompozisyonu ve büyüme koşulları uyarlayarak görüntü diğer bakteri sistemleri uzatılabilir. P. aeruginosaiçin , Her ne kadar M9 veya FAB minimal orta sürücünü ikna etmek için kullanılabilir16,<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

J.-L.B., A.S., ve N.M.H-K. taslağı yazdı ve gözden geçirdi. Deneyleri tüm yazarlar tasarladı. J.-L.B. deneyleri ve analizleri yaptı. Bu çalışma NIH ödülü K22AI112816 ve R21AI139968 a.s. ve University of California tarafından desteklenmiştir. N.M.H-K. Lundbeck Bursları R220-2016-860 ve R251-2017-1070 tarafından desteklenmiştir. Fon, eserin yayına sunulması kararında hiçbir rol sahip değillerdi. Beyan etmek için rekabet eden bir çıkarımız yok.

Materials

Reagents
Bacto agar, dehydrated BD Difco 214010 For LB-agar plate and swarming agar plate
Casamino acids BD Difco 223050 For swarming media
D-Glucose Fisher Chemical D16500 Dextrose. For swarming media
Fosfomycin disodium salt Tokyo Chemical Industry F0889 Stock concentration: 200 mg / mL. Dissolved in ddH2O
Gentamycin sulfate Sigma-Aldrich G1914 Stock concentration: 3 mg / mL. Dissolved in ddH2O
Kanamycin sulfate Sigma-Aldrich 60615 Stock concentration: 100 mg / mL. Dissolved in ddH2O
LB-Miller BD Difco 244620 For LB broth and LB-agar plates
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma-Aldrich 230391 For swarming media
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P0662 For 5X M8 media
Sodium chloride Sigma-Aldrich S9888 For 5X M8 media
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Chemical S373 For 5X M8 media
Strains
Pseudomonas aeruginosa Siryaporn lab AFS27E.118 PA14 strain
DMS3vir O'Toole lab DMS3vir20 Bacteriophage
Supplies
Aluminium oxide sandpaper 3M 150 Fine For black lids
Black fabric Joann PRD7089 Black fabric
Black spray paint Krylon 5592 Matte Black For black lids
Erlenmeyer flask Kimax 26500 250 mL
Glass storage bottles Pyrex 13951L 250 mL, 500 mL, 1000 mL
8 inches zip ties Gardner Bender E173770 For attaching black matte fabric
Petri dishes (100 mm x 15 mm) Fisher FB0875712 100 x 15 mm polystyrene plates
Wooden sticks Fisher 23-400-102 For streaking and inoculating bacteria
Equipment
Autoclave Market Forge Industries STM-E For sterilizing reagents
25 mL pipette USA Scientific, Inc. 1072-5410 To pipet 20 mL for swarming agar plates
Dehumidifier Frigidaire FAD704DWD 70-pint For maintaing room relative humidity at about 45%
ImageJ NIH v1.52a Software for image analysis
Incubator VWR 89032-092 For growth of bacteria at 37 °C
Isotemp waterbath Fisher 15-462-21Q For cooling media to 55 °C
Laminar flow hood The Baker Company SG603A For drying plates
P-20 pipet Gilson F123601 Spotting on swarming agar plates
Pipette Controller BrandTech accu-jet To pipet 20 mL for swarming agar plates
Roller Drum New Brunswick TC-7 For growth of bacteria at 100 rpm
Scanner Epson Epson Perfection V370 Photo Scanner for imaging plates
Scanner automation software RoboTask Lite v7.0.1.932 For 30-min internals imaging
Scanner image acquisition software Epson v9.9.2.5US Software for imaging plates

