Summary
Protokolün genel amacı, hücre içermeyen protein sentezi için kullanılabilecek 1 cm2 düzlemsel substrat üzerinde bir milyondan fazla sipariş, üniforma, kararlı ve biyouyumlu femtolitre damlacıkları hazırlamaktır.
Abstract
Bilimsel enstrümantasyonun mekansal çözünürlük ve algılama duyarlılığındaki gelişmeler, biyolojik ve kimyasal araştırmalar için küçük reaktörlerin uygulanmasını mümkün kılabilir. Yüksek performanslı mikroreaktörlere olan talebi karşılamak için femtolitre damlacık dizisi (FemDA) cihazı geliştirdik ve büyük ölçüde paralel hücresiz protein sentezi (CFPS) reaksiyonlarında uygulamaya örnek verdik. Bir milyondan fazla tek tip damlacık, iki aşamalı bir yağ sızdırmazlık protokolü kullanılarak parmak büyüklüğünde bir alanda kolayca üretildi. Her damlacık hidrofilik bir alt ve hidrofobik bir yanak oluşan bir femtolitre mikrohazna demirledi. Hibrit hidrofilik-in-hidrofobik yapısı ve özel sızdırmazlık yağları ve yüzey aktif maddeler buharlaşma kaybı olmadan femtolitre uzayda femtolitre sulu çözeltisi stably istinat için çok önemlidir. Femtolitre konfigürasyonu ve FemDA cihazının basit yapısı minimum reaktif tüketimine olanak sağladı. Damlacık reaktörlerinin tek düze boyutu, büyük ölçekli nicel ve zaman-kurs ölçümleri ikna edici ve güvenilir yaptı. FemDA teknolojisi CFPS reaksiyonunun protein verimini her damlacıktaki DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirdi. Cihazın mikro imalatı, femtolitre damlacıklarının oluşumu ve mikroskobik görüntü verilerinin elde edilmesi ve analizi ile ilgili prosedürleri kolaylaştırdık. Optimize edilmiş düşük çalışma maliyeti ile ayrıntılı protokol FemDA teknolojisi standart temiz oda tesisleri ve kendi yerinde geleneksel floresan mikroskop olan herkes için erişilebilir hale getirir.
Introduction
Araştırmacılar biyo/kimyasal reaksiyonları gerçekleştirmek için reaktörleri kullanırlar. Reaktörün boyutunu küçültmek ve iş verimliliğini artırırken reaktif tüketimini azaltmak için deneysel verimi artırmak için önemli çabalar gösterilmiştir. Her iki açıdan da araştırmacıları ağır bir iş yükünden kurtarmayı, maliyeti azaltmayı ve araştırma ve geliştirmeyi hızlandırmayı amaçlamaktadır. Reaktör teknolojilerinin gelişimi hakkında reaksiyon hacimleri ve iş hacmi açısından net bir tarihsel yol haritası var: tek beaers / şişe / test tüpleri, mililitre tüpler, mikrolitre tüpler, mikrolitre 8-tüp şeritler, mikrolitre 96/384/1536-iyi plaka, ve mikroakışkan nanolitre / picoliter /femtolitre reaktörler1,2,3,4,5,66. Son yıllarda yarı iletken endüstrisinde ki entegre devre yongalarındaki transistörlerin özellik boyutunu küçültmeye benzer şekilde, biyo/kimyasal mikroreaktörler hacim azaltma ve sistem entegrasyonundan geçmaktadır. Bu tür küçük ölçekli araçlar hücre tabanlı veya hücresiz sentetik biyoloji, biyoüretim ve yüksek iş letibine prototipleme ve tarama8,9,,10,11,12üzerinde derin bir etkisi olmuştur. Bu yazı benzersiz bir damlacık dizi teknolojisinin geliştirilmesi bizim son çaba açıklar ve CFPS13,sentetik biyoloji ve moleküler tarama toplulukları için temel bir teknoloji14onun uygulama göstermektedir. Özellikle, FemDA cihazını herkes için erişilebilir hale getirmek için kasıtlı olarak optimize edilmiş ve düşük maliyetli bir protokol salıyoruz. Minyatürleştirilmiş cihaz için düşük maliyetli ve kullanımı kolay protokol üniversitelerin eğitim amaçlarına katkıda bulunacak ve teknolojinin yayılmasına yardımcı olacaktır.
FemDA, efemtolitre damlacıklarını 1cm 2'de 106'lık ultra yüksek yoğunlukta düzlemsel cam bir yüzey üzerinde hazırlar. Biz bir hidrofobik polimer kaplı, CYTOP15, cam substrat ve seçici kazınmış (kaldırıldı) CYTOP önceden tanımlanmış pozisyonlarda substrat üzerinde bir mikrooda dizi oluşturmak için. Böylece, ortaya çıkan mikrohazon hidrofobik yanak (CYTOP) ve hidrofilik alt (cam) oluşur. Sırayla desenli yüzey üzerinde su ve yağ akan zaman, su sıkışmış ve mikroodaları içine mühürlü olabilir. Hidrofilik-in-hidrofobik yapı mikroodaları dışında su püskürtmeiçin hayati önem taşımaktadır, bireysel mikroreaktörler izole, ve femtolitre alanı içinde küçük bir sulu çözüm istinat. Benzersiz özelliği başarıyla su-in-oil damlacıkları ve lipid bilayer mikrobölmeleri16,,17hazırlanması için uygulanmıştır. Prototip cihaz16ile karşılaştırıldığında, ilk cytop polimer tam bir kaldırma yanı sıra cam alt tam bir pozlama gerçekleştirmek için mikroüretim süreci optimize. CYTOP, cam, plastik ve silikon gibi geleneksel mikroreaktör malzemelerinden son derece düşük yüzey gerilimine (19 mN/m) daha düşük olan özel bir floropolimerdir. Onun iyi optik, elektrik, ve kimyasal performans zaten mikroakışkan cihazların yüzey tedavisinde kullanılmıştır18,19,20,21,22,,23,24. FemDA sisteminde, CYTOP yüzeyinde yağIyi ıslatma elde etmek için, yağ yüzey gerilimi katı yüzey25daha düşük olmalıdır. Aksi takdirde, katı yüzeyle temas eden sıvı yağ, yüzeye yayılmak yerine küresel olma eğilimindedir. Ayrıca, bazı popüler perflorokarbon yağlarının (örneğin, 3M FC-40)16 ve hidrofloroether yağlarının (örneğin, 3M Novec serisi) CYTOP'un amorf morfolojisi sonucunda CYTOP'u eritebileceğini ve damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon açısından şüpheli olduğunu bulduk. Neyse ki, daha düşük (< 19 mN/m) yüzey gerilimi sergileyen biyouyumlu ve çevre dostu bir yağ tespit ettik13. Biz de düşük konsantrasyonda seçilen yağ ve fonksiyon çözünebilir yeni bir yüzey aktif bulundu (0.1%, en az 10 kat daha önce bildirilen popüler olanlar26,27)13. Ortaya çıkan su/yağ arabirimi yüzey aktif madde ile stabilize edilebilir. Yağın yüksek buharlaşma oranı nedeniyle, yağ ile floş aşağıdaki, biz mikrochambers mühür ilk yerine başka bir biyouyumlu ve çevre dostu yağ uygulanır. İlk yağa (ASAHIKLIN AE-3000 % 0,1 wt SURFLON S-386) "floş yağı" ve ikinci yağı (Fomblin Y25) sırasıyla "sızdırmazlık yağı" diyoruz.
İki aşamalı yağ sızdırmazlık stratejisi, femtolitre damlacık dizisinin birkaç dakika içinde ve sofistike enstrümantasyon olmadan sağlam bir oluşumunu gerçekleştirebilir. Buharlaşma sorunu nedeniyle, pikolitre hacimleri28daha küçük mikroreaktörler oluşturmak için zor kabul edilmiştir. FemDA bu sorunu mikroreaktörlerin/damlacıkların hazırlanmasında kullanılan malzeme ve prosesleri sistematik olarak optimize ederek ele aldı. Elde edilen damlacıkların dikkat çekici birçok özelliği arasında femtolitre ölçeğinde yüksek tekdüzelik (veya monodispersite), stabilite ve biyouyumluluk sayılabilir. Damlacık hacminin varyasyon katsayısı (CV) sadece %3'tür (mikroskobik görüntüler için vinyet düzeltmesi yapılmadan), dünyadaki damlacık platformları arasında en küçük CV'dir ve bu da son derece paralel ve nicel bir ölçüm sağlar. Femtolitre damlacık, oda sıcaklığındaki damlacıklar arasında çapraz kontaminasyon olmadan en az 24 saat stabildir ve bu da güvenilir bir zaman dilimi ölçümü için değerlidir. Biyouyumluluk ile ilgili olarak, biz daha önce zor veya verimsiz29,30olarak kabul edilmişti femtolitre damlacık, tek kopya şablon DNA çeşitli proteinler sentezleyerek başardı. FemDA'da sentezlenebilen bazı proteinlerin neden diğer damlacık sistemlerinde sentezlenemediğini açıklığa kavuşturmaya değer. FemDA sadece teknik bir ilerleme değildi, aynı zamanda protein verimini (damlacık floresan yoğunluğu tarafından yansıttığı gibi) her damlacıktaki şablon DNA moleküllerinin sayısıyla ilişkilendirebilen eşi görülmemiş nicel bir ölçüm gerçekleştirdi. Sonuç olarak, FemDA tabanlı CFPS damlacıkların floresan yoğunluğunun histogramı, eşit pik-tepe aralıklarında Gauss'un dağılımlarının toplamı ile güzelce monte edilebilen ayrı bir dağılım gösterdi. Ayrıca, farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların oluşma olasılığı Poisson dağılımı31'emükemmel bir uyum du. Böylece, her damlacık farklı protein verimi ayrık dağılımına göre normalize edilebilir. Bu kritik özellik, enzimatik aktivite bilgilerini henüz diğer mikroreaktör platformlarında bulunmayan görünür yoğunluktan ayırmamızı sağlar. Mevcut mikroakışkan hücre / damlacık sıralama sistemleri tam otomatik sıralama ve iyi konsantre örnekleri yetenekli ama bazen sadece analitik açıdan nispeten geniş veya uzun kuyruklu histogram çıktı olabilir32,33. Son derece nicel ve biyouyumlu FemDA sistemimiz mikroreaktör geliştirme alanında yeni bir kriter ve yüksek analitik standart belirlemez.
