Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor
Bu makalede
Özet
Özet
Rotavirüsler, insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli ve kuş konak türlerinin genç şiddetli gastroenterit neden segmentli çift iplikli RNA virüslerin büyük ve gelişen bir nüfustur. Rotavirüs ters genetik sistemlerinin son gelişiyle, rotavirüs biyolojisini keşfetmek, mevcut rotavirüs aşılarını değiştirmek ve optimize etmek ve rotavirüs çok hedefli aşı vektörlerini geliştirmek için yönlendirilmiş mutagenezi kullanmak mümkün hale gelmiştir. Bu raporda, rekombinant rotavirüslerin etkin ve güvenilir bir şekilde geri kazanılmasına olanak tanıyan basitleştirilmiş bir ters genetik sistemini tanımlıyoruz. Sistem, tam uzunlukta rotavirüs (+)RNA'ları ve bir RNA kapama enzimini BHK hücrelerine kodlayan bir CMV vektörünü ifade eden T7 transkripsiyon vektörlerinin eş transfeksiyonuna dayanmaktadır. Rekombinant rotavirüsler MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücreleri overseeding tarafından yükseltilir, virüs büyümesi için son derece müsamahakar bir maymun böbrek hücre hattı. Bu raporda, genom segment7 'ye (NSP3) 2A çevirisel stop-restart elementi girişi yoluyla ayrı bir floresan muhabir proteini ifade eden rekombinant rotavirüsler imal etme yaklaşımını da açıklıyoruz. Bu yaklaşım, viral açık okuma çerçevelerinin herhangi birini silerek veya değiştirmekten kaçınarak, floresan proteini ifade ederken tamamen işlevsel viral proteinleri koruyan rekombinant rotavirüslerin üretimine olanak sağlar.
Giriş
Rotavirüsler bebeklerde ve küçük çocuklarda şiddetli gastroenteritin başlıca nedenleri olduğu gibi, diğer birçok memeli ve kuştürününgenç 1. Reoviridae ailesinin üyeleri olarak, rotavirüsler parçalı çift iplikçikli RNA (dsRNA) genomuna sahiptir. Genom segmentleri, üç konsantrik protein katmanından oluşan zarfsız bir ikozahedral virion içinde bulunur2. Genom segmentlerinin dizilimi ve filogenetik analizine dayanarak dokuz rotavirüs türü (A−D, F−J)tanımlanmıştır 3. Rotavirüs türleri A oluşan bu suşları insan hastalığının büyük çoğunluğu sorumludur4. Son on yılda başl....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Medya hazırlama ve hücre kültürü bakımı
- T7 RNA polimeraz (BHK-T7) ve Afrika yeşil maymun böbrek MA104 hücreleri ifade bebek hamster böbrek hücreleri edinin.
NOT: BHK-T7 (veya BSR-T7) hücreleri ticari olarak mevcut değildir, ancak RNA virüs biyolojisi incelemek için ters genetik kullanan laboratuvarların ortak bir hücre hattıdır. Bu protokolde kullanılan BHK-T7 hücre hattı Dr Ursula J. Buchholz (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD), orijinal BHK hücre hattı t7 RNA polimeraz29ifade bir co-geliştirici elde edilmiştir. MA104 hücreleri Avrupa Kimlik Doğrulamalı Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (ECACC) ve American Type Cultu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu makalede açıklanan ters genetik protokolü birden fazla farklı adımda devam eder: (1) BHK-T7 hücrelerinin rotavirüs pT7 transkripsiyon vektörleri ve pCMV/NP868R ekspresyonu plazmidi ile birlikte transfeksiyonu, (2) MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücrelerinin overseeding, (3) BHK-T7/MA104 hücreleri lysates bulunan rekombinant virüslerin amplifikasyon ma104 hücreleri kullanarak, ve (4) MA104 hücreleri kullanarak rekombinant virüsün plak izolasyonu(Şekil 2). Bizim elimizde protokol ve.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Laboratuvarımızda, rekombinant SA11 rotavirüsleri üretmek için burada tanımlanan ters genetik protokolüne rutin olarak güveniyoruz. Bu yaklaşımla, moleküler biyoloji teknikleri konusunda çok az deneyimi olan veya rotavirüslerle çalışan bireyler ilk denemelerinde bile rekombinant virüsleri kurtarırlar. Bu protokolü takip eden 100'e yakın rekombinant virüs ürettik, yabancı proteinleri (örneğin, FP'leri) ifade etmek için yeniden tasarlanmış genomlara sahip olanlar ve dizi eklemeleri, silmeler ve nokta mutasyonları içeren ge.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH'nin R03 AI131072 ve R21 AI144881, Indiana Üniversitesi Start-Up Finansmanı ve Lawrence M. Blatt Vakfı tarafından desteklenmiştir. IU Rotahoosier laboratuvarı üyelerine, Ulrich Desselberger'e ve Guido Papa'ya ters genetik protokolünün geliştirilmesine yaptıkları birçok katkı ve öneri için teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Bebek Hamster Böbrek - T7 RdRP (BHK-T7) Hücreleri | İletişim: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad %8-16 Tris-Glisin Poliakrilamid Mini-Jel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometre AutoT4 canlı hücre sayacı | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Jel Görüntüleme Sistemi | Bio-Rad | ||
| Kloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Gelişmiş Kemilüminesans (ECL) Substrat | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Yetkili E.coli DH5alpha Bakteriler | Lucigen | 60602-2 | |
| Komple Proteaz İnhibitörü | Pierce | A32965 | |
| Tek Kullanımlık Transfer Pipetleri, Ultra İnce Genişletilmiş Uçlar | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Kalite Biyolojik | 115-073-101 | |
| Etanol, Mutlak (200 kanıt) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Etidyum Bromür Çözeltisi (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Sığır Serumu (FBS), Isı ile İnaktive | Edilmiş Corning | 35-011-CV | |
| Bayrak M2 Antikoru, Fare Monoklonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plazmid Midiprep Kiti | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | Düşük arka planlı DMEM floresan |
| Glasgow Minimal Esansiyel Orta (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Keçi Anti-Tavşan IgG, Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) Konjuge | Hücre Sinyalizasyon Teknolojisi | 7074S | |
| Kobay Anti-NSP3 Antiserum | Patton laboratuvar | lot 55068 | |
| Gine Domuzu Anti-VP6 Antierum | Patton laboratuvar | lot 53963 | |
| At Anti-Gine Domuzu IgG, Yaban Turpu Peroksidaz (HRP) Konjuge | KPL | 5220-0366 | |
| At Anti-Fare IgG, Yaban Turpu Eroksidaz (HRP) Konjuge | Hücre Sinyal Teknolojisi | 7076S | |
| iNtRON Biyoteknoloji e-Myco Mycoplasma PCR Tespit Kiti | JH Science | 25235 | |
| İzopropil alkol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamin Çözeltisi ( 100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Tozu (Miller's LB Agar) | RPI araştırma ürünleri | L24020-2000.0 | |
| Orta 199 (M199) Kültür Ortamı | Hyclone Sh30253.01 | ||
| Minimal Esansiyel Orta -Eagle Joklik'in Forumu (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Maymun Böbreği (MA104) Hücreleri | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop Bir Spektrofotometre | ThermoScientific | ||
| Nötr Kırmızı Çözelti (%0,33) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex %10 Tris-Glisin Poliakrilamid Mini-Jel | İnvitrojen | XP00102BOX | |
| Nükleaz İçermeyen Moleküler Biyoloji Sınıfı Su | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Jel ve PCR Temizleme Kiti | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Azaltılmış Serum Ortamı | Gibco | 31985-070 | |
| Pelet havaneli (RNaz içermez, tek kullanımlık) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS), 10x | Fisher Biyoreaktifleri | BP399-20 | |
| Domuz Tripsini, Tip IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plazmid Miniprep Sistemi | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plazmid Maxi Kiti | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plazmid Midi Kiti | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kiti | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transkripsiyon Vektörleri | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7 / NSP3 Floresan Proteinleri İfade Eden Transkripsiyon Vektörleri | İletişim: jtpatton@iu.edu | ||
| Jel elektroforezi için | SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | Plak tahlili için |
| Üst Simge III Tek Adımlı RT-PCR kiti | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitroselüloz Transfer Kiti | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer Sistemi | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfeksiyon Reaktifi | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glisin-SDS Jel Çalıştırma Tamponu (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Ekstraksiyon Reaktifi | Ambion | 15596026 | |
| Tripan mavisi | Corning | 25-900-CI | |
| Tripsin (% 0.05) -EDTA (% 0.1) Hücre Ayrışma | Çözeltisi Kalite Biyolojik | 118-087-721 | |
| Triptoz Fosfat Suyu | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF çözücü | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Floresan Canlı Hücre Görüntüleyici | Bio-Rad |
Kaynaklar
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
