Summary
La generación de rotavirus recombinantes a partir del ADN plásmido proporciona una herramienta esencial para el estudio de la replicación del rotavirus y la patogénesis, y el desarrollo de vectores de expresión de rotavirus y vacunas. En este documento, describimos un enfoque de genética inversa simplificado para generar rotavirus recombinantes, incluyendo cepas que expresan proteínas fluorescentes de reportero.
Abstract
Los rotavirus son una población grande y en evolución de virus de ARN segmentados de doble cadena que causan gastroenteritis grave en los jóvenes de muchas especies de mamíferos y aves, incluidos los seres humanos. Con la reciente llegada de los sistemas de genética inversa del rotavirus, se ha hecho posible utilizar la mutagénesis dirigida para explorar la biología del rotavirus, modificar y optimizar las vacunas rotavirus existentes y desarrollar vectores de vacunas multiobjetivo de rotavirus. En este informe, describimos un sistema de genética inversa simplificado que permite la recuperación eficiente y confiable de rotavirus recombinantes. El sistema se basa en la co-transfección de vectores de transcripción T7 que expresan rotavirus de longitud completa (+)ARN y un vector CMV que codifica una enzima de tapado de ARN en células BHK que producen constitutivamente la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7). Los rotavirus recombinantes se amplifican mediante la sosción de las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, una línea de células renales de monos que es altamente permisiva para el crecimiento del virus. En este informe, también describimos un enfoque para generar rotavirus recombinantes que expresan una proteína de reportero fluorescente separada a través de la introducción de un elemento de parada-reinicio traslacional 2A en el segmento 7 del genoma (NSP3). Este enfoque evita eliminar o modificar cualquiera de los marcos de lectura abiertos virales, permitiendo así la producción de rotavirus recombinantes que retienen proteínas virales totalmente funcionales mientras expresan una proteína fluorescente.
Introduction
Los rotavirus son las principales causas de gastroenteritis grave en lactantes y niños pequeños, así como en los jóvenes de muchas otras especies de mamíferos y aves1. Como miembros de la familia Reoviridae, los rotavirus tienen un genoma segmentado de ARN de doble cadena (dsRNA). Los segmentos del genoma están contenidos dentro de un virión icosahedral no envuelto formado a partir de tres capas concéntricas de proteína2. Sobre la base de la secuenciación y el análisis filogenético de los segmentos del genoma, se han definido nueve especies de rotavirus (A-D, F-J)3. Esas cepas que comprenden la especie de rotavirus A son responsables de la gran mayoría de las enfermedades humanas4. La introducción de vacunas contra el rotavirus en los programas de inmunización infantil a partir de la última década está correlacionada con reducciones significativas en la mortalidad y la morbilidad del rotavirus. En particular, el número de muertes infantiles asociadas al rotavirus ha disminuido de aproximadamente 528.000 en 2000 a 128.500 en 20164,5. Las vacunas contra el rotavirus se formulan a partir de cepas vivas atenuadas del virus, con 2 a 3 dosis administradas a niños a los 6 meses de edad. El gran número de cepas de rotavirus genéticamente diversas que circulan en humanos y otras especies de mamíferos, combinadas con su capacidad de evolucionar rápidamente a través de la mutagénesis y el reordenamiento, puede dar lugar a cambios antigénicos en los tipos de rotavirus que infectan a niños6,7,8. Estos cambios pueden socavar la eficacia de las vacunas existentes, lo que requiere su sustitución o modificación.
El desarrollo de sistemas de genética inversa totalmente basados en plásmidos que permiten la manipulación de cualquiera de los 11 segmentos del genoma del rotavirus se logró recientemente9. Con la disponibilidad de estos sistemas, se ha hecho posible desentrañar los detalles moleculares de la replicación del rotavirus y la patogénesis, desarrollar métodos mejorados de detección de alto rendimiento para los compuestos anti-rotavirus y crear nuevas clases potencialmente más eficaces de vacunas contra el rotavirus. Durante la replicación del rotavirus, los arnvirales (+)ARN no sólo guían la síntesis de proteínas virales, sino que también sirven como plantillas para la síntesis de la progenie dsRNA genome segmentos10,11. Todos los sistemas de genética inversa rotavirus descritos hasta la fecha se basan en la transfección de vectores de transcripción T7 en líneas celulares de mamíferos como fuente de ARN derivados del ADNC (+)ARN utilizados en la recuperación de virus recombinantes9,12,13. Dentro de los vectores de transcripción, los cDNa virales de longitud completa se colocan entre un promotor t7 ascendente y el ribozyme del virus delta de la hepatitis (HDV) aguas abajo, de tal manera que los virales (+)ARN son sintetizados por la polimerasa de ARN T7 que contienen 5' y 3'-termini auténticos (Figura 1A). En el sistema de genética inversa de primera generación, los virus recombinantes se hicieron transfectando células renales de hámster bebé que expresaban la polimerasa de ARN T7 (BHK-T7) con 11 vectores de transcripción T7 (pT7), cada síntesis de dirección de un ARN único (+)de la cepa del virus SA11 simio, y tres plásmidos de expresión promotor-drive promotor de CMV, uno que codifica la proteína de fusión reovirus aviar p10FAST y dos subunidades codificantes del complejo de enzimas de tapado del virus de la vacuna D1R-D12L9. Los virus SA11 recombinantes generados en células BHK-T7 transinfectadas se amplificaron mediante la sustitución con células MA104, una línea celular permisiva para el crecimiento del rotavirus. Se ha descrito una versión modificada del sistema de genética inversa de primera generación que ya no utiliza plásmidos de soporte12. En su lugar, el sistema modificado genera con éxito rotavirus recombinantes simplemente transfectando células BHK-T7 con los 11 vectores de transcripción SA11 T7, con la advertencia de que los vectores para la fábrica viral (viroplasmo) bloques de construcción (proteínas no estructurales NSP2 y NSP5) se añaden a niveles 3 veces más altos que los otros vectores14,15. También se han desarrollado versiones modificadas del sistema de genética inversa que apoyan la recuperación de las cepas humanas KU y Odelia del rotavirus16,,17. El genoma del rotavirus es notablemente susceptible de manipulación por genética inversa, con virus recombinantes generados hasta la fecha con mutaciones introducidas en VP418,NSP19, NSP219, NSP320,,21y NSP522,,23. Entre los virus más útiles generados hasta el momento se encuentran los que han sido diseñados para expresar proteínas de reportero fluorescente (FP)9,,12,,21,24,25.