Damlacıkların hazırlanmasında kullanılabilecek yağlar ve yüzey aktif maddeler hala çok sınırlıdır34. FEmDA'da kurulan ASAHIKLIN AE-3000 ve SURFLON S-386 kombinasyonu sulu faz ve petrolfazı 13arasındaki fizyokimyasal arayüzün büyüyen cephaneliğinin yeni bir üyesidir. FemDA yeni arayüzü fiziksel olarak kararlı, kimyasal olarak durağan ve biyolojik olarak karmaşık transkripsiyon, çeviri ve proteinlerin birçok tür için post-çevirisel modifikasyon makine ileuyumludur 13. Bunun yerine damlacık ayarlarında sentezlenemeyen bir protein bulmak oldukça cazip olacaktır. Ayrıca, reaktiflerin maliyet tasarrufu daha nanolitre ve pikolitre reaktör sistemlerinde daha femtolitre damlacık sistemi daha belirgindir35,36. Özellikle, genellikle mikroakışkan damlacık üretim sistemlerinde, ama bizim FemDA esas olarak tüp veya dış malzemeleri neden olduğu büyük bir ölü hacim olurdu. Dizi biçimi aynı zamanda her bir reaktör37için tekrarlanan ve ayrıntılı mikroskobik karakterizasyon (sözde yüksek içerik analizine benzer) tarafından tercih edilir, hızlı hareket eden bir nesne için sadece tek bir anlık görüntü yerine. Femtolitre ölçeği, bir milyondan fazla reaktörün parmak büyüklüğünde bir alana entegrasyonunu sağlarken, aynı sayıda nanolitre reaktör (varsa) metrekare nin üzerinde bir alan gerektirmesine neden oldu ve bu sistem için hiç şüphesiz pratik olmayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Femtolitre mikrohazasyon dizisi substratının mikroimalatı
NOT: Aşağıdaki mikro üretim deneyini bir temiz odada gerçekleştirin. Temiz odaya girmeden önce eldiven ve temiz oda kıyafeti giyin.
- Temizleme kapağı cam substrat
- Kapak camı bir kapak cam boyama rafına yerleştirin. Kapak camı 8 M sodyum hidroksit (NaOH) içinde 15 dakika oda sıcaklığında (RT) sonicate.
DİkKAT: Yüksek konsantrasyonlarda NaOH cilt ve göz için son derece tehlikelidir. Herhangi bir sıçrama olmadan hafifçe kıda. - Rafı NaOH çözeltisinden alın ve kapak camı on kez su kullanarak durulayın. Kapak camı saf suda saklayın.
NOT: Alkali atıkları belirlenen tanka atın. NaOH çözeltisi orijinal şişeye geri dönüştürülebilir ve beş kata kadar kullanılabilir. - Bir hava darbe tabancası ile kapak cam her parça kuru.
- Kurutulmuş kapak camı 200 °C'de 5 dk pişirin. Aşağıdaki işleme işlemleri sırasında cam ın üst tarafının yönünü tutarlı tutun.
- Kapak camı bir kapak cam boyama rafına yerleştirin. Kapak camı 8 M sodyum hidroksit (NaOH) içinde 15 dakika oda sıcaklığında (RT) sonicate.
- Cam yüzeyinin silanizasyonu
- Temizlenmiş kapak camı kuru bir boyama rafına sıfırlayın.
- Bir PTFE kabına 150 mL etanol ekleyin. 0,075 mL (3-aminopropil)triethoxysilane çekmek için 1 mL şırınga ile donatılmış bir iğne (22 G x 70 mm) kullanın ve hemen etanol (yani, 0,05 vol%) enjekte edin. Şırınganın içini durulamak için şırıngayı birkaç kez çekin ve itin. Homojen yapmak için iğne ile çözeltiyi karıştırın.
NOT: (3-aminopropil)triethoxysilane oda sıcaklığında ve 1 atm basınçta iki yıl boyunca sıkı bir sızdırmazlık ile saklanabilir. Mutlak etanol kullanımdan sonra sıkıca kapatılmalıdır. Süresi dolmuş reaktifler kullanmanızı önermiyoruz. - Kapak camı RT'de 1 saat boyunca 0,05 vol % aminosilane çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
- Kapak camı saf su kullanarak beş kez durulayın. Kapak camı saf suda saklayın.
NOT: Atıkları belirlenen tanka atın. - Hava darbe tabancası ile kapak cam her parça kuru.
- Alüminyum folyo üzerine tüm kurutulmuş kapak cam yerleştirin. 80 °C'de sıcak tabaktaki kapak camı 5 dk pişirin.
- Spin kaplama CYTOP perfloropolimer
- Kapak camı, bir spin kaplamanın özelleştirilmiş vakum lu aynasının üzerine yerleştirin (Şekil 1A). Cam yüzeyi düzeltmek için vakum düğmesini açın.
NOT: Vakum lu aynanın tasarımı, dikdörtgen (24 mm × 32 mm) ve ince (0,13-0,17 mm) substrat üzerinde viskoz polimerin tek tip bir kaplaması için çok önemlidir(Şekil 1A). Vakum kanalına bağlanan birden fazla delikli (her biri 1 mm çapında 48 delikli) dikdörtgen bir numune evresi, tek bir merkezi delik ile yuvarlak aşamadan daha iyi çalıştı. - Cam substratmerkezine 70-90 μL tip-A CYTOP polimer bırakın. Hemen polimer ispin-coat (Şekil 1B).
NOT: Spin kaplama durumu (3.400 rpm, 30 s) 3 μm kalınlık sağlar. Viskoz sıvı için tasarlanmış mikropipet kullanın. Polimerin yüzey üzerinde mükemmel bir daire ye yakın düşmesini sağlamak için mikropipeti dik tutun. Bir hava kabarcığı genellikle piston aşağı doğru hareket ettikçe pipet ucu içinde oluşturulur. CYTOP'un son damlasını kabarcıkla düşürmeyin. - Cam substrat köşeleri tutan parmakları ile kaplı cam almak ve alüminyum folyo üzerine yerleştirin.
- Kapak camı kalan tüm parçaları spin-coat için 1.3.1-1.3.3 adımları tekrarlayın.
- Kaplanmış camı 80 °C'de 30 dk, 200 °C'de 1 saat pişirin.
NOT: Bu işlem CYTOP'u tamamen iyileştirir ve CYTOP'u cam yüzeye kovalent olarak bağlar. Gerekirse uzun süreli pişirme işlemi sırasında potansiyel toz önlemek için alüminyum folyodan yapılmış bir kapak ile pişirme alanı kaplayın. - CYTOP kaplı kapak camı ocaktan çıkarın ve RT'ye kadar soğutun. Homojen kaplama sergileyen substrat atın.
NOT: Güzel kaplanmış bir CYTOP'un yüzeyi düzensiz gökkuşağı benzeri desenler olmadan düz görünmelidir(Şekil 1C). Uygun bir açıdan görsel muayene hızla düzlük yanı sıra kaplama kalitesini değerlendirebilirsiniz. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
- Kapak camı, bir spin kaplamanın özelleştirilmiş vakum lu aynasının üzerine yerleştirin (Şekil 1A). Cam yüzeyi düzeltmek için vakum düğmesini açın.
- Spin kaplama fotodirenç
- CYTOP kaplı kapak camı vakum ucuna yerleştirin (bkz. adım 1.3.1) spin kaplamanın. Kapak camı düzeltmek için vakum düğmesini açın.
- Substrat ın ortasına 0.2-0.3 mL fotodirenç bırakın. Hemen spin-coat 60 s için 6.000 rpm de photoresist.
NOT: Kabarcıklarla fotobuna karşı direncin son damlasını düşürmeyin. Spin kaplama daha yüksek spin hızını destekliyorsa, daha ince bir kaplama elde etmek için dönüş hızı 7.500 rpm'ye kadar çıkabilir. CYTOP'un düşük yüzey enerjisi, fotodirençlerin çoğunun yüzeyine yapışmasını önler. AZ P4903 photoresist mevcut değilse, AZ P4620 photoresist iyi bir alternatiftir. - Kaplamalı substratı, iki parmağınızla substrat köşelerini tutarak toplayıp. Etanol ile ıslatılmış temiz silecek(Şekil 1D)kullanarak substrat kenarına yakın aşırı fotodirenç (genellikle kenar boncuk kaldırma veya EBR olarak adlandırılır) silin. Alüminyum folyo üzerine substrat yerleştirin.
NOT: Aseton EBR için tavsiye edilmez. - CYTOP kaplı kapak camı kalan parçaları için photoresist spin-coat için adımları 1.4.1-1.4.3 tekrarlayın. Kaplamalı camın her parçasını toplayın ve düzgün kaplanıp kaplanıp kaplanıp kaplanamayaca ya da düzgün bir şekilde kaplanıp kaplanıp kaplanamayacak için inceleyin.
NOT: Güzel kaplanmış bir fotodirenç yüzeyi düzensiz desenler olmadan düz görünmelidir (Şekil 1D). Uygun bir açıdan görsel muayene hızla düzlük yanı sıra kaplama kalitesini değerlendirebilirsiniz. Homojen kaplama sergileyen substrat aseton, 2-propanol ve H2O sırayla yıkama yoluyla geri dönüştürülebilir ve yeniden kullanılabilir. - Kaplanmış substratı 110 °C'de 5 dk ocakta pişirin.
