Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het cerebellum speelt een cruciale rol in het onderhoud van evenwicht en motorische coördinatie, en een functioneel defect in verschillende cerebellar neuronen kan leiden tot cerebellar disfunctie. Het grootste deel van de huidige kennis over ziekte-gerelateerde