En esta publicación, proporcionamos el protocolo para el sistema de genética inversa que utilizamos en nuestro laboratorio para generar cepas recombinantes de rotavirus SA11. La característica clave de nuestro protocolo es la co-transfección de células BHK-T7 con los vectores de transcripción 11 pT7 (modificados para incluir niveles 3x de los vectores pT7/NSP2SA11 y pT7/NSP5SA11) y un vector de expresión CMV que codifica laenzima np868R(Figura 2). En nuestras manos, la presencia del plásmido NP868R conduce a la producción de tetas más altas de virus recombinantes por células BHK-T7 transinfectadas. En esta publicación, también proporcionamos un protocolo para modificar el plásmido pT7/NSP3SA11 de tal manera que se puedan generar virus recombinantes que expresen no sólo el producto proteico del segmento 7 NSP3, sino también un FP separado. Esto se logra reingeniería el marco de lectura abierta (ORF) NSP3 en el plásmido pT7/NSP3SA11 para contener un elemento de detención-reinicio traslacional 2A descendente seguido de un FP ORF (Figura 1B)24,26. A través de este enfoque, hemos generado rotavirus recombinantes que expresan varios FP: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)24,,27,28. Estos rotavirus de expresión de FP se fabrican sin eliminar el NSP3 ORF, produciendo así virus que se espera que codifican un complemento completo de proteínas virales que funcionan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de medios y mantenimiento del cultivo celular
- Obtenga células renales de hámster bebé que expresen constitutivamente las células MA104 del ARN t7 (BHK-T7) y del riñón de mono verde africano.
NOTA: Las células BHK-T7 (o BSR-T7) no están disponibles comercialmente, pero son una línea celular común de laboratorios que utilizan genética inversa para estudiar la biología del virus del ARN. La línea celular BHK-T7 utilizada en este protocolo fue obtenida de la Dra. Ursula J. Buchholz (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, USA), co-desarrolladorde la línea celular BHK original que expresa T7 RNA polimerasa29. Las celdas MA104 están disponibles en European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) y en American Type Culture Collection (ATCC). - Preparar los siguientes medios de cultivo en un entorno estéril, preferiblemente un gabinete de seguridad biológica de clase II. Almacene los medios en la oscuridad a 4 oC y caliente a 37 oC inmediatamente antes de su uso.
NOTA: Las fuentes de componentes de medios se proporcionan en la Tabla de materiales.- Para preparar el medio incompleto de DMEM, combine 500 ml del medio esencial mínimo (MEM) modificado de Dulbecco que contiene 4,5 g/L de glucosa y 1% de glutamina con 5 ml de 100x pen-strep.
- Para preparar el medio completo dMEM, combine 500 mL de medio incompleto DMEM con 25 ml de suero bovino fetal (FBS).
- Para preparar el medio incompleto GMEM, combinar 500 ml de medio esencial mínimo de Glasgow, 5 ml de glutamina 100x, 50 ml de caldo de triptosa-fosfato (TPB), 5 ml de 100 aminoácidos no esenciales (NEAA), y 5 ml de 100x pen-strep.
- Para preparar el medio completo gMEM, combine 500 mL de medio incompleto GMEM con 25 ml de FBS inactivado por calor.
- Para preparar el medio completo GMEM+G, añadir 10 ml de genética de 50 mg/ml (G418) a 500 ml de medio completo GMEM.
- Para preparar el medio incompleto SMEM, combine 500 ml del MEM de Eagle modificado de Joklik, 5 ml de glutamina 100x, 50 mL de TPB, 5 mL de 100x NEAA y 5 mL de 100x pen-strep.
- Cultivo de células MA104 en matraces T75 o T175 que contienen 12 o 25 ml de medio completo DMEM, respectivamente. Para pasar las células MA104 que han alcanzado el 100% de confluencia, enjuague la monocapa celular 2x con solución salina tamponada de fosfato (PBS), disociar con tripsina (0,05%)-EDTA (0,1%) solución, y resuspender en 5 (matraz T75) o 10 mL de (matraz T175) de medio incompleto DMEM.
