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方法文章

实验性自身免疫性脑脊髓炎期间中枢神经系统淋巴细胞浸润的流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/61050

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2020年11月17日

 ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine Research Center, Ruijin Hospital North, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 2Department of Microbiology and Immunology, Tongji University School of Medicine, 3Shanghai Institute of Immunology, Shanghai Key Laboratory for Tumor Microenvironment and Inflammation, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

本文内容

摘要

本文提供了一种在小鼠中诱导主动实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案。同时介绍了一种分离和表征中枢神经系统（CNS）中浸润性淋巴细胞的方法，以展示淋巴细胞在CNS自身免疫性疾病发生过程中的作用。

摘要

多发性硬化症（MS）是一种由环境因素与易感遗传背景共同作用引起的中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究该病发病机制中广泛使用的典型疾病模型，其中针对髓鞘抗原特异性的T淋巴细胞在中枢神经系统内引发炎症反应。评估中枢神经系统内的淋巴细胞如何调控疾病的发展具有重要意义。然而，由于从脑组织中分离和检测浸润性淋巴细胞存在技术困难，目前可用于测定中枢神经系统内浸润淋巴细胞数量和质量的方法十分有限。本文提供了一种有效的实验方案，可用于中枢神经系统中浸润性淋巴细胞的分离、鉴定与特征分析，有助于深入理解淋巴细胞在中枢神经系统自身免疫性疾病发展过程中的作用机制。

引言

多发性硬化症（MS）是一种中枢神经系统的慢性脱髓鞘疾病，全球约有250万人受其影响，目前尚无治愈方法1。该病也被认为是一种自身免疫性疾病，其中针对髓鞘抗原特异性的T淋巴细胞引发炎症反应，导致中枢神经系统出现脱髓鞘和轴突损伤2。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）被广泛用于研究MS的致病机制，是中枢神经系统中经典的自身免疫性脱髓鞘疾病模型3。EAE的诱导方法有两种：一种是通过用髓鞘成分免疫动物来主动诱导EAE，另一种是通过将致脑炎性T细胞转移至受体动物体内进行过继转移诱导2,4,5。不同品系动物对EAE的易感性存在差异6。在C57BL/6小鼠中，髓鞘寡突胶质细胞糖蛋白（MOG）35–55免疫攻击可诱导出单相性疾病，伴有广泛的中枢神经系统脱髓鞘和炎症，这一模型常用于基因靶向小鼠的相关实验7。

髓鞘特异性反应性T细胞的产生是实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）发生和发展的必要条件，也是EAE和多发性硬化症（MS）共有的免疫学标志。活化的自身反应性T淋巴细胞穿过血脑屏障（BBB）进入健康的中枢神经系统（CNS），从而引发EAE。当遇到MOG 35–55抗原时，这些T淋巴细胞诱导炎症反应，并促使效应细胞募集至中枢神经系统，导致脱髓鞘和轴突破坏8,9。在EAE模型中，有充分证据表明，神经抗原特异性的CD4+ T细胞能够启动并维持神经炎症及病理过程3,10。根据其主要分泌的细胞因子，CD4+ T淋巴细胞被分为不同的亚群：Th1（以产生干扰素-γ为特征）、Th2（以产生白细胞介素4为特征）和Th17（以产生白细胞介素17为特征）。目前认为，Th1和Th17细胞通过分泌效应性细胞因子IFN-γ和IL-17，在EAE和MS的炎性脱髓鞘过程中发挥诱导、维持和调控作用，这些细胞因子能够激活巨噬细胞，并募集中性粒细胞至炎症部位，从而加速病灶形成11。

由于自身反应性T细胞可穿过血脑屏障（BBB）进入中枢神经系统（CNS），并在多发性硬化症（MS）和实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中诱导疾病发生，因此分析CNS中的T细胞极为重要。然而，目前针对从中枢神经系统分离淋巴细胞的成熟方案非常有限12。因此，本研究建立了一种优化方法，用于从脑组织中分离单核细胞，并通过CD45、CD11b、CD3、CD4、INF-γ和IL-17等标记物对T淋巴细胞进行流式细胞术分析。该方法采用MOG35–55抗原联合分枝结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis）H37 Ra佐剂及百日咳毒素工作液（PTX），在小鼠中诱导建立EAE主动免疫模型；随后通过机械分离法和密度梯度离心法分离CNS单核细胞；最后采用优化的流式细胞术设门策略，通过多标记染色鉴定脑组织中的T淋巴细胞及其亚群。