- Kaplanmış substratı ocaktan çıkarın ve RT'ye kadar soğutun. Foto-rehidrasyon için %40-60 bağıl nemde 30 dk bekletin.
NOT: Aşağıdaki fotokimyasal reaksiyon için H2O gereklidir. Pişmiş photoresist photoresist içinde H2Oiçeriği kaybetti. Rehidrasyon işlemi H2O'nun havadan emilmesini sağlar. Bağıl nem %20'den düşük veya %80'den yüksek rehidrasyon işlemi için uygun değildir.
- Fotolitografi
- Rehidrasyon bekleme süresi sırasında (adım 1.4.6 bakınız), maske hizalayıcı başlatın. Işık kaynağını ısıtın. Krom fotokopisini yükleyin.
NOT: Maske hizalayıcısını çalıştırmak için kullanım kılavuzunu izleyin. Fotomaske, EB tesisi mevcutsa elektron ışını (EB) litografisi ile imal edilebilir. Alternatif olarak, fotoğraf maskesi yerel bir şirkete dış kaynaklı olabilir. - Rehydrated substrat (adım 1.4.6 bitirdikten sonra) chuck(Şekil 1E)yükleyin.
- Pozlama parametrelerini ayarlayın. Vakum temas modunda 13 mW/cm2 (h-line) UV yoğunluğu ile 25 s'lik substratı açığa çekin. Daha sonra substrat ı boşaltın ve kapak cam boyama rafına yerleştirin (adım 1.1.1'de kullanılan aynı raf).
- Rehydrated substrat kalan parçaları ortaya çıkarmak için adımları 1.5.2-1.5.3 tekrarlayın.
- Rehidrasyon bekleme süresi sırasında (adım 1.4.6 bakınız), maske hizalayıcı başlatın. Işık kaynağını ısıtın. Krom fotokopisini yükleyin.
- Geliştirme
- Maruz kalan fotodirenç leri eritmek için 5 dakika boyunca substrat geliştirin (Şekil 1F). Bu esnada, 4 dakikalık zaman diliminde geliştiricideki rafı hafifçe sallayın.
NOT: Geliştirici AZ 300 MIF oldu. Alternatif alkali geliştiriciler (örneğin, AZ 400 K) genellikle geliştirme için geçerlidir, ancak geliştirme koşullarının optimizasyonu (örneğin, zaman, sıcaklık, ajitasyon) gerektirmelidir. Geliştirici konteyner olarak cam bardak kullanmayın. - On kez saf su kullanarak substrat durulayın. Kapak camı saf suda saklayın.
NOT: Geliştiriciyi belirlenen tanka atın. - Hava üfleme tabancası ile substrat her parça iyice kuru.
- Maruz kalan fotodirenç leri eritmek için 5 dakika boyunca substrat geliştirin (Şekil 1F). Bu esnada, 4 dakikalık zaman diliminde geliştiricideki rafı hafifçe sallayın.
- Reaktif-iyon gravür
- Kurutulmuş substratı (adım 1.6.3)'u reaktif iyon aşındırma (RIE) makinesinin reaksiyon odasına yerleştirin.
NOT: Tesisin bakım kuralına göre RIE makinesi her zaman a),veya her zaman kapalı olabilir. Düğme kapalıysa, kılavuzuna göre anahtarı açın. - O2 plazma(Şekil 1G)ile foto-resmede ortaya cytop etch.
NOT: RIE durumu aşağıdaki gibidir. O2 gaz akış hızı: 50 sccm; oda basıncı: 10.0 Pa; RF gücü: 50 W; gravür süresi: 27 dk. Gravür süresi CYTOP'un 3 μm kalınlığında tamamen gravür için optimize edilmiştir. - Cızırtıyı kullanarak reaksiyon odasından her bir substrat parçasını toplayın ve kapak cam boyama rafına yerleştirin.
NOT: Tesisin bakım kuralına göre, reaksiyon odası nın her koşudan sonra reaksiyon odasını temiz tutmak için kısa bir O2 plazma temizleme işlemi (örn. gravür süresi: 5 dk) gerekebilir.
- Kurutulmuş substratı (adım 1.6.3)'u reaktif iyon aşındırma (RIE) makinesinin reaksiyon odasına yerleştirin.
- Fotodirenç kaldırma ve temizleme
- Kalan fotodirenç çözmek için RT 5 dakika için aseton substrat Sonicate.
- RT 5 dakika boyunca 2-propanol substrat Sonicate.
- Saf su kullanarak substratı beş kez durulayın. Rt. Durulayın başka bir beş kez saf su kullanarak 5 dakika için substrat sonicate. Substratı saf suda saklayın.
- Hava üfleme tabancası ile substrat her parça kuru (Şekil 1H).
NOT: Substrat plastik bir Petri kabında saklanabilir. Fabrikasyon substrat en az bir yıl boyunca RT yapısal olarak stabildir. Protokol burada duraklatılmış olabilir. - Üç boyutlu (3D) lazer tarama konfokal mikroskopi, beyaz ışık interferometrisi (veya tutarlılık tarama interferometri) veya tarama elektron mikroskopisi ile hazır olarak hazırlanan substrat yüzey profili karakterize. Ortaya çıkan mikroodaların çapını ve derinliğini ölçmek için ilgili yazılımı kullanın.
NOT: Örnek, temassız ve tahribatsız 3D lazer tarama konfokal mikroskobu veya beyaz ışık interferometresi ile karakterizasyondan sonra diğer deneyler için yeniden kullanılabilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
2. Polidimethylsiloxane (PDMS) mikrokanalının hazırlanması
NOT: PDMS'yi işlemek için lateks eldiven giymeyin. Bunun yerine polietilen (PE) eldiven ler giyin.
- Mikrokanal ustası yapma
- Bir masaüstü kesici kullanarak çift kaplamalı yapışkan lı Kapton film bandını tanımlanmış (3 mm x 19 mm) mikrokanal şeklinde kesin.
NOT: Kapton bant No 7602 #25 (Teraoka Seisakusho), 135 μm bir kanal yüksekliği ile sonuçlanan oldu. STIKA masaüstü kesici, Adobe Illustrator dosyasındaki çizime göre kesme çalışması için Adobe Illustrator eklentisini (Roland web sitesinden mevcuttur: https://www.rolanddga.com) kullanır. Protokol burada duraklatılmış olabilir. - Kesilen her Kapton bandını Petri kabının düz dibine yapıştırın. Standart 90 mm Petri çanak bant 12 adet barındırabilir.
NOT: Kabartma yapısı PDMS çoğaltma kalıplama için bir ana görevi vermektedir. Bant ve Petri çanak substrat arasında sıkışmış herhangi bir hava kabarcıkları varsa bant yüzeyine bir cıvıltı ile hafifçe bastırın. Alternatif olarak, klasik yumuşak litografi silikon gofret38master hazırlamak için uygulanabilir. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
- Bir masaüstü kesici kullanarak çift kaplamalı yapışkan lı Kapton film bandını tanımlanmış (3 mm x 19 mm) mikrokanal şeklinde kesin.
- Bant desenli Petri kabında PDMS reisinin kürü
- Yeni PE eldivenler giyin ve belirtilen plastik kabın içine tek kullanımlık plastik pipet kullanarak SYLGARD 184 silikon elastomerin 2,5 g kür leme maddesi aktarın(Şekil 2A).
- Yeni eldivenlere dönüşür ve yukarıdaki plastik kabın içine tek kullanımlık 50 mL şırınga kullanarak SYLGARD 184 silikon elastomerin prepolimer tabanının 25 g'ını aktarın.
NOT: Kürleme maddesinin üsse olası çapraz kontaminasyonunu önlemek için buradaki eldivenleri değiştirin. - Karışımı karıştırmak ve deaerate için bir deaeration karıştırıcı kullanın (program: 3 dk karıştırma ve 2 dk deaeration takip).
NOT: Deaeration mikseri mevcut değilse, manuel olarak ajite edilmiş (yaklaşık 15 dk) karışım vakum odasında gazdan arındırılabilir. - PDMS karışımını bant desenli Petri kabına dökün(Şekil 2B). Petri kabını mini vakum haznesinde ayarlayın ve PDMS karışımını 1-3 saat(Şekil 2C)için ayırın.
NOT: 1 saat sonra PDMS karışımında herhangi bir hava kalırsa, Petri kabını vakum odasından alın, hava balonu hava üfleyicisini kırın ve petri kabını vakum odasına geri koyun ve ayırma işlemine devam edin. - Petri kabını bir gecede 60 °C'de fırına koyup PDMS'yi iyileştirin(Şekil 2D).
NOT: Sıcaklığın artırılması kür leme süresini kısaltsa da, fiziksel deformasyon olmadan polistiren Petri kabı tarafından tolere edilebilen maksimum sıcaklık yaklaşık 60 °C'dir.
- PDMS kanalının çoğaltma kalıplanması
- Petri kabından kürlenmiş PDMS elastomerini soyma(Şekil 2E).
- PDMS kanal bloklarının her parçasını düz kablo kesici kullanarak kesin(Şekil 2F).
- PDMS elastomerini kanal tarafına bakan kesme paspasına yerleştirin. Biyopsi yumruğu kullanarak kanalın her iki ucunda bir delik aç(Şekil 2G).
- PDMS kanalının yüzeyini Scotch bantla temizleyin. Daha sonra kullanmadan önce temiz tutmak için PDMS rezorini başka bir Scotch bandına sarın. Hazırlanan PDMS kanalını temiz bir Petri kabında saklayın.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir.
3. Femtolitre mikrooda dizi cihazının montajı
- Basitleştirilmiş bir nemlendirici hazne yapmak için petri kabının iç duvarına suyla ıslatılmış temiz silecekler yerleştirin. Scotch bandı ile kapsanan PDMS resenini nemlendirici hazneye yerleştirin ve parafin film kullanarak odayı kapatın. En az 3 saat ama bir günden fazla kuluçka.