- Coloque 0,5 x 1,0 ml de células resuspendidas en matraces frescos y lleve al volumen final apropiado agregando el medio completo dMEM. Colocar los matraces en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
- Propagar células BHK-T7 en matraces T75, alternando entre el uso de GMEM y GMEM+G medio completo con cada ronda de paso. Para subculturar células BHK-T7 que han alcanzado el 100% de confluencia, enjuague la monocapa celular 2x con PBS, disocie con solución de trippsina-EDTA y resuspenda en 5 ml de medio.
- Después de colocar 15 ml de GEM o GMEM+G completo en un matraz T75 fresco, agregue cuatro gotas de células BHK-T7 resuspendidas. Colocar el matraz en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
2. Preparación del plásmido
- Obtener los siguientes plásmidos que expresan rotavirus SA11 (+)ARN de Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 y pT7/NSP5SA111. Obtener el plásmido que expresa la enzima de tapado ASFV (pCMV/NP868R) de los autores21.
NOTA: Los plásmidos pT7/NSP3SA11 modificados diseñados para expresar un FP a través de la actividad de un elemento traslacional 2A (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) también se pueden obtener de los autores24,,26. PT7/NSP3-2A-3xFL-FP plásmidos que expresan los siguientes FP están disponibles: UnaG (verde), mKate (rojo lejano), mRuby (rojo), TagBFP (azul), CFP (cian) y YFP (amarillo)24. - Transformar plásmidos en Ecompetente . coli DH5 y esparcir bacterias en las placas de agar caldo de Luria que contienen el antibiótico adecuado. Cultivar cultivos bacterianos recogidos de colonias individuales y preparar cantidades más pequeñas de plásmido (20 g) utilizando un kit de purificación miniprep de espín(Tabla de materiales),de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Preparar grandes cantidades de plásmido de cultivos bacterianos utilizando kits de purificación midi y maxi(Tabla de materiales).
NOTA: Los plásmidos adecuados para su uso en el sistema de genética inversa también se han preparado con otros kits de purificación de plásmidos. No es necesario preparar plásmidos utilizando kits diseñados específicamente para generar material libre de endotoxinas. - Ajuste las concentraciones de plásmidos purificados a 1 mg/ml en agua de grado de biología molecular libre de nucleasas. Compruebe la pureza del plásmido confirmando una relación de absorción de 260/280 de 1,8 euros utilizando un espectrofotómetro. Además, utilice electroforesis en geles de agarosa al 0,8% para verificar que los plásmidos están predominantemente superbobinados.
- Plásmidos purificados de aliquot en tubos de microcentrífuga estériles de 0,5 ml, cada uno de los cuales contiene 10 l. Almacene los plásmidos a -80 oC.
3. Generación de virus recombinantes
NOTA: La investigación del rotavirus humano y animal, incluida la generación y caracterización de cepas de rotavirus recombinantes, debe tratarse en condiciones de nivel 2 de seguridad de la biotecnología (BSL-2) y requerirá la aprobación previa del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC). Las condiciones adecuadas de laboratorio de BSL-2 se describen en Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos (BMBL) producidos por los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC)30.
- Día 1: sembrado de células BHK-T7 en placas de 12 pocillos
- Enjuague una monocapa recién confluente de células BHK-T7 contenidas en un matraz T75 2x con PBS. Interrumpa la monocapa celular con la solución trypsin-EDTA y resuspenda las células en 5 ml de medio completo de GMEM.
- Utilice un contador de células automatizado y una solución trypan-blue para determinar la concentración de células BHK-T7 viables en el medio. Células de semilla en placas de cultivo celular de 12 pocillos, cada pocal que contiene 2 x 105 células en un volumen total de 1 mL de GMEM (libre de G418) medio completo. Incubar en una incubadora de CO2 de 37oC, 5%. Las células deben alcanzar una confluencia del 80-90% para el día 2.
- Día 2: transfección de células BHK-T7 con mezclas de plásmido
- Para preparar la mezcla de plásmido, combine lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml utilizando existencias de plásmido ajustadas a 1 mg/ml: 0,8 ml cada una de plásmidos SA11 pT7 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 y NSP4, 2,4 l cada uno de plásmidos SA11 pT7 NSP2 y NSP5, y 0,8 l de pCMV/NP868R. Mezcle suavemente los plásmidos tocando el tubo y recopile el contenido por centrifugación por pulso. Para preparar virus recombinantes que expresan FP, sustituya pT7/NSP3SA11 por el plásmido pT7/NSP3-2A-3xFL-FP adecuado.
NOTA: Las mezclas de plásmido deben almacenarse en hielo hasta que se utilicen. Se debe preparar un tubo separado para cada transfección. - Para preparar la mezcla de reactivos de plásmido/medio sérico reducido/transfección: Añadir 110 ml de medio sérico precalentado (37 oC) reducido(Tabla de materiales)a cada mezcla de plásmido y mezclar pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. A continuación, añadir 32 l de reactivo de transfección(Tabla de materiales)a cada mezcla de color plásmido/reducción del medio sérico; esto produce una concentración de 2,5 ml de reactivo de transfección por g de plásmido en mezclas. Mezclas de vórtice suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 20 min.
- Durante el período de incubación de 20 minutos, enjuague las células BHK-T7 en placas de 12 pocillos (preparadas el día 1) una vez con 2 ml de medios incompletos de GMEM. Después, añadir 1 mL de medio incompleto SMEM a cada pocal y devolver las placas a la incubadora.