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方案

本文所述所有方法均已获得上海交通大学基础医学院动物伦理委员会的批准。

1. 材料准备

  1. 使用MOG35–55的MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK序列从商业来源获取冻干肽。确保肽的纯度>95%。用磷酸盐缓冲液（PBS）配制10 mg/mL MOG储存液，并于-20 °C保存。
  2. 通过将一管100 mg的M. tuberculosis H37 Ra加入25 mL完全弗氏佐剂（CFA）中并混匀，配制4 mg/mL的M. tuberculosis H37 Ra储存液。将储存液于-20 °C保存。
  3. 将50 μg百日咳毒素（PTX）加入50 mL PBS中，配制1 ng/μL的百日咳毒素工作液（PTX）。工作液于-20 °C保存。
  4. 将所有抗体（即FITC标记的抗小鼠CD3、PE/Cy7标记的抗小鼠CD4、PerCP/Cy5.5标记的抗小鼠CD11b、Alexa Fluor700标记的抗小鼠CD45.2、PE标记的抗小鼠IL-17A以及APC标记的抗小鼠IFN-γ）于4 °C保存。
  5. 向500 mL PBS中加入2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）和1%胎牛血清（FBS），配制流式细胞术染色缓冲液（FCS缓冲液）。

2. C57BL/6小鼠的饲养

  1. 使用 8–12 周龄的雌性 C57BL/6 小鼠。
  2. 在注射前至少将 C57BL/6J 小鼠适应性饲养 7 天。
  3. 将小鼠饲养在恒温恒湿、12 小时光照/12 小时黑暗循环的无病原体动物设施中，并自由提供饮水和标准颗粒饲料。

3. C57BL/6 小鼠的免疫

  1. 将所有储存液在室温（RT）下静置15分钟，以确保充分再水化。
  2. 取300 μL MOG肽储存液，加入700 μL PBS稀释，配制为3 mg/mL的工作液。
  3. 分别取1 mL M. tuberculosis H37 Ra储存液和1 mL MOG35–55肽工作液置于两个10 mL注射器中，使用四通旋塞至少乳化10分钟。注射前需确保完全乳化。
  4. 在EAE症状高峰期，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
  5. 使用1 mL注射器，在背部靠近颈部的两个位点皮下注射每只小鼠100 μL MOG 35–55/CFA乳剂（300 µg/200 μL）。对照组小鼠则皮下注射200 μL PBS。
  6. 在免疫当天（第0天）和免疫后第2天（PI），每只小鼠腹腔注射200 μL浓度为1 ng/μL的PTX工作液。对照组小鼠腹腔 注射200 μL PBS。
  7. 将小鼠转移至带有加热垫的饲养笼中。
  8. 注射后每天以盲法评估并记录所有小鼠的神经功能症状（见表111,13）。若评分超过4级，应实施安乐死。
  9. 记录疾病过程中体重的变化。这是EAE模型中评估疾病活动度的重要附加指标11,13。
  10. 将每只小鼠出现临床症状的第一天相加，再除以该组小鼠数量，所得结果即为发病时间。将每只小鼠达到最高EAE评分的第一天相加，再除以该组小鼠数量，所得结果即为峰值时间。