NOT: PDMS gaz reşin39üzerinden geçmesine izin veren gözenekli bir malzemedir. PDMS gözenekli yapısı bir denge ulaşana kadar çevreden su moleküllerinin emilimini yol açar. Bu ön arıtma, PDMS'nin gözeneklerini su buharı ile doldurur ve PDMS kanalının kenarına bitişik sulu damlacıkların buharlaşmasını önemli ölçüde bastırabilir. - PDMS reizindeki Viski kasetini çıkar. PDMS kanalını substratın mikrohazasyon dizi alanına yerleştirin (Şekil 2H).
NOT: PDMS reçinesi CYTOP yüzeyine geri döner olarak yapışır. VARSA PDMS reçini ile substrat arasındaki hava kabarcıklarını gidermek için bir cızırtıyla PDMS bloğuna hafifçe basın. - PDMS kanalının deliklerinden birine (çıkış olarak) 200 μL filtrelenmemiş pipet ucu takın.
NOT: PDMS ve CYTOP arasındaki yapışma mukavemeti sınırlıdır. PDMS rezorinin fiziksel deformasyonunu ve PDMS kanalının yüzeyden ayrılmasını önlemek için pipet ucunu çok derine sokmayın.
4. Monte edilen cihaza yükleme reaksiyonu çözümü
- Buzun üzerine alüminyum mikrotüp standı koy. Alüminyum standüzerinde 1,5 mL'lik bir mikrotüpte floş yağı (ASAHIKLIN AE-3000 yağı % 0,1 wt SURFLON S-386 yüzey aktif maddesi ile karıştırılır) önceden itin.
- Buza bir alüminyum blok daha koy.
- CFPS reaksiyon çözeltisinin hazırlanması
- CFPS reaksiyon çözümünü bir PCR tüpte hazırlayın. CFPS kitinin her aliquot bileşenini, seyreltilmiş şablon DNA'sını (burada floresan protein mNeonGreen40 ve Escherichia coli alkalin fosfataz41)çözeltisini ve diğer gerekli bileşenleri özel ihtiyaçlara göre (örneğin, RNase inhibitörü, florojenik substrat, şaperon) karıştırın.
NOT: CFPS için kullanılan şablon DNA,ilgili CFPS kitinin talimatına göre hazırlanmalıdır. Bu gösteri, T7 tabanlı ifade sistemi42'yiuyguladı. FemDA cihazındaki reaktif tüketimi oldukça küçük olduğundan, 10°L tüm PDMS kanalını dolduracak kadar büyüktür. - mNeonGreen floresan protein sentezi için bileşenleri aşağıdaki sırayla karıştırın: 2,7 μL nükleaz içermeyen H2O'yu 6 μL'lik çözelti A'ya ekleyin (CFPS kitinden); 0.3 μL RNase inhibitörü ekleyin; seyreltilmiş şablon DNA çözeltisi 1,5 μL ekleyin; kısaca karıştırın ve karışımı 4,5 μL'lik b çözeltisine (CFPS kitinden) aktarın.
NOT: Toplam hacim 15 μL'dir. Her aliquot miktarı son karışımın toplam hacmi ile orantılı olduğundan, toplam hacmi 10 μL'den küçük bir miktar, bazı bileşen aliquot'un çok küçük bir hacmine (< 0,2 μL) neden olabilir. - Alkali fosfataz sentezi için bileşenleri aşağıdaki sırayla karıştırın: 1,2 μL H2O ila 6 μL çözelti A ekleyin; 0.3 μL RNase inhibitörü ekleyin; 0.6 μL disülfür bağ arttırıcı 1 ve 2 (bir kitten); 5 mM 6,8-difluoro-4-metilumbelliferyl fosfat (DiFMUP) 0.3 μL ekleyin; 1.5 μL DNA çözeltisi ekleyin; kısaca karıştırın ve karışımı 4,5 μL çözelti B'ye aktarın.
NOT: Alkali fosfataz ın testinde, florojenik substrat DiFMUP terminal fosfat grubunun enzimatik dekoltesi üzerine yüksek floresan 6,8-difloro-7-hidroksi-4-metilcoumarin (DiFMU) üretebilir.
- CFPS reaksiyon çözümünü bir PCR tüpte hazırlayın. CFPS kitinin her aliquot bileşenini, seyreltilmiş şablon DNA'sını (burada floresan protein mNeonGreen40 ve Escherichia coli alkalin fosfataz41)çözeltisini ve diğer gerekli bileşenleri özel ihtiyaçlara göre (örneğin, RNase inhibitörü, florojenik substrat, şaperon) karıştırın.
- 200 μL filtrelenmemiş pipet ucu kullanarak karışımın 10 μL'sini çekin. Pipet ucunu PDMS kanalının giriş deliğine (3.3 adıma bakın) yerleştirin. Prizden taşana kadar (3.3 adımda başka bir pipet ucu nun takıldığı) solüsyonu kanala enjekte etmek için pistonu aşağı itin.
- Pipet ucunu pipet ucundan ayırın ve bu iki pipet ucunu giriş ve çıkışa takılı tutun.
NOT: Pipetleme sırasında hava kabarcıkları üretmekten kaçının. PDMS kanalı içindeki çözeltinin geri akışını önlemek için pipet ucunu pipet ucundan ayırana kadar başparmağı pistondan bırakmayın.
5. CFPS için femtolitre damlacık dizisi (FemDA) oluşturma
- Monte edilmiş cihazın tüm setini önceden soğutulmuş alüminyum bloka aktarın (bkz. adım 4.2). Mikrohazus dizi alanının hızla yarı saydamdan(Şekil 2I)şeffafa dönüştüğünü dikkatlice doğrulayın (Şekil 2J).
NOT: CFPS reaksiyon çözeltisi mikroodalara düzgün bir şekilde giremez. Havanın sudaki çözünürlüğü sıcaklıkla ters orantılıdır. Cihaz RT'den düşük sıcaklığa taşındıktan sonra kapana kısılmış hava çözeltiye dönüşür. Saydamlık değişikliği, çözümün mikroodalara girip girmediğini değerlendirmek için uygun bir görsel göstergedir. - Önceden soğutulmuş floş yağının 30 μL'sini çekin (bkz. adım 4.1) ve yağı hemen üst açıklığından girişe yerleştirilen pipet ucuna aktarın. Floş yağı kanala taşınır ve mikroodaların dışında bulunan aşırı reaksiyon çözeltisini dışarı taşır. Her mikrohazon floş yağı tarafından izole edilir.
NOT: Reaksiyon çözeltisi ile floş yağı arasındaki hareketli arayüz görünürdür, bu da insanların kanalın içindeki sıvının hareketini gözlemlemelerine yardımcı olur. Ekstrüzyon çözeltisi bir önceki tüpe toplanabilir, 4 °C'de depolanabilir ve başka bir FemDA cihazı veya paralel toplu reaksiyon (mikrotüp veya mikrotif plaka) için yeniden kullanılabilir. - 30 μL'lik sızdırmazlık yağının (Fomblin Y25) 200 μL filtreli pipet ucuna önceden çekilmesi. Pipeti bir yere dik tutun.
- Aynı anda eklenen iki pipet ipucunu (bkz. 3.3 ve 4.4 adımlarını) aygıttan çıkarın. Cihazı hemen alüminyum bloktan parafilm'e taşıyın.
NOT: Pipet uçlarını çıkarma süresi boyunca alüminyum bloktaki cihazı düzeltmek (ancak kanal alanından uzak tutmak) için bir cıvık kullanın. - Sızdırmazlık yağını içeren hazır pipet ucunu hemen PDMS kanalının girişine takın (bkz. adım 5.3) ve çıkıştan taşana kadar yağı kanala enjekte edin.
NOT: Cihazı RT'ye taşır taşımaz bu adımı uygulayın. Kanal içinde geri akışı önlemek için, sızdırmazlık yağı çıkıştan taşana kadar başparmağı pistondan bırakmayın. Floş yağı kanalın çıkışından çıktıktan hemen sonra buharlaşırken, son derece düşük buharlaşma kaybı nedeniyle aşağıdaki sızdırmazlık yağı çıkışta birikir. - Pipet ucunu pipet ucundan ayırın ve pipet ucunu cihazdan çıkarın. PDMS yüzeyini temiz silecek parçasını kullanarak temizleyin ve ardından sırasıyla giriş ve çıkışa yeni bir damla sızdırmazlık yağı uygulayın. Femtolitre damlacıkları yağ tarafından ayrı ayrı mikroodalarda kapatılır.
NOT: Mikropipet ucunu niçin kaldırma süresi boyunca substratüzerindeki PDMS kanalını düzeltmek (ancak kanal alanından uzak tutmak) için bir cızırtacı kullanın. - Kapak camı alt yüzeyinde biriken nemi silin. As-prepared FemDA cihaz şimdi kuluçka ve mikroskopi görüntüleme için hazırdır.
6. Mikroskopi görüntüleme
- Ters floresan mikroskobu başlatın. Kameranın sabitleme (soğutma) bekleyin. 60x veya 100x yağ daldırma objektif lens kullanın. FemDA cihazını motorlu sahneye ayarlayın. Görüntüleme parametrelerini ayarlayın.
NOT: Görüntüleme parametreleri dosya yolunu, görüntüleme kanallarını, filtreleri, pozlama sürelerini (genel olarak 100 ms yeterlidir; kameranın özelliklerine göre daha kısa veya daha uzun süre de mümkündür) ve ışık yoğunluğunu içerir. - Odak düzlemini bulun. Objektif lensin z ekseni konumunu ayarlayın ve dahili bir otofokus sistemi kullanarak odak düzlemini düzeltin. Görüntülenecek ilgi bölgesini (YG; yani x, y-ekseni) ayarlayın.