- Después del período de incubación de 20 minutos, agregue el plasmido/reducción del medio sérico/la mezcla de transfección gota a gota a cada pocador de las placas de 12 pocillos utilizando un pipeteador de 200 l. Suavemente las placas de roca y volver a una incubadora de CO2 de 37oC, 5%.
- Para preparar la mezcla de plásmido, combine lo siguiente en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml utilizando existencias de plásmido ajustadas a 1 mg/ml: 0,8 ml cada una de plásmidos SA11 pT7 VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 y NSP4, 2,4 l cada uno de plásmidos SA11 pT7 NSP2 y NSP5, y 0,8 l de pCMV/NP868R. Mezcle suavemente los plásmidos tocando el tubo y recopile el contenido por centrifugación por pulso. Para preparar virus recombinantes que expresan FP, sustituya pT7/NSP3SA11 por el plásmido pT7/NSP3-2A-3xFL-FP adecuado.
- Día 4: trassando las células BHK-T7 transinfectadas con células MA104
- Enjuague una monocapa recién confluente de células MA104 contenidas en un matraz T75 2x con PBS. Interrumpa la monocapa usando la solución trypsin-EDTA y resuspenda las células en 5 ml de medio completo de DMEM.
- Usando un contador de células automatizado y una solución trypan-blue, determine la concentración de células MA104 viables en el medio. Ajuste la concentración a 8 x 105 células MA104/ml en medio incompleto DMEM y agregue 0,25 ml de células suspendidas (2 x 105 células) con gota a los pozos que contienen células BHK-T7 transinfectadas.
- Ajustar la concentración de tripsina (pancreática porcina tipo IX) en el medio a 0,5 g/ml añadiendo 0,8 ml de 1 mg/ml de stock de tripsina a cada pocal.
NOTA: Las existencias de tripsina deben prepararse en PBS, alícuotas y almacenarse a -20 oC. - Utilice las células MA104 restantes para preparar placas de 6 pocillos que serán necesarias en el día 7 para amplificar los virus recombinantes. Para las placas de 6 pocillos de semilla, diluir las células MA104 resuspendidas a una concentración de 1,5 x 105 células/ml en el medio completo de DMEM y colocar 2 ml en cada poca. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
- Día 7: recuperación y amplificación del virus recombinante de células transinfectadas
- Sujeto células BHK-T7/MA104 en placas de 12 pocillos a tres ciclos de congelación-descongelación en condiciones estériles, moviendo placas entre un congelador de -20 oC y una superficie de temperatura ambiente. Después de transferir los lysates a tubos de 1,5 ml, los tubos de centrífuga durante 10 minutos a 500 x g (4 oC) a los desechos celulares grandes de pellets. Recoger el sobrenadante y almacenar a 4 oC (corto plazo) o -20 oC (largo plazo).
- Lavar MA104 monocapas en placas de 6 pocillos (preparadas el día 4) 2x con PBS. Coloque 2 ml de medio incompleto DMEM en cada pocal que contenga 0,5 g/ml de trippsina. Añadir 300 sL de sobrenadante recuperado de los lysates de células BHK-T7/MA104 en pozos y colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC y 5%.
- Incubar placas durante 7 días o hasta que se observen efectos citopáticos completos (CPE). Células Lyse MA104 en placas de 6 pocillos por tres ciclos de congelación-descongelación, luego transfiere los lysates a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Pellet grandes desechos celulares por centrifugación durante 10 min a 500 x g (4 oC). Transfiera los lysates celulares clarificados a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y guárdelos a -20 oC.
4. Aislamiento de placa de virus recombinantes
- Activar los virus en 100 oC de lisados celulares clarificados añadiendo tripsina a una concentración final de 10 g/ml e incubando a 37 oC durante 1 h. Preparar una serie de dilución en serie de 10 veces que van de 10-1 a 10-7 (1 ml cada una) en un medio incompleto DMEM.
- Enjuague MA104 monocapas en placas de 6 pocillos 2x con 2 ml de PBS y una vez con medio incompleto DMEM. Añadir 400 ml de diluciones de lisado por duplicado a las placas. Incubar las placas durante 1 h en una incubadora de 37oC, 5%co2, meciéndose cada 10 a 15 minutos para redistribuir las diluciones a través de la monocapa.
- Preparar una solución de superposición de agarosa-MEM combinando volúmenes iguales de medio esencial mínimo de 2x Eagle (EMEM; precalentado a 37oC) con 1,5% de agarosa que se ha derretido en agua utilizando un horno microondas y preenfriado a 45oC. Mantener la solución superpuesta a 42 oC utilizando un baño de agua y ajustar a una concentración final de 0,5 g/ml de trippsina inmediatamente antes de colocarla en las células.
- Extrae las diluciones de lisados de placas de 6 pocillos, luego enjuague las células una vez con 2 ml de DMEM incompleto. Superponga suavemente 3 ml de la solución de superposición de agarosa-MEM en la monocapa de celda contenida en cada pocil. Deje que la superposición de agarosa se endurezque a temperatura ambiente y, a continuación, devuelva las placas a la incubadora.
- Tres días más tarde, prepare una solución de superposición de agarosa-MEM como en el paso 4.3 y lleve a 42 oC. Inmediatamente antes de su uso, ajuste la solución de superposición a una concentración final de 50 g/ml de rojo neutro(Tabla de materiales).