4. 脑组织单细胞悬液的制备

  1. 将密度梯度介质与 PBS 按 9:1 的比例在 15 mL 圆底离心管中稀释，得到终浓度为 100% 的溶液。
  2. 在EAE症状高峰期，通过腹腔注射1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉小鼠，并经心脏灌注20 mL无菌冰冻PBS。操作时使用20 mL注射器将PBS缓慢而稳定地注入左心室，同时切开右心房。
  3. 从鼻部向颈部小心切开颅骨，然后将脑组织从颅腔中取出，放入含有10 mL RPMI培养基的50 mL锥形管中。充分混匀以去除黏附的红细胞。随后用移液器吸除上清液，并加入10 mL RPMI培养基。
  4. 将脑组织和培养基放入100 mm培养皿中，用剃刀片仔细切碎。
  5. 用干净的移液管将6 mL样品从培养皿转移至预冷的7 mL烧结玻璃匀浆器中。避免在移液管中残留大量组织，少量残留不可避免。
  6. 使用研磨器研磨脑组织 "松散" 先使用研杵的推杆，然后使用 "紧密" 将悬液混匀直至均匀，倒入预冷的15 mL锥形管中，置于冰上保存。
  7. 所有样品匀浆后，估算体积，用RPMI将体积调整至7 mL。取3 mL预冷的100%基底膜基质加入预冷的15 mL圆锥形离心管中，再加入7 mL脑组织匀浆液，配制成终浓度为30%的密度梯度介质。轻轻倒置混匀数次，禁止涡旋振荡。
  8. 为确保形成清晰的界面，使用3 mL移液管缓慢而小心地加入1 mL含RPMI的70%下层密度梯度介质。
  9. 以 800 x g 在 4 °C 下仅离心 20 分钟。将加速度设为 1，减速度设为 0。离心后，小心吸除上层液相的绝大部分，注意彻底去除顶部的髓鞘图1).
  10. 将界面转移至新的15 mL离心管中，用RPMI调整体积至10 mL。
  11. 以 500 x g 离心 g 离心10分钟。离心后，吸除上清液。将沉淀重悬于约200 μL流式细胞术染色（FSC）缓冲液中。沉淀即可用于FACS染色。

5. 脑组织来源单细胞的流式细胞术分析

  1. 使用血细胞计数板和显微镜对细胞进行计数。取10 μL细胞悬液与10 μL台盼蓝混合，充分混匀后取10 μL加入血细胞计数板中计数细胞。然后在倒置显微镜（例如Olympus倒置显微镜）下计算每微升中的活细胞数量。
  2. 将约2 × 106个细胞分装至96孔板的单个孔中，培养基为RPMI。
  3. 向各孔中加入500倍稀释的细胞刺激混合物（cell stimulation cocktail）以及蛋白转运抑制剂。
  4. 将培养板置于37 °C培养箱中孵育4小时。
  5. 在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液，并将细胞重悬于100 μL FCS缓冲液中。
  6. 染色前，在4 °C条件下用抗小鼠CD16/CD32 Fc阻断抗体（1:33稀释）预孵育细胞10分钟，以阻断非特异性Fc介导的结合。
  7. 无需洗涤，直接进行细胞表面标志物染色。加入抗小鼠CD45.2（1:200）、抗小鼠CD11b（1:200）、抗小鼠CD3（1:200）和抗小鼠CD4（1:200）抗体。
    注意：为确定阳性与阴性门控范围，应对每种荧光染料设置荧光减一对照（FMO）及同型对照抗体染色。
  8. 在4 °C或冰上孵育至少30分钟，避光。
  9. 用FCS缓冲液洗涤细胞，微孔板每孔加入200 μL。在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  10. 每孔加入200 μL胞内（IC）固定缓冲液以固定细胞，确保细胞在溶液中完全重悬。
  11. 在室温下孵育30–60分钟，避光。
  12. 在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  13. 每孔加入200 μL 1×通透缓冲液，并在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  14. 将沉淀物重悬于残留液体中，并用1×通透缓冲液调整体积至约100 μL。
  15. 加入抗小鼠IL-17A（1:200）和抗小鼠IFN-γ（1:200）抗体，用于检测胞内抗原。
  16. 在4 °C条件下孵育至少30分钟，避光。
  17. 每孔加入100 μL 1×通透缓冲液，并在室温下以400 × g离心5分钟，弃去上清液。
  18. 将染色后的细胞重悬于100 μL流式细胞术染色缓冲液中。
  19. 通过流式细胞术进行分析。
    注意：根据仪器制造商的建议，调整流式细胞仪的激光参数和补偿设置，将样品上机检测并记录所有事件。