References

  1. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  2. Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E. Swarming motility: a multicellular behaviour conferring antimicrobial resistance. Environmental Microbiology. 11 (1), 126-136 (2009).
  3. Overhage, J., Bains, M., Brazas, M. D., Hancock, R. E. W. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is a complex adaptation leading to increased production of virulence factors and antibiotic resistance. Journal of Bacteriology. 190 (8), 2671-2679 (2008).
  4. Yeung, A. T. Y., et al. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is controlled by a broad spectrum of transcriptional regulators, including MetR. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5592-5602 (2009).
  5. Girod, S., Zahm, J. M., Plotkowski, C., Beck, G., Puchelle, E. Role of the physiochemical properties of mucus in the protection of the respiratory epithelium. The European Respiratory Journal. 5 (4), 477-487 (1992).
  6. Caiazza, N. C., Shanks, R. M. Q., O’Toole, G. A. Rhamnolipids modulate swarming motility patterns of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 187 (21), 7351-7361 (2005).
  7. Déziel, E., Lépine, F., Milot, S., Villemur, R. rhlA is required for the production of a novel biosurfactant promoting swarming motility in Pseudomonas aeruginosa: 3-(3-hydroxyalkanoyloxy)alkanoic acids (HAAs), the precursors of rhamnolipids. Microbiology. 149, 2005-2013 (2003).
  8. Dusane, D. H., Zinjarde, S. S., Venugopalan, V. P., McLean, R. J. C., Weber, M. M., Rahman, P. K. S. M. Quorum sensing: implications on rhamnolipid biosurfactant production. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 27, 159-184 (2010).
  9. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and pili. Journal of Bacteriology. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  10. Pollitt, E. J. G., Crusz, S. A., Diggle, S. P. Staphylococcus aureus forms spreading dendrites that have characteristics of active motility. Scientific Reports. 5, 17698 (2015).
  11. Burkart, M., Toguchi, A., Harshey, R. M. The chemotaxis system, but not chemotaxis, is essential for swarming motility in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2568-2573 (1998).
  12. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews. Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  13. Tremblay, J., Déziel, E. Improving the reproducibility of Pseudomonas aeruginosa swarming motility assays. Journal of Basic Microbiology. 48 (6), 509-515 (2008).
  14. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52338 (2015).
  15. Ha, D. -. G., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods in Molecular Biology. 1149, 67-72 (2014).
  16. Tremblay, J., Richardson, A. -. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environmental Microbiology. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  17. Morales-Soto, N., et al. Spatially dependent alkyl quinolone signaling responses to antibiotics in Pseudomonas aeruginosa swarms. The Journal of Biological Chemistry. 293 (24), 9544-9552 (2018).
  18. Bru, J. -. L., et al. PQS produced by the Pseudomonas aeruginosa stress response repels swarms away from bacteriophage and antibiotics. Journal of Bacteriology. , (2019).
  19. van Kessel, J. C. PQS signaling for more than a quorum: the collective stress response protects healthy Pseudomonas aeruginosa populations. Journal of Bacteriology. , (2019).
  20. Zegans, M. E., et al. Interaction between bacteriophage DMS3 and host CRISPR region inhibits group behaviors of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 191 (1), 210-219 (2009).
  21. Kamatkar, N. G., Shrout, J. D. Surface hardness impairment of quorum sensing and swarming for Pseudomonas aeruginosa. PloS One. 6 (6), 20888 (2011).
  22. Mattingly, A. E., Kamatkar, N. G., Morales-Soto, N., Borlee, B. R., Shrout, J. D. Multiple Environmental Factors Influence the Importance of the Phosphodiesterase DipA upon Pseudomonas aeruginosa Swarming. Applied and Environmental Microbiology. 84 (7), (2018).
  23. Boyle, K. E., Monaco, H., van Ditmarsch, D., Deforet, M., Xavier, J. B. Integration of Metabolic and Quorum Sensing Signals Governing the Decision to Cooperate in a Bacterial Social Trait. PLoS computational biology. 11 (5), 10004279 (2015).
  24. Bernier, S. P., Ha, D. -. G., Khan, W., Merritt, J. H., O’Toole, G. A. Modulation of Pseudomonas aeruginosa surface-associated group behaviors by individual amino acids through c-di-GMP signaling. Research in Microbiology. 162 (7), 680-688 (2011).

Play Video

Cite This Article
Bru, J., Siryaporn, A., Høyland-Kroghsbo, N. M. Time-lapse Imaging of Bacterial Swarms and the Collective Stress Response. J. Vis. Exp. (159), e60915, doi:10.3791/60915 (2020).

View Video