- Agregue 2 ml de la solución de superposición encima de la capa de agarosa existente en las placas de 6 pocillos. Después de permitir que la nueva capa de agarosa se endurezque, devuelva las placas a la incubadora. Proteja las soluciones y placas que contienen rojo neutro de la exposición a la luz.
- Durante las siguientes 6 h, identifique las placas de rotavirus en las placas de 6 pocillos con la ayuda de una caja de luz. Escoja placas claramente definidas usando tuberías de transferencia desechables, recuperando tapones de agarosa que se extienden completamente a la capa celular.
- Expulsar el enchufe en un tubo de 1,5 ml que contenga 0,5 ml de medio incompleto DMEM y vórtice la muestra durante 30 s. Amplificar el virus aislado de placa eludado en el medio por propagación en monócapas MA104 en placas de 6 pocillos o t25 que contienen medio incompleto DMEM y trippsin a 0,5 g/ml.
NOTA: En Arnold et al.31se encuentra disponible información adicional sobre el aislamiento y la titering del rotavirus mediante ensayo de placa.
5. Electroforesis de gel de dsRNA viral
- Colocar 600 ml de lysates celulares infectados clarificados y 400 l de tiocianato de guanidinio en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml, vórtice durante 30 s e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 200 l de cloroformo, vórtice durante 30 s e incubar durante 3 min. Después de la centrifugación durante 5 min a 13.000 x g (4 oC), transfiera 550 ml de la fase acuosa superior a tubos nuevos.
- Recuperar dsRNA viral de la fase acuosa mediante la adición de 2 volúmenes (900 ol) de alcohol isopropílico frío y tubos invertidos 4 x 6x. Después de incubar a temperatura ambiente durante 10 min, tubos centrífugos durante 10 min a 13.000 x g (4 oC). Deseche los sobrenadores y conserve los pellets de ARN.
- Lavar los pellets añadiendo 1 ml de etanol al tubo, invirtiendo una vez y centrifugando durante 5 min a 7.500 x g (4 oC). Después de retirar cuidadosamente el lavado de etanol con un pipeteador, deje que los pellets de ARN se sequen al aire en el banco de laboratorio durante 5 a 10 minutos. Disolver los gránulos de ARN en 15 ml de agua de grado de biología molecular libre de nucleasas y almacenarlos a -20 oC.
- Combine 10 ml de muestras de ARN disuelto con 2 l de tampón de carga de ADN 6x, cargue en minigeles de poliacrilamida prefabricados al 10% (o equivalentes fundidos a mano) y resuelva los ARN por electroforesis en tampón de carrera Tris-glicina durante 2 h bajo una corriente constante (16 mA). Remoje los geles durante 5 a 10 minutos en agua que contengan bromuro de etidio de 1 g/ml y detecte segmentos del genoma del rotavirus con un transiluminador UV.
6. Recuperación y secuenciación del dsRNA viral
- Localice las bandas virales dsRNA en geles de poliacrilamida preferiblemente utilizando luz UV de longitud de onda larga de baja intensidad, para evitar generar reticulados de ácido nucleico. Con una cuchilla de afeitar fresca, corte los fragmentos de gel que contienen bandas dsRNA y transfiera a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Después de añadir 10 x 20 l de agua libre de RNase, tritura cada fragmento con una plaga de pellets desechables sin RNase diseñada para adaptarse a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml o mediante la elaboración y bajada a través de una aguja de 18 G. Incubar fragmentos triturados durante la noche a 4oC.
- Recuperar 3 l de líquido de tubos que contienen fragmentos de gel triturados. Genere cDNAs de los drnA virales utilizando un kit de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa de un paso (RT-PCR)(Tabla de materiales)y imprimaciones de oligonucleótidos apropiadas.
NOTA: Los productos PCR se purifican con gel con un kit de limpieza de PCR(Tabla de Materiales)y se envían para la secuenciación durante la noche, junto con los cebadores, por los servicios de secuencia de ADN comercial.
7. Análisis inmunoblot de proteínas virales
- Placas de 6 pocillos semilla con 3 x 105 células MA104 por pozo en un volumen total de 2 ml de medio completo DMEM. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% y dejar hasta que las células alcancen la confluencia (3-5 días).
NOTA: Los pozos con monocapas confluentes contendrán 1,2 x10 celdas. - Tratar los sobrenatos clarificados incubando con 10 g/ml de trippsina a 37 oC durante 1 h para activar las partículas de rotavirus recombinante contenidas en ellos.
- Enjuague MA104 monocapas en placas de 6 pocillos 2x con 2 ml de PBS. Infectar las células añadiendo, a cada pozo, 200 l de inóculo que contiene 3 x 5 unidades formadoras de placa (PFU) por célula de rotavirus activado por trippsina en medio incompleto DMEM. Devuelva las placas a la incubadora.
- Cada 10 minutos, retire las placas y mezcle suavemente para redistribuir el inóculo a través de la monocapa celular. Después de 1 h, reemplace el inóculo por un medio incompleto de 2 ml de DMEM.
- A las 8 h después de la infección, enjuague las células en placas de 6 pocillos 2x con PBS. Raspar las células en 750 s de PBS y transferir el volumen a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Enjuague la placa con otros 750 ml de PBS y combínelo con la muestra de 750 ml previarecogida.