6. 数据分析

  1. 使用FSC-A与FSC-H以及SSC-A与SSC-H圈定单细胞群体。
  2. 根据细胞大小，利用FSC-A和SSC-A圈定活细胞。
  3. 接下来，通过圈选CD45+ CD11b-细胞来鉴定白细胞，并排除单核细胞。
  4. 然后，通过圈选CD3+CD4+细胞来鉴定CD4 T淋巴细胞。
  5. 最后，分别通过圈选IFN-γ+细胞和IL-17+细胞来鉴定Th1和Th17亚群，并利用同型对照和荧光减一对照（FMO）确定阳性与阴性细胞群。

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结果

免疫C57BL/6小鼠后，所有小鼠每日均称重，并进行神经系统体征的检查与评分。典型的EAE临床病程应呈现如图2A所示的疾病曲线，以及如图2B所示的小鼠体重变化。使用MOG35-55免疫的C57BL/6小鼠通常在免疫后第10–12天左右开始出现疾病症状，并在第15–21天左右达到疾病高峰（图2A）。体重变化是EAE模型中的一个重要指标。在疾病发作前，免疫小鼠的体重逐渐增加，随后通常随着疾病症状的加重而下降。在EAE高峰期，小鼠的体重也达到最低值（图2B）。随后，随着临床症状的减轻，体重略有回升。然而，小鼠通常无法完全恢复。C57BL/6小鼠在接受MOG35–55攻击后会发展为单相慢性疾病病理过程（图2A）。

EAE 的临床严重程度与自身反应性 T 细胞的活化直接相关

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讨论

本研究介绍了一种在C57BL/6小鼠中使用MOG35-55诱导并监测实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的实验方案，该品系小鼠被视为多发性硬化症（MS）典型的神经免疫学实验动物模型。根据研究目的，可通过选用不同小鼠品系或不同的诱导蛋白来建立EAE模型。例如，在SJL小鼠中使用PLP139–151肽段可诱导出复发-缓解型EAE病程，特别适用于评估治疗手段对疾病复发的干预效果15此处所述的实验方案也可应用于其他EAE方案7在此模型中，C57BL/6小鼠经MOG35–55多肽免疫后会发展为单相性疾病。采用5分制评分系统评估实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的严重程度。尽管目前已有多种评分系统用于评估疾病严重性，其评分范围从0–3分或0–10分不等7,16,17这些结果表明，5分制评分系统能够确定组间疾病评分的统计学显著差异，而其他EAE评分系统并未带来明显改进。

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本研究获得国家自然科学基金（ZJ，31570921；LS，81571533）、上海市卫生和计划生育委员会（ZJ，201540206）以及瑞金医院北院科研基金（ZJ，2017ZX01）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Alexa Fluor700 抗小鼠 CD45.2eBioscience56-0454-82
抗小鼠 CD16/CD32 Fc 封闭抗体BioLegend101302
APC 抗小鼠 IFN-γeBioscience17-7311-82
BD LSRFortessa X-20BD
邓氏匀浆器Wheaton353107542
eBioscience 细胞刺激混合液（含蛋白转运抑制剂）（500倍浓缩）eBioscience00-4975-03
eBioscience 细胞内固定 && 通透缓冲液套装eBioscience88-8824-00
FITC 标记的抗小鼠 CD3 抗体BioLegend100203
FITC 大鼠 IgG2b， κ 同型对照抗体BioLegend400605
完全弗氏佐剂（CFA）Sigma-AldrichF5881
小鼠 IgG2a κ 同型对照 (eBM2a)，Alexa Fluor 700，eBioscienceeBioscience56-4724-80
结核分枝杆菌 H37 RaDifco Laboratories231141
PE 抗小鼠 IL-17AeBioscience12-7177-81
PE/Cy7 抗小鼠 CD4BioLegend100422
PE/Cy7 大鼠 IgG2b κ 同型对照抗体BioLegend400617
Percoll通用电气17-0891-01
PerCP/Cy5.5 抗小鼠 CD11bBioLegend101228
PerCP/Cy5.5 大鼠 IgG2b κ 同型对照抗体BioLegend400631
百日咳毒素（PTX）Sigma-AldrichP-2980
大鼠IgG1 κ同型对照（eBRG1），APC，eBioscienceeBioscience17-4301-82
大鼠IgG2a κ同型对照（eBR2a），PE，eBioscienceeBioscience12-4321-80
大鼠 MOG35–55 个肽段Biosynth InternationalMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK

参考文献

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