NOT: Büyük mikroskop üreticileri (Nikon, Olympus, Zeiss, Leica) tüm mikroskop sistemi ile otofokus sistemi entegre seçeneği sunuyoruz. Bu otofokus sistemi otomatik çok alanlı görüntüleme sırasında odak düzlemini sabit tutmak için gereklidir. ROI'lar PDMS kanalındaki FemDA bölgesini kapsamaktadır. - Floresan görüntülerini yakalayın. Her Yatırım Getirisi için defodaklanmış parlak alan (BF) görüntüsünün tek bir karesini yakalayın. Farklı kanalları görüntülerken ROI'ların sırasını ve koordinatlarını değiştirmeyin.
7. Görüntü veri analizi
NOT: Her damlacık43floresan yoğunluğu ayıklamak için Fiji (http://fiji.sc) dayalı bir ev yapımı eklenti ("FemDA" olarak adlandırılır) kullanarak görüntü verileri analiz. İşletim sistemine göre Fiji'nin doğru sürümünü yükleyin. Fiji, "Bio-Formats" eklentisi kullanarak çoğu görüntü dosyası biçimini (örneğin Nikon mikroskobundan nd2 dosyası, Zeiss mikroskobundan czi dosyası) destekler.
- Eklenti kurulumu
- Eklenti dosyasını kopyalayıp yapıştırın (ilgili yazara sorgulanırken veya aşağıdaki kurumsal bağlantı üzerinden kullanılabilir: https://fbox.jamstec.go.jp/public/FcsQwAsMKIqA9j0B2MJwLUMeHGsxp09hAkAFdVhQIDkZ) Fiji'nin "eklentileri" klasörüne.
- Fiji yazılımını başlatın; eklenti "FemDA" Fiji açılan menü "Eklentileri" bulunabilir.
- Görüntü verileri önişleme
- Defokus BF görüntüsünü açın (bkz. adım 6.3). İşlem 'i tıklatın | Arka Planı Çıkarın... görüntü verilerinin her karesinin düzgün sürekli arka planlarını kaldırmak için(Şekil 4B). İşlem 'i tıklatın | Filtreler | Görüntü verilerinin her karesinin gürültüsünü azaltmak için ortanca(Şekil 4C).
- Resim | Ayarla | Eşik kontrol etmek ve arka plandan ön plan (microchambers dışında alan gösteren) görüntü verilerinin her kare (Şekil 4A-C'debüyütülmüş ekler) ayırmak için.
NOT: Eşik penceresindeki açılır listeden uygun bir algoritma seçin, böylece yalnızca mikro hazne alanları ve her mikro haznenin kenarları ön planda olarak tanımlanabilir ve vurgulanabilir. Özellikle, vurgulanan kenarların çoğu boşlukolmadan sürekli olmalıdır.
- Damlacık koordinat tayini
- Eklentiler | FemDA | FemDA Analizi özelleştirilmiş eklentinin grafik kullanıcı arabirimini (GUI) açmak için (Şekil 4Düst yarısı).
- Tek bir mikro haznenin yaklaşık minimum ve maksimum piksel sayılarını girdi. Mikroodaların beklenen minimum ve maksimum dairesellik (0: rasgele şekil; 1: mükemmel daire) girdi. Başlangıç çerçevesi ve bitiş çerçevesinin çerçeve numarasını girdi.
- Her microchamber algılamak için GUI üzerinde YG oluştur'u tıklatın ve başarıyla algılanan ROI'lar bir pop-up penceresi ROITablegösterilir.
- Pencereye geri dön FemDA Analizi'ne gidin ve çerçevelerin üzerindeki mikroodaların doğru algılanıp algılandığını kontrol etmek için Yatırım Getirisi maskesi uygula düğmesini tıklatın (Şekil 4D'ninsol alt kısmı). Hayır ise, bazılarını değiştirin ve YG oluştur ve YG maskesi uygula'yıtıklatarak tekrarlayın. Evet ise, bir sonraki adıma geçin.
NOT: Ön plan ve arka plan arasındaki kontrastın yetersiz olması nedeniyle Eşik'in herhangi bir algoritması tarafından YG olarak tanımlanamayan çok az mikrooda olabilir (Şekil 4D'ninalt yarısına bakınız). Bu istatistiksel bakış açısından sorunlu değildir.
- Floresan yoğunluğu ekstraksiyonu
- Floresan görüntüsünü açın ve öne getirin. Belirlenen ROI'ları floresan resmin üzerine (Şekil 4D'ninsağ alt hakkı) uygulamak için RoI maskesini tekrar uygula'yı tıklatın.
- Bir son nokta görüntüsünü analiz etmek için One-Shot'ı (mNeonGreen verileriyle örneklendirilmiş olarak) veya zaman-ders verilerini analiz etmek için Time-Lapse'yi (alkali fosfataz verileriyle örneklendirilmiş olarak) seçin.
- Kutudaki 100 giriş Üst piksel sayısı, ilgili damlacıkların ortalama yoğunluğunu hesaplamak için her Yatırım Getirisi'nin yalnızca en üst 100 pikselinin kullanılacağı anlamına gelir. Üst piksel sayısına 0 girişi varsa, ilgili damlacık ortalama yoğunluğunu hesaplamak için her YG'nin tüm pikselleri kullanılır.
NOT: BF ve floresan görüntüler arasında birkaç piksel sürüklenme olabilir, bu da ROI'ların içindeki bazı piksellerin floresan görüntünün arka planına ait olabileceği anlamına gelir. Bu nedenle, eklenti, her damlacık ortalama yoğunluğuhesaplama için üst yoğunluk dereceli piksel sayısını belirtmek için bir seçenek sağlar. - Son nokta görüntüsünün analizi için (örneğin, adım 7.4.2'de Tek Atış'ı seçin), algılanan tüm damlacıkların ortalama yoğunluklarını hesaplamak için Ölçü düğmesine tıklayın. YGTable floresan görüntüden yeni verilerle güncelleştirilir. Bu arada, bir histogram yeni bir pop-up penceresi Histogram görüntülenir (Şekil 4E).
NOT: Kutu Sayısı'ndaki kutu boyutunudeğiştirmek histogramın ekranını optimize edebilir. Gelişmiş GUI'de Gaussian dağılımlarının toplamına uygun bir uyum gerçekleştirilebilir. Fiji'nin açılır günlük penceresi uygun sonuçları görüntüler. Alternatif olarak, metin olarak kaydet düğmesini tıklatarak verileri dışa aktarın ve diğer yazılımlarla çeşitli istatistiksel analizler gerçekleştirin(Şekil 4F, G). - Zaman-kurs görüntüsünün analizi için (örneğin, adım 7.4.2'de Time-Lapse'i seçin), açılır pencere Histogramyerine Yoğunluk Zaman Kursudur ve bu da belirli bir zaman noktasına ve zaman yoğunluğu çizimine karşılık gelen bir histogram içerir ( Şekil5). Metin verileri açılır pencerenin Dosya menüsü kullanılarak da dışa aktarılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrofabrikasyon işlemi substrat temizliği, yüzey işlevselleştirmesi, CYTOP kaplama, fotolitografi, kuru gravür, fotodirenç sıyırma ve son temizlikten oluşmaktadır. Daha da önemlisi, sunulan protokol, standart kapaklı cam yüzey üzerinde son derece paralel hidrofilik-in-hidrofobik bir yapı üreten mikrochambers Şekil 3Aiçinde hidrofobik CYTOP polimerin tamamen çıkarılmasına olanak sağlamıştır. Yağ sızdırmazlık protokolü yardımıyla, ortaya çıkan damlacıkların tek düze boyutu mikroodalarda floresan çözeltisi kapsülleme ile doğrulandı(Şekil 3B). Geliştirilen yazılım kullanılarak çıkarılan floresan yoğunluğu damlacık boyutunun iyi bir göstergesidir. Floresan yoğunluğunun %3'lük CV'si damlacık boyutunun tüm diziüzerindeki dar dağılımını yansıtmıştır(Şekil 3C). Konfokal mikroskopiden yeniden yapılandırılalı 3Boyutlu görüntü de zaman içinde tutarlı damlacık hacmini gösterdi (Şekil 3D, Ek Film 1)44. Buna karşılık, yaygın olarak kullanılan FC-40 yağı floresan yoğunluğu nda birkaç kat fark sergileyen damlacıklar üretti45. FemDA'da oluşan damlacıklar RT'de en az 24 saat stabildi(Şekil 3E). Damlacıkların yüksek kalitesi sonunda nicel ölçümün temelini oluşturmuştur.
Yüksek iş letme verileri, yüksek iş letme veri analiz araçlarıgerektirir 46,47. Geliştirilen eklenti büyük ölçüde basitleştirilmiş ve görüntü veri analizi hızlandırdı. Dijital görüntü işleme teorisine dayanarak48,defokus BF görüntü binarized ve arka plan düzeltme ve gürültü azaltma(Şekil 4A-C)sonra her damlacık koordinat bilgilerini sağlamak için kullanılır. Bu fikir, koyu damlacıkların kesin yerelleştirilmesini mümkün kıldı.