- Células de pelet en la muestra centrifugando a 5.000 x g durante 10 min a 4oC. Después de desechar el sobrenadante, almacene los gránulos celulares a -80 oC hasta que se procesen más.
- Prepare el tampón de lisis celular que contenga 300 mM de NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2% Triton X-100 y 1 inhibidor completo de la proteasa libre de EDTA. Después de añadir 300 l de tampón de lisis a los gránulos de células congeladas, muestras de vórtice brevemente e incubar en hielo durante 10 min.
- Repita el proceso de vórtice e incubar muestras sobre hielo 3x. Después, las muestras de centrífuga a 15.000 x g durante 10 min a 4 oC, luego recoger los sobrenatolentes y almacenar a -80 oC.
- Resolver proteínas contenidas en volúmenes de 20 l de muestras de sobrenadantes por electroforesis en minigeles de poliacrilamida lineales prefabricados de 8 a 16% y transferencia a membranas de nitrocelulosa. Bloquear membranas incubando con PBS-Tween 20 (0.02%) solución que contiene un 5% de leche seca sin grasa.
- Sondas de membranas mediante la incubación con uno o más anticuerpos primarios (por ejemplo, antisuero anti-NSP3 o anti-VP6 de conejillo de indias, anticuerpo anti-Bandera M2 monoclonal de ratón o anticuerpo anti-PCNA monoclonal de conejo). Detectar anticuerpos primarios mediante la incubación de membranas con igG anti-ratón de caballo, conde anti-guinea IgG, o cabra anticonejo IgG rábano picante peroxidasa conjugada anticuerpos secundarios, seguido por el sustrato de quimioluminiscencia de quimioluminiscencia (ECL) mejorado. Visualice señales de luminiscencia utilizando un sistema de imágenes de gel(Tabla de materiales)o una película de rayos X.
8. Imágenes de células vivas de células infectadas con virus que expresan FP
- Placas de 6 pocillos semilla con 3 x 105 células MA104 por pozo en un total de 2 ml de medio completo DMEM. Colocar las placas en una incubadora de CO2 de 37oC, 5% y dejar hasta que las células alcancen la confluencia (3-5 días).
NOTA: Los pozos con monocapas confluentes contendrán 1,2 x10 celdas. - Activar las muestras de rotavirus, de marea conocido, por incubación con 10 g/ml de trippsina a 37oC durante 1 h.
- Enjuague placas de 6 pocillos con MA104 monocapas 2x con 2 ml de PBS. Infectar las células añadiendo a cada pozo 200 l de inóculo que contiene 3 x 5 PFU por célula de rotavirus activado por trippsina en medio incompleto DMEM. Devuelva las placas a la incubadora y las placas de roca suavemente para redistribuir el inóculo a través de la monocapa celular cada 10 minutos.
NOTA: Los pozos que se simulan infectados con inóculo DMEM libre de virus deben incluirse como controles. - Después de 1 h de adsorción de virus, enjuague la monocapa 2x con PBS y reemplace el medio por 0,5 ml por pozo de medio incompleto DMEM. A las 7,5 h después de la infección, reemplace el medio de cultivo por DMEM con baja fluorescencia de fondo(Tabla de materiales). A las 8 h después de la infección, utilice un generador de imágenes de células vivas para examinar las células con un aumento de 20 x en busca de señal de fluorescencia verde, roja o azul.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El protocolo de genética inversa descrito en este artículo se lleva a cabo a través de múltiples pasos distintos: (1) co-transfección de células BHK-T7 con vectores de transcripción de rotavirus pT7 y un plásmido de expresión pCMV/NP868R, (2) la sustitución de células BHK-T7 transinfectadas con células MA104, (3) amplificación de virus recombinantes presentes en las células BHK-T7/MA104 se lisia utilizando células MA104 y (4) el aislamiento de la placa del virus recombinante utilizando células MA104(Figura 2). En nuestras manos, el protocolo es eficiente, produciendo tetas del virus sa11 de tipo salvaje recombinante (rSA11/wt) en lisados celulares BHK-T7/MA104 de 104 PFU/ml y en lysatos de células MA104 amplificados de >1 x 107 PFU/mL. Los virus recombinantes SA11 generados por la genética inversa utilizando plásmidos pT7/NSP3SA11 modificados que expresan FP (por ejemplo, rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) crecen a tituladores que son 4 veces menos que rSA11/wt.
Siguiendo el protocolo de genética inversa, generamos virus SA11 recombinantes que fueron fácilmente identificados por el ensayo de placa en células MA104, permitiendo así el aislamiento de la placa(Figura 3D). Los virus en las placas fueron recogidos con un pipeta de transferencia desechable de punta larga y amplificados en las células MA104. Los genomas dsRNA de los virus purificados por placa rSA11/wt y rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG se extrajeron con tiocianato de guanidinio, se resolvieron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10%, y se detectaron mediante la tinción con bromuro de etidio(Figura 3A). Como era de esperar, el segmento 7 (NSP3) dsRNA de rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG migró mucho más lento que el de rSA11/wt(Figura 3A)debido a la presencia de secuencias 2A-3xFL-UnaG. El segmento 7 (NSP3) dsRNA de rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG fue purificado en gel, convertido a forma de ADNc por RT-PCR, y secuenciado para confirmar la precisión.
