Immunfärbung von Drosophila-Hoden für die konfokale 3D-Analyse großer Spermatozyten

Zusammenfassung

Wir präsentieren hier ein verbessertes Protokoll für die Ganzkörperpräparation und Immunfärbung von Drosophila-Hoden, das für die konfokale Mikroskopie geeignet ist und auch eine reproduzierbare und zuverlässige Markierung ermöglicht. Wir veranschaulichen dieses Protokoll durch 3D-Darstellung und Quantifizierung von Kolokalisierungsexperimenten an den großen S4-S5-Spermatozyten.

Zusammenfassung

Drosophila-Hoden sind ein leistungsfähiges Modellsystem zur Untersuchung biologischer Prozesse, einschließlich Stammzellbiologie, Kernarchitektur, Meiose und Spermienentwicklung. Die Immunmarkierung des gesamten Drosophila-Hodens ist jedoch oft mit einer signifikanten Ungleichmäßigkeit der Färbung aufgrund der Antikörperpenetration verbunden. Gequetschte Präparate überwinden das Problem nur teilweise, da sie die 3D-Qualität der Analysen verringern. Hierin beschreiben wir ein Whole-Mount-Protokoll mit NP40 und Heptan während der Fixierung zusammen mit der Immunmarkierung in flüssigen Medien. Es bewahrt das für die konfokale Mikroskopie geeignete Volumen zusammen mit einer reproduzierbaren und zuverlässigen Markierung. Wir zeigen verschiedene Beispiele für die 3D-Rekonstitution von Spermatozytenkernen aus konfokalen Abschnitten. Die Reproduzierbarkeit von Intra- und Inter-Hoden ermöglicht die 3D-Quantifizierung und den Vergleich der Fluoreszenz zwischen einzelnen Zellen verschiedener Genotypen. Wir verwendeten verschiedene Komponenten der intranukleären MINT-Struktur (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) sowie zwei Komponenten, die mit dem Kernporenkomplex verbunden sind, um dieses Protokoll und seine Anwendungen auf den größten Zellen des Hodens, den S4-S5-Spermatozyten, zu veranschaulichen.

Einleitung

Drosophila-Hoden sind ein wertvolles Modell für das Studium der nuklearen Architektur. In mitotischen Spermatogonienzellen ist das Kernvolumen weitgehend mit Chromatin besetzt. Diese Zellen durchlaufen vier Teilungsrunden und produzieren eine Zyste von 16 primären Spermatozyten. In den nächsten Tagen durchlaufen die Spermatozyten 6 Entwicklungsstadien (S1-S6), wobei das Volumen stark zunimmt, ungefähr 20-fach^1,2. Sie verändern auch ihre Kernmorphologie. Der Umriss des Kerns, der durch das Lamin Dm0 offenbart wird, wird unregelmäßig und zeigt tiefe Invaginationen^1,

Protokoll

1. Drosophila Hodensammlung

HINWEIS: Junge Männchen (0-15 h nach der Eklosion) sind notwendig, um diploide Keimzellen (dh Spermatogonie und Spermatozyten) zu untersuchen.

1. Wählen Sie junge Fliegen so weit wie möglich aus, um Störungen durch die Entwicklung von Spermatiden zu minimieren.
2. Anästhesieren Sie Fliegen durch kurze Exposition gegenüber Kohlendioxid und Übertragen auf ein Fliegenpad^14,15.
3. Unter einem Seziermikroskop (10-fache Vergrößerung) den Kopf mit einer Zette entfernen.
4. 5 bis 10 enthauptete Fliegen auf 100 μL Ringer-Puffer (183 mM ....

Ergebnisse

Das Haupthindernis für eine angemessene Färbung der Drosophila-Hoden ist die begrenzte Penetrabilität von Antikörpern, die teilweise durch die Verwendung von gequetschten Präparaten gelöst wurde, aber auf Kosten einer Einschränkung der 3D-Analysen (z. B. 3D-Darstellung oder Maß der Kolokalisierung). Das Verfahren ermöglicht eine einheitliche Kennzeichnung und bewahrt das Volumen aller Zellen des Hodens. Hier haben wir die Darstellung der Methode auf die 3D-Darstellung von S4-S5-Spermatozyten konzentriert, da diese die gr.......

Diskussion

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur erfolgreichen Immunmarkierung von drosophila-Hoden bei Erwachsenen. Wie in anderen Verfahren berichtet, müssen junge Männer verwendet werden (wir haben sogar das Alter auf weniger als 20 Stunden nach der Eklosion verkürzt), um das Vorhandensein von sich entwickelnden Spermien zu minimieren, die die Spermatozyten behindern könnten. Die Dissektion sollte schnell sein und die Antikörperverdünnung muss angepasst werden, um das Signal-Rausch-Verhältnis^21,

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Drosophila srains
ketelGFP y; ketelGFP/y+CyO			Geschenk von A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, Frankreich)
Mad1-GFP			J Cell Sci. 15. Mai 2011; 124 (Teil 10): 1664-71.
Mtor RNAi	VDRC	ID 110218	Vienna Drosophila RNAi Center
Materials
DAPI	Thermo	D1306	Stammlösung muss in H2O
Dumont # 5 Feinforseps hergestellt werden	Fine Science Tools
MBP Pipettenspitzen mit breiter Bohrung	Fisherbrand	11917744	Spitze mit großer Öffnung
Thermo Scientific 0,2 mL Einzelröhrchen	Thermo	AB-0620
2 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Sigma	T3531-200EA	Silikonisierte 2ml Tube
Citifluor AF1	Citifluor	AF1
Dakopen	Sigma	Z377821-1EA
Normales Ziegenserum (NGS)	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyd 4%	Sigma	P6148-500G	Paraformaldehyd (4%) gelöst in PBS 1X ; aliquot um 600 ml
PBS 1X	Thermo	14190094	DPBS, kein Calcium, kein Magnesium
0,1% (0,2 oder 0,3%) PBS-T			PBS 1X  mit 0,1% (0,2 % bzw. 0,3%) Triton X-100
Triton X-100, für die Molekularbiologie	Sigma	T8787
Antikörper
GFP Booster	Chromotek	gba488	1/200
Maus anti-Mtor			1/40 Geschenk von J. Johansen, Iowa State University
Ratte anti-Nup62			1/200 Geschenk von H. Ohkura (University of Edinburgh, UK
Meerschweinchen anti-Ulp1			1/200 Geschenk von C. P. Verrijzer, Erasmus Universität, Rotterdam
Rabbit Anti-Raf2			1/200 Geschenk von C. P. Verrijzer, Erasmus Universität, Rotterdam
DyLight konjugierte Serie			1/500 Esel Anti-(Meerschweinchen, Maus,   Kaninchen oder Ratte) als zweite Antikörper

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