Floresan protein mNeonGreen FemDA sentezlendi. Damlacık başına 0,05 molekül konsantrasyonu olan şablon DNA, birleştirilmiş hücreiçermeyen transkripsiyon ve çeviri reaksiyonları ile protein sentezini başlatmak için her damlacık içine rastgele dağıtıldı. Damlacık başına ortalama DNA molekülü sayısı 1'den küçük olduğundan, bazı damlacıklar sıfır şablon DNA içerirken, diğerleri bir veya daha fazla DNA molekülü içeriyordu. RT'de 6 saatlik kuluçkadan sonra, son nokta görüntüsü mikroskop kullanılarak çekildi. Yığın görüntü verileri eşzamanlı deodaklanmış BF görüntü yardımı ile geliştirilen yazılım tarafından analiz edildi (Şekil 4A-E). Her damlacının floresan yoğunluğu, ilgili damlacıktaki protein veriminin bir ölçüsüdür. Floresan yoğunluklarının histogramı ayrı bir dağılım gösterdi ve damlacık başına farklı sayıda DNA molekülünün doluluk unu güçlü bir şekilde öneren eşit pik-tepe aralıklarında(Şekil 4F)Gaussdağılımı nın toplamı ile iyi bir şekilde takıldı. Tekrarlanan sikke çevirme oyununa benzer şekilde, oluşan bağımsız rastgele olayların sayısı matematiksel olarak Poisson dağılımı tarafından tanımlanır. Farklı sayılariçeren damlacıkların (bu örnekte 3'e kadar) DNA moleküllerinin oluşma olasılığı, damlacık başına beklenen ortalama DNA molekülü sayısının λ olduğu poisson dağılımına (P = e-λ • λk / k!, damlacık başına beklenen ortalama DNA molekülü sayısıdır) damlacık başına ortalama 0,05 DNA molekülü(Şekil 4G)31, rastgele DNA moleküllerinin dağılımı için beklendiği gibi mükemmel bir uyumdur. Şablon DNA çözeltisinin yükleme konsantrasyonu son takılı λ ile aynı olduğundan (yani 0.05), FemDA'mızdaki CFPS reaksiyon verimi %100 (veya %100'e yakın) idi. Başka bir deyişle, tek bir DNA molekülü femtolitre damlacıktaki CFPS reaksiyonu etkin bir şekilde tetiklemek için yeterlidir.
Alkalen fosfatazın CFPS reaksiyonu her 5 dakikada bir kaydedildi. Geliştirilen yazılım aynı zamanda zaman-ders verilerinin analizini de destekler(Şekil 5). Birleşen florojenik reaksiyon, damlacıkların floresan yoğunluğunun daha önceki zaman noktalarında benzer bir ayrık dağılımını gösterdi. Histogram sonuçları da damlacık farklı sayıda DNA moleküllerinin doluluk doğruladı. Floresan yoğunluğu sonunda florojenik substrat DiFMUP kademeli tükenmesi ile birlikte bir değere yakınsadı.
Şekil 1: Ultra yüksek yoğunluklu mikrohazon dizi substratının mikroüretim süreci. (A) Özelleştirilmiş vakum chuck teknik çizim. Birim: mm. (B) CYTOP film kalınlığı ve spin hızı verileri. (C) Perfloropolimer CYTOP'un silanize cam yüzey üzerinde spin kaplaması. Fotoğraflar homojen kaplama iyi bir örnek ve homojen kaplama kötü bir örnek, sırasıyla gösterdi. Siyah ok, homojen CYTOP filminin belirli konumunu gösteriyordu. (D) CYTOP kaplamalı alt tabakada fotodirenç spin kaplaması. Spin kaplamadan sonra, substrat kenarına yakın fotodirenç etanol lüzumlu temiz silecek (orta daki fotoğraf) kullanılarak çıkarılmalıdır. Fotoğraflar homojen kaplama iyi bir örnek ve homojen kaplama kötü bir örnek, sırasıyla gösterdi. Beyaz ok, homojen fotodirenç filminin belirli konumunu gösteriyordu. (E) Maske hizalayıcı kullanılarak kaplanmış fotodirenç pozlama. (F) Bir geliştiricide maruz kalan fotodirenç gelişimi. Photoresist'in açıkta kalan kısmı geliştirici çözümünde çözünür. (G) CYTOP reaktif-iyon gravür. Ortaya çıkarılan CYTOP O2 plazması ile çıkarıldı. (H) Fotodirenç maskesinin çıkarılması. Fotodirenç aseton tarafından kaldırıldı. Substrat 2-propanol ve H2O. kullanılarak temizlendi Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Mikrohazon dizi cihazının hazırlanması ve kullanılması. (A) PDMS'nin kürleme maddesi ve prepolimerinin tartımı. (B) Karışık ve deaerated karışımı bant desenli Petri kabına dökme. Polimer karışımında yeni üretilen bazı hava kabarcıkları vardı. (C) Karışımı tekrar vakum odasında deaerating. Hava kabarcıkları yükseliyordu ve üst yüzeyde patlıyordu. (D) Deaerated ve tedavi PDMS reisin. (E) Petri kabından tedavi edilmiş PDMS elastomerinin soyulması. (F) PdMS kanal bloklarının her bir parçasının düz kablo kesici kullanarak kesilmesi. (G) Biyopsi zımbası kullanarak PDMS kanalının her iki ucunda delik açma. (H) Monte edilen aygıt. PDMS reçinecy yüzeye yapışabilir. (I) PdMS kanalı içindeki yarı saydam mikrohazasyon dizi alanı soğutmadan önce sulu çözelti ile doldurulur. (J) PdMS kanalı içinde saydam mikrohazasyon dizi alanı ürperdikten sonra. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ultra-uniform ve ultra-kararlı femtolitre damlacıkları. (A) 3D lazer tarama konfokal mikroskopi görüntüleme imal substrat için. Örnek resimdeki silindirik mikroodalar 3 μm yükseklik ve 4 μm çapında ydı. (B) Düzlemsel dizinin geniş bir alanı üzerinde düzgün femtolitre damlacıkları. Burada tüm dizinin yalnızca kısmi bir alanı gösterilmiştir. Her damlacıkta bir floresan çözeltisi (10 μM ATTO-514) mühürlendi. (C) Damlacıkların tek bir dizi boyunca boyut dağılımı. Floresan yoğunluğu damlacık boyutunun bir göstergesi olarak kullanılmıştır. CV sadece %3'tü. (D) Konfokal z-yığın zaman-kurs verileri kullanılarak hacimsel ölçüm. Dizi üzerindeki damlacıkların hacmi mikroskop yazılımı (NIS-Elements, Nikon) tarafından verilmiştir. (E) Fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı. İlk çerçeveden sonra, birkaç damlacık tamamen bir konfokal mikroskop sınırlı lazer ışını kullanılarak fotobeyazlatıldı. Floresan şiddeti 24 saat olarak kaydedildi ve floresan geri kazanımı gözlenmedi (kırmızı çizgi). Aynı görüş alanındaki fotobleached olmayan diğer damlacıkların floresan yoğunluğu siyah çizgiye kaydedildi. Hata çubukları (yarı saydam renkler) her zaman noktası için 1 SD idi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Son nokta mikroskobik görüntü verilerinin analiz prosedürü. Deodaklanmış parlak alan görüntüsü her mikroodanın/damlacıkların koordinatını ayıklamak için kullanılmıştır. Mikroodaların kenarı (ön plan olarak) ile diğer alanlar (arka plan olarak) arasındaki yoğunluk farkına göre, sürekli ve dairesel kenar arka plandan çıkarılabilir. Görüş alanı(A)genelinde düzensiz arka plan dağılımı nedeniyle, bazı görüntü ön işleme genellikle binarizing çıktıkalitesini artırmak için gereklidir. Arka plan(B)çıktıktan sonra, her karenin arka planı tek tipleştirildi. Ampirik olarak, " Rollingball radius" (adım 1) giriş değeri 2048 piksel × 2048 piksel görüntüler için 20-50 ve 512 piksel × 512 piksel görüntüler için 10-20 idi. Değer ne kadar büyükse, işlem süresi de o kadar kısa olur. Arka plandaki çıkarılan görüntüdeki gürültüyü azaltmak için görüntüye(C)ortanca filtre uygulayın. Genel olarak, Yarıçap (adım 3) giriş değeri 1-2 piksel oldu. Büyütülmüş ekte gösterildiği gibi, arka plandaki çıkarılan ve filtrelenen görüntü, kenarlara ve ilgi alanlarına (ROI) karşılık gelen ön planın doğru bir şekilde tanınması için yapı eşik eklentisi kullanılarak güzelce binarize edilebilir. Görüntünün tüm kareler için ROI algılama yüklü ev yapımı eklenti FemDA Analizi (D)kullanılarak yapılmıştır. RoI'ların piksel boyutu (adım 5 ve 6) ve dairesellik (adım 7 ve 8), hesaplamaya koymak istediğimiz çerçeveler (9 ve 10 adımları) gerçek verilere göre el ile tanımlanmıştır. Oluştur Yatırım Getirisi 'yi (adım 11) tıklattıktan ve bekledikten sonra, giriş kareleri boyunca her yatırım getirisinin koordinatı belirlendi. Yatırım Getirisi maskesini (adım 12) tıklattıktan sonra, algılanan her yG eklenmiş ve sarı bir çizgi yle vurgulanmıştır. Floresan görüntüsünü açtıktan ve roi maskesini tekrar uygula'ya tıkladıktan sonra, belirlenen ROI maskesi floresan görüntüye uygulandı. Üst piksel sayısı (adım 14), ilgili damlacıkların ortalama yoğunluğunun hesaplanması için her Yatırım Getirisi'nin en yüksek yoğunluk dereceli piksel sayısını belirtir. Ölçü yoğunluğunu (adım 15) tıklattıktan ve bekledikten sonra histogram(E)oluşturuldu. Histogram, histogram penceresinde bulunan parametrelerkullanılarak gaussdağılımının toplamı ile donatılabilir. Alternatif olarak, ortalama yoğunluk verileri bir metin dosyasına (adım 16) aktarılabilir ve diğer yazılımlar(F)tarafından analiz edilebilir. (G) Verilen dizide farklı sayıda DNA molekülü içeren damlacıkların oluşma olasılığı. Histogram (gri renk) güzel bir Poisson dağılımı (kırmızı kesikli çizgi) damlacık başına 0,05 DNA molekülleri ortalama ile, DNA moleküllerinin rasgele bir dağıtım için beklendiği gibi monte edildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Zaman dersi mikroskobik görüntü verilerinin analizi. Algılanan ROI'lar (Şekil 4'ün1-12. adımlarını izleyerek) zaman-ders verilerine doğrudan uygulandı. Şekil 4'ün13. Time-lapse Time-interval [min] Ölçü yoğunluğu (Şekil 4'ün15. adım 15) ve bekletilmesinden sonra zaman yoğunluğu çizimi ve histogram (Şekil 4Eile aynı) oluşturuldu. Hist pozisyonu, dikey kırmızı çizgi olarak gösterilen histogramın zaman noktasını belirtir. Eklenti, her izleme satırı için renk belirtmeyi de destekler. Sarı: 0 DNA; mavi 1 DNA idi; kırmızı: 2 DNA; siyah: 3 DNA. Zaman-kurs verileri bir metin dosyasına da aktarılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FemDA'daki son derece düzgün, kararlı ve biyouyumlu damlacıkları temel alan son derece nicel ölçüm, çalışmamızın diğerlerinden farklı benzersiz özelliği olan ayrık dağılımı sağladı. Bu yazıda mikrofabrikasyon ve damlacık oluşum süreçlerini sistematik olarak optimize ettik ve ayrıntılı olarak anlattık. Kurulan protokolde birkaç kritik adım vardır.