Para comprobar la expresión de la proteína fluorescente UnaG, las células MA104 en placas de 6 pocillos se infectaron con 3 PFU por célula de rSA11/wt y rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. A las 8 h después de la infección, el medio de cultivo en placas fue reemplazado por 0,5 ml de DMEM con baja fluorescencia de fondo por pocido y las placas incubadas durante 30 minutos adicionales a 37 oC en una incubadora de CO2. Después, se examinaron las placas para la expresión UnaG utilizando un imager de celda viva. El análisis mostró que rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG producía fluorescencia verde, verificando la funcionalidad del gen UnaG en el virus recombinante(Figura 3B). Por el contrario, no se detectó fluorescencia verde en células infectadas con rSA11/wt. Para abordar si el elemento 2A en el segmento modificado 7 de rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG promovió la expresión de dos proteínas separadas (NSP3-2A y 3xFL-UnaG), las células MA104 estaban infectadas con rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG y rSA11/wt. Los licitares celulares se prepararon a partir de células cosechadas a 8 h después de la infección, resueltas por electroforesis de gel, y se borraron en filtros de nitrocelulosa. Las manchas fueron sondeadas con anticuerpos específicos para rotavirus VP6 y NSP3, y etiqueta FLAG. El análisis mostró que NSP3-2A y 3xFL-UnaG se expresaron como proteínas separadas en células infectadas con rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, lo que indica que el elemento 2A era funcional(Figura 3C). Las células infectadas con rSA11/wt no expresaron proteína según el anticuerpo anti-FLAG. La proteína NSP3 presente en las células infectadas por rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG por anticuerpos anti-NSP3 migró ligeramente más lenta que NSP3 presenteen en las células infectadas por rSA11/wt debido a la presencia de residuos 2A remanentes en el término C de NSP3.
Figura 1: Rotavirus plásmidos de genética inversa. (A) Los CDNAs de longitud completa de los 11 segmentos del genoma del rotavirus SA11 se colocan dentro de plásmidos pT7, ligados aguas arriba con un promotor de la polimerasa de ARN T7 y aguas abajo con un ribozyme HDV. En presencia de ARN polimerasa T7, los plásmidos del rotavirus pT7 producen SA11 (+)ARN de longitud completa con auténticos 5' y 3' termini. (B) Esquemas del (+)ARN y productos proteicos elaborados por el plásmido pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG. El esquema incluye la secuencia NSP3 cDNA y secuencias para el elemento similar al teschovirus porcino 2A (2A), la etiqueta 3x FLAG (FL) y la proteína fluorescente verde UnaG. La posición del sitio de parada-reinicio traslacional 2A se indica con una flecha roja. Debido a la actividad del elemento 2A, la traducción del ARN produce dos proteínas. La porción NSP3 contiene los restos del elemento 2A y la porción UnaG se fusiona con una etiqueta FLAG 3x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Sistema genético inverso de Rotavirus. Las monocapas BHK-T7 están transcusadas con 11 plásmidos pT7, cada uno de los dos expresa un SA11 (+ARN) diferente, y un vector pCMV que expresa la enzima de tapamiento NP868R del virus de la pvinocino africana (ASFV) (pCMV/NP868R). A los 3 días posteriores a la infección (d.p.i.), las células BHK-T7 se supervisan con células MA104. A los 7 días posteriores a la infección, los rotavirus recombinantes en los lysatos celulares BHK-T7/MA104 se amplifican por el paso en las células MA104, luego se aíslan mediante la purificación de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Características de las cepas recombinantes rSA11/wt y rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) Perfiles electroforéticos de los segmentos del genoma dsRNA de cepas rSA11 aisladas en placa. Los 11 segmentos del genoma están numerados y el desplazamiento en la posición del segmento 7 (NSP3) se indica con una línea roja. (B) Fluorescencia detectada en células MA104 infectadas por rSA11 a 8 h después de la infección utilizando un imager de células vivas (aumento de 20x) establecido en el canal de detección verde. Barra de escala a 100 m. (C) Análisis de inmunoblot de proteínas presentes a 8 h después de la infección en células MA104 infectadas con cepas rSA11 utilizando anti-VP6 de conejillo de indias y antisuero anti-NSP3 y anticuerpo monoclonal anti-FLAG de ratón. (D) Placas producidas por rSA11/wt en células MA104 a los 3 días posteriores a la infección y detectadas por tinción roja neutra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En nuestro laboratorio, nos basamos rutinariamente en el protocolo de genética inversa descrito aquí para producir rotavirus SA11 recombinantes. Con este enfoque, las personas con poca experiencia en técnicas de biología molecular o el trabajo con rotavirus recuperan virus recombinantes incluso en su primer intento. Hemos generado cerca de 100 virus recombinantes siguiendo este protocolo, incluidos aquellos con genomas que han sido rediseñados para expresar proteínas extrañas (por ejemplo, FPs) y que contienen adiciones de secuencia, deleciones y mutaciones puntuales.
Las condiciones y los tiempos de incubación indicados en este protocolo se aplican a la recuperación de cepas de virus recombinantes. Se deben considerar ajustes si se intenta recuperar virus SA11 que, debido a la modificación genética, pueden esperarse que crezcan mal. En particular, debido a que el titer de estos virus en los lysates celulares BHK-T7/MA014 transinfectados puede ser bajo, normalmente duplicamos la cantidad de lisato utilizado como inóculo en los pasos de amplificación posteriores. Además, en el paso de amplificación, los virus de crecimiento deficiente pueden requerir tiempos más largos de incubación antes de alcanzar niveles de EPC suficientes para la cosecha celular. De hecho, con estos virus, podemos permitir que las infecciones continúen durante 10 a 14 días, o incluso más, antes de cosechar las células. Por último, es probable que los virus de crecimiento deficiente generen pequeñas placas de crecimiento lento en las células MA104. Por lo tanto, para aislar la placa de estos virus, puede ser necesario permitir que las placas se desarrollen hasta 6 o 10 días después de la infección antes de manchar las células con rojo neutro y recoger placas.
En nuestra experiencia, el factor más importante en la recuperación confiable del rotavirus recombinante es el uso de células BHK-T7 sanas y bien mantenidas. En nuestro laboratorio, pasamos rutinariamente células BHK-T7 2 veces a la semana en la misma dilución utilizando medio complementado no sólo con 10% FBS, sino también con NEAA, TPB, y altos niveles de glucosa (GMEM medio completo). Los suplementos adicionales ayudan a las células BHK-T7 a conservar la viabilidad extendida después de la transfección de plásmido, un factor probablemente crucial para recuperar virus recombinantes mutantes de crecimiento deficiente. Complementamos el medio cada otro pasaje con G418, un antibiótico que selecciona para el mantenimiento del plásmido de expresión de la polimerasa T7. Las condiciones de paso deben ser tales que las células BHK-T7 nunca se les permita crecer más allá de la confluencia, condiciones que conducen rápidamente a una disminución de la viabilidad celular. Para nosotros, las células BHK-T7 a las que se les ha permitido crecer en exceso funcionan mal en el protocolo de genética inversa, incluso si las células se enchuan posteriormente apropiadamente varias veces. En lugar de intentar rehabilitar las células BHK-T7 cubiertas, reiniciamos el linaje con células previamente almacenadas en nitrógeno líquido.
La contaminación por micoplasma de las células BHK-T7 y MA104 puede ser un factor importante en el fallo del sistema de genética inversa del rotavirus para generar virus recombinantes. En nuestro laboratorio, utilizamos un kit de detección de micoplasma basado en PCR(Tabla de Materiales)para comprobar la contaminación de las líneas celulares, y cuando se detecta, se asocia con mayor frecuencia con nuestras células BHK-T7. No hemos intentado curar las líneas celulares de contaminación del micoplasma, sino el restablecimiento de las líneas con pasajes anteriores libres de micoplasma almacenados en nitrógeno líquido. Antes de iniciar nuevas líneas celulares, descartamos todos los suplementos medianos y medianos utilizados anteriormente y descontaminamos a fondo incubadoras, gabinetes de seguridad biológica, baños de agua, bancos de laboratorio y pipeteadores. También utilizamos kits de detección de micoplasma para comprobar la contaminación de las existencias de virus recombinantes. Debido a la resistencia de las partículas de rotavirus a la desnaturalización por disolventes orgánicos, como Vertrel VF32,es posible liberar las reservas de virus de contaminar el micoplasma, negando la necesidad de regenerar virus recombinantes por genética inversa. Es importante destacar que las líneas celulares y los preparados de virus recibidos en el laboratorio deben ser revisados para la contaminación por micoplasma antes del uso rutinario.
Aunque día tras día, utilizamos el mismo protocolo para generar virus recombinantes, sabemos que se pueden hacer ciertas modificaciones que no impedirán la recuperación del virus. Por ejemplo, i) no se requiere co-transfección del plásmido enzimático de taponamiento pCMV/NSP868R con vectores SA11 pT7 para la recuperación de virus recombinantes. Si bien la adición del plásmido de tapado produce lanzates de virus más altos en los licentos celulares BHK-T7/MA104 transinfectados, hemos sido capaces de recuperar numerosos virus, incluidos los que expresan FP, sin él. Sin embargo, hemos llegado a la conclusión de que la expresión de la enzima de taponamiento por pCMV/NP868R puede contribuir significativamente a la recuperación de virus menos aptos. (ii) Hemos encontrado que se pueden generar virus recombinantes incluso si la cantidad del reactivo de transfección(Tabla de Materiales)utilizado en el protocolo de genética inversa se reduce en la mitad, una modificación que puede reducir significativamente los gastos. (iii) Del mismo modo, hemos determinado que el medio completo M199 se puede utilizar en lugar del medio completo DMEM. (iv) Por último, no existe ningún requisito establecido con respecto al tipo de columna vertebral vectorial que debe utilizarse en la producción de vectores de transcripción SA11 T7. Mientras el ADNC viral en el plásmido esté rodeado por un promotor de T7 aguas arriba y un ribozyme HDV descendente y un terminador T7, se puede esperar que el plásmido apoye la recuperación del virus recombinante. En particular, los vectores basados en pGEM, pBluescript y pUC se han utilizado con éxito en el sistema genético inverso.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones De NIH R03 AI131072 y R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, y el Lawrence M. Blatt Endowment. Agradecemos a los miembros del laboratorio IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, y Guido Papa por sus muchas contribuciones y sugerencias en el desarrollo del protocolo de genética inversa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