İlk olarak, dikdörtgen ince cam alt tabaka üzerinde son derece viskoz CYTOP polimer düzgün kaplama büyük ölçüde ortaya çıkan substrat kalitesini belirler. Yüksek büyütmeli objektif lensin genel olarak kısa çalışma mesafesi göz önüne alındığında (bkz. adım 6.1), ince kapakca kullanılmalıdır. İnce ve esnek bir alt tabaka üzerinde yüksek kaliteli spin kaplama genellikle zordur. Biz henüz tüm olası tasarımları test değil ama aynı dikdörtgen boyutu ile çok delikli vakum chuck spin-kaplama için iyi çalıştığını bulduk. CYTOP polimerini kapak cam yüzeyinin ortasına bırakıp hemen spin kaplamaya başlamak önemlidir (bkz. adım 1.3.2). Zorluk derecesi daha az substrat şekli ile ilgili ama polimer viskozitesi. CYTOP ürün serisi, ticari olarak sunulan paketin birkaç farklı konsantrasyonu sunar. Paketteki seyreltici, gerekirse orijinal ürünü daha düşük bir viskoziteye seyreltmek için de kullanılabilir. Deneyde kullandığımız CYTOP 816, çözücüdeki polimeri çözünebilen en yüksek konsantrasyona sahip ticari üründür. Kalın kaplama daha düşük spin hızı veya kaplama ve kür birden fazla tur gerektirir. Yeni bir ortamda yeni bir spin kaplama kullanırken karakteristik kalınlık ve spin hız eğrisi bir arsa şiddetle tavsiye edilir.
İkinci olarak, temiz odanın uygun nemi ideal fotolitografi nin yanı sıra fotodirençlerin belirtilen pozisyonda tamamen çıkarılması için çok önemlidir. Fotolitografide fotokimyasal reaksiyon reaktan olarak H2O kullanır. Ancak, H2O kaynama sıcaklığından daha yüksek sıcaklıkta softbake kaplamalı photoresist H2O içeriği kaldırır. "Kurutulmuş" photoresist havadan tekrar H2O absorbe zaman almalıdır (adım 1.4.6 bakınız). Bu nokta genellikle göz ardı edilir. Birçok laboratuvarsadece nem kontrolü olmadan bazı basitleştirilmiş temiz oda tesisleri olabilir göz önüne alındığında, nem sezon boyunca önemli ölçüde dalgalanma ya da hava etkilenir. Düşük maliyetli bir çözüm, temizlik odasında ev kullanımı nemlendirici veya nem giderici kullanmaktır. Geliştirme den sonra tamamen maruz kalan CYTOP tabakası RIE tarafından seçici olarak ve tamamen çıkarılarak cam alt tabakası tamamen açığa çıkarılabilir. Sonunda, hidrofilik cam alt ve hidrofobik CYTOP yanak hibrid yapısı femtolitre uzaya sulu çözüm üslup bindirme için önemlidir.
Üçüncü olarak, yeni bulunan yağlar (ASAHIKLIN AE-3000, Fomblin Y25) ve yüzey aktif (SURFLON S-386) floropolimer reaktör için benzeri görülmemiş sızdırmazlık performansı gösterdi13. Floş yağı enjeksiyonu soğutulmuş yassı metal blok üzerinde yapılmalıdır (bkz. adım 5.2); aksi takdirde, kanalın girişine yakın damlacıklar oluşturulamaz. İkinci sızdırmazlık yağının enjeksiyonu RT'de yapılabilir (bkz. adım 5.5). Bu yağlar ve yüzey aktif maddeler daha önce biyolojik araştırmalarda hiç kullanılmamıştır. Şimdilik daha iyi bir alternatif bulunamadı. Damlacık hazırlama için yağlar ve yüzey aktif maddelerin yararlı kombinasyonu cephanelik genişletmek için, yağlar (veya aynı ürün hattında benzer olanlar) ve yüzey aktif madde (veya aynı ürün hattında benzer olanlar) yeni üyesi mikroakışkan damlacık sistemlerinde uygulanmaya çalışarak layık.
Burada dikkat etmek için iki ek nokta vardır. Bunlardan biri, mikroskopi görüntüleme sırasında ROI'lar arasında bir zaman gecikmesi olmasıdır. Bir döngü için toplam görüntüleme süresi esas olarak dizi boyutuna ve objektif merceğin büyütülmesine bağlıdır. Pozlama süresi, deklanşör hızı ve motorlu sahnenin hareketli hızı da küçük faktörlerdir. Başparmak bir kural olarak, görüntüleme 106 damlacıkları 60 × büyütme en az 10-20 dakika gerektirir. Bu kaçınılmaz zaman gecikmesi, veri analizinde her zaman dikkatli bir şekilde dikkate alınması gereken bazı hatalara yol açar. Diğeri ise, tek bir alt tabakadaki toplam damlacık sayısının 108-109'ugeçmeyecek olması, damlacıkların yoğunluğunu artırması veya damlacıkların bireysel boyutunu azaltmasıdır. Bunun nedeni, maske hizalayıcı (4-inç gofretler için) tarafından ele alınabilir cam substrat boyutu sınırlıdır olmasıdır. Büyük, ince ve kırılgan cam yüzey kullanımı zor olduğundan kapak camı boyutunu daha da artırmak tavsiye edilmez.
FemDA süper minyatür mikrotiter plaka olarak kabul edilebilir. 96 kuyulu mikrotiter plakalarda yapılan herhangi bir biyokimyasal reaksiyonFemDA kullanılarak yapılabilir. Kesinlikle karmaşık protein saflaştırma olmadan enzim aktivitesi ölçümü için kullanılabilir. Ayrıca dijital polimeraz zincir reaksiyonu ile uyumlu olabilir (dijital PCR) ve dijital enzim bağlantılı immünosorbent tsay (dijital ELISA)31,49. Küçük hacimli, büyük dizi ve yüksek kararlılık mevcut dijital biyoassay yöntemleriüzerinde bazı avantajlar getirecek. Femtolitre damlacıklarında farklı sayıda şablon DNA molekülünü çözebilen FemDA sistemi, doğru protein taramasının gücünü göstermiştir13. FemDA, çeşitli enzimleri hızla geliştirebilen yeni bir in vitro komedalizasyon sistemidir. Biyoinformatik ve kütüphane yapım tekniklerinde gelişmeler ile, yüksek performanslı proteinlerin hızlı bir on-demand oluşturma dönemi kesinlikle geliyor olacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma JSPS KAKENHI hibe numarası JP18K14260 ve Japonya Ajansı Deniz-Dünya Bilim ve Teknoloji için bütçe tarafından desteklenmiştir. Biz shigeru Deguchi (JAMSTEC) ve Tetsuro Ikuta (JAMSTEC) karakterizasyon tesisleri sağlamak için teşekkür ederiz. Ken Takai'ye (JAMSTEC) ticari yazılım desteği için teşekkür ederiz. Mikro fabrikasyon, Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı 'Nanoteknoloji Platform Programı (MEXT), Japonya, Grant Number JPMXP09F19UT0087 tarafından desteklenen Tokyo Üniversitesi Takeda Sentanchi Supercleanroom'da gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | |
| 1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
| 2-propanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. |
| 3D laser scanning confocal microscope | Lasertec | OPTELICS HYBRID | Other similar microscopes (e.g., Keyence VK-X1000, Olympus LEXT OLS5000) are also applicable. |
| 50 mL syringe | Terumo | SS-50LZ | |
| 6,8-difluoro-4-methylumbelliferyl phosphate | Thermo Fisher Scientific | D6567 | Prepare a 5 mM stock solution in dimethyl sulfoxide |
| Acetone | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.8%. |
| Air blower | Hozan | Z-263 | |
| Aluminum block | BIO-BIK | AB-24M-02 | |
| Aluminum microtube stand | BIO-BIK | AB-136C | |
| ASAHIKLIN AE-3000 | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| BEMCOT PS-2 wiper | Ozu | 028208 | |
| Biopsy punch with plunger | Kai | BPP-10F | |
| Cover glass | Matsunami Glass | No. 1 (24 mm × 32 mm, 0.13~0.17 mm thickness) | Size-customized. |
| Cover glass staining rack | Nakayama | 803-131-11 | |
| CRECIA TechnoWipe clean wiper | Nippon Paper Crecia | C100-M | |
| Cutting mat | GE Healthcare | WB100020 | |
| CYTOP | AGC | CTL-816AP | |
| Deaeration mixer | Thinky | AR-100 | |
| Desktop cutter | Roland | STIKA SV-8 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 300 MIF | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. Other alkaline developers may be also applicable but should require optimization of development conditions (time, temperature, etc.) |
| Double-coated adhesive Kapton film tape | Teraoka Seisakusho | 7602 #25 | |
| Ethanol | Kanto Chemical | EL grade | EL: for electronic use. Purity 99.5%. |
| Fiji | Version: ImageJ 1.51n | ||
| Flat-cable cutter | Tokyo-IDEAL | MT-0100 | |
| Fomblin oil | Solvay | Y25, or Y25/6 | Free test sample may be available upon inquiry to Solvay. Fomblin Y25/6 is an alternative if Y25 is not readily available. |
| Hot plate | AS ONE | TH-900 | |
| Injection needle | Terumo | NN-2270C | 22G × 70 mm |
| Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse Ti-E | Epifluorescence specification, CCD or sCMOS camera, motorized stage, autofocus system, and high NA objective lens are required. |
| KaleidaGraph | Synergy | Version: 4.5 | |
| Mask aligner | SUSS | MA-6 | Other mask aligners are also applicable as long as the vacuum contact mode is avaliable. |
| MICROMAN pipette | GILSON | E M250E | Capillary piston tip: CP250 |
| Microsoft Excel | Microsoft | Version: 16.16.15 | |
| Mini vacuum chamber | AS ONE | MVP-100MV | |
| Nuclease-free water | NIPPON GENE | 316-90101 | |
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| PCR tube | NIPPON Genetics | FG-021D/SP | |
| Petri dish | AS ONE | GD90-15 | Diameter 90 mm, height 15 mm. |
| Photoresist | AZ Electronic Materials | AZ P4903 | AZ Electronic Materials was now acquired by Merck. AZ P4620 is an alternative. |
| Plate reader | BioTek | POWERSCAN HT | |
| Polyethelene gloves | AS ONE | 6-896-02 | Trade name: Saniment. |
| PURExpress in vitro protein synthesis kit | New England Biolabs | E6800S or E6800L | For cell-free protein synthesis reaction. |
| Reactive-ion etching system | Samco | RIE-10NR | Other RIE systems are also applicable but should require optimization of RIE conditions (gas flow rate, chamber pressure, RF power, etching time, etc.) |
| RNase inhibitor | New England Biolabs | M0314S | |
| Scotch tape | 3M | 810-1-18D | |
| Sodium hydroxide solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-09575 | 8 M concentration; danger. |
| Spin coater | Oshigane | SC-308 | |
| SURFLON S-386 surfactant | AGC | (Test sample) | Free test sample may be available upon inquiry to AGC. |
| SYLGARD 184 silicone elastomer | Dow | Sylgard184 | Chemical composition: polydimethylsiloxane. The default mixing ratio is base : curing agent = 10 : 1 (m/m). |
| Tweezers | Ideal-tek | 2WF.SA.1 2A |
|
| Ultrasonic cleaner | AS ONE | ASU-2M | |
| Vacuum chuck | Oshigane | (Customized) | Material: delrin; rectangular sample stage with multiple holes (48 holes, each with 1 mm diameter); the size is customzied to fit the size of the cover glass (24 mm × 32 mm). |
References
- Chiu, D. T., Lorenz, R. M., Jeffries, G. D. M. Droplets for ultrasmall-volume analysis. Analytical Chemistry. 81 (13), 5111-5118 (2009).
- Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77 (3), 977-1026 (2005).
- Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab on a Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
- Zhu, P. A., Wang, L. Q. Passive and active droplet generation with microfluidics: a review. Lab on a Chip. 17 (1), 34-75 (2017).
- Griffiths, A. D., Tawfik, D. S. Miniaturising the laboratory in emulsion droplets. Trends in Biotechnology. 24 (9), 395-402 (2006).
- Tran, T. M., Lan, F., Thompson, C. S., Abate, A. R. From tubes to drops: droplet-based microfluidics for ultrahigh-throughput biology. Journal of Physics D: Applied Physics. 46 (11), 114004 (2013).
- Zhang, Y., Jiang, X. Microfluidic tools for DNA analysis. DNA Nanotechnology. Fan, C. , Springer. Heidelberg. 113-153 (2013).
- Dubuc, E., et al. Cell-free microcompartmentalised transcription-translation for the prototyping of synthetic communication networks. Current Opinion in Biotechnology. 58, 72-80 (2019).
- Damiati, S., Mhanna, R., Kodzius, R., Ehmoser, E. K. Cell-free approaches in synthetic biology utilizing microfluidics. Genes. 9 (3), (2018).
- Lee, K. H., Kim, D. M. Applications of cell-free protein synthesis in synthetic biology: Interfacing bio-machinery with synthetic environments. Biotechnology Journal. 8 (11), 1292-1300 (2013).
- Supramaniam, P., Ces, O., Salehi-Reyhani, A. Microfluidics for artificial life: techniques for bottom-up synthetic biology. Micromachines. 10 (5), (2019).
- Bowman, E. K., Alper, H. S. Microdroplet-assisted screening of biomolecule production for metabolic engineering applications. Trends in Biotechnology. , (2019).
- Zhang, Y., et al. Accurate high-throughput screening based on digital protein synthesis in a massively parallel femtoliter droplet array. Science Advances. 5 (8), 8185 (2019).
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. , (2019).
- Sakane, Y., Suzuki, Y., Kasagi, N. The development of a high-performance perfluorinated polymer electret and its application to micro power generation. Journal of Micromechanics and Microengineering. 18 (10), 104011 (2008).
- Sakakihara, S., Araki, S., Iino, R., Noji, H. A single-molecule enzymatic assay in a directly accessible femtoliter droplet array. Lab on a Chip. 10 (24), 3355-3362 (2010).
- Watanabe, R., et al. Arrayed lipid bilayer chambers allow single-molecule analysis of membrane transporter activity. Nature Communications. 5, 4519 (2014).
- Chiu, C., Lisicka-Skrzek, E., Tait, R. N., Berini, P. Fabrication of surface plasmon waveguides and devices in Cytop with integrated microfluidic channels. Journal of Vacuum Science & Technology B. 28 (4), 729-735 (2010).
- Krupin, O., Asiri, H., Wang, C., Tait, R. N., Berini, P. Biosensing using straight long-range surface plasmon waveguides. Optics Express. 21 (1), 698-709 (2013).
- Hanada, Y., Ogawa, T., Koike, K., Sugioka, K. Making the invisible visible: a microfluidic chip using a low refractive index polymer. Lab on a Chip. 16 (13), 2481-2486 (2016).
- Berry, S., Kedzierski, J., Abedian, B. Low voltage electrowetting using thin fluoroploymer films. Journal of Colloid and Interface Science. 303 (2), 517-524 (2006).
- Lin, Y. Y., et al. Low voltage electrowetting-on-dielectric platform using multi-layer insulators. Sensors and Actuators B-Chemical. 150 (1), 465-470 (2010).
- Kimura, H., Yamamoto, T., Sakai, H., Sakai, Y., Fujii, T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab on a Chip. 8 (5), 741-746 (2008).
- Yang, T. J., Choo, J., Stavrakis, S., de Mello, A. Fluoropolymer-coated PDMS microfluidic devices for application in organic synthesis. Chemistry-a European Journal. 24 (46), 12078-12083 (2018).
- de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Reviews of Modern Physics. 57 (3), 827-863 (1985).
- Holtze, C., et al. Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions. Lab on a Chip. 8 (10), 1632-1639 (2008).
- Wagner, O., et al. Biocompatible fluorinated polyglycerols for droplet microfluidics as an alternative to PEG-based copolymer surfactants. Lab on a Chip. 16 (1), 65-69 (2016).
- Mashaghi, S., Abbaspourrad, A., Weitz, D. A., van Oijen, A. M. Droplet microfluidics: a tool for biology, chemistry and nanotechnology. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 82, 118-125 (2016).
- Mazutis, L., et al. Droplet-based microfluidic systems for high-throughput single DNA molecule isothermal amplification and analysis. Analytical Chemistry. 81 (12), 4813-4821 (2009).
- Galinis, R., et al. DNA nanoparticles for improved protein synthesis in vitro. Angewandte Chemie-International Edition. 55 (9), 3120-3123 (2016).
- Zhang, Y., Noji, H. Digital bioassays: theory, applications, and perspectives. Analytical Chemistry. 89 (1), 92-101 (2017).
- Mazutis, L., et al. Single-cell analysis and sorting using droplet-based microfluidics. Nature Protocols. 8 (5), 870-891 (2013).
- Courtois, F., et al. An integrated device for monitoring time-dependent in vitro expression from single genes in picolitre droplets. ChemBioChem. 9 (3), 439-446 (2008).
- Baret, J. C. Surfactants in droplet-based microfluidics. Lab on a Chip. 12 (3), 422-433 (2012).
- Agresti, J. J., et al. Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4004-4009 (2010).
- Fallah-Araghi, A., Baret, J. C., Ryckelynck, M., Griffiths, A. D. A completely in vitro ultrahigh-throughput droplet-based microfluidic screening system for protein engineering and directed evolution. Lab on a Chip. 12 (5), 882-891 (2012).
- Duncombe, T. A., Dittrich, P. S. Droplet barcoding: tracking mobile micro-reactors for high-throughput biology. Current Opinion in Biotechnology. 60, 205-212 (2019).
- Qin, D., Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. Analytical Chemistry. 79 (9), 3248-3253 (2007).
- Shaner, N. C., et al. A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum. Nature Methods. 10 (5), 407-409 (2013).
- Bradshaw, R. A., et al. Amino acid sequence of Escherichia coli alkaline phosphatase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 78 (6), 3473-3477 (1981).
- Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Mantilla, C. B., Prakash, Y. S., Sieck, G. C. Volume measurements in confocal microscopy. Techniques in Confocal Microscopy. Conn, P. M. , Academic Press. Oxford, UK. 143-162 (2010).
- Noji, H. Single-molecule counting of biomolecules with femtoliter dropret chamber array. The 17th International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (TRANSDUCERS & EUROSENSORS XXVII. , 630-632 (2013).
- Zhang, Y., et al. Matrix-localization for fast analysis of arrayed microfluidic immunoassays. Analytical Methods. 4 (10), 3466-3470 (2012).
- Zhang, Y., et al. Two dimensional barcode-inspired automatic analysis for arrayed microfluidic immunoassays. Biomicrofluidics. 7 (3), 034110 (2013).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E. Digital image processing. , Pearson. New York, NY. (2018).
- Cohen, L., Walt, D. R. Single-molecule arrays for protein and nucleic acid analysis. Annual Review of Analytical Chemistry. 10 (1), 345-363 (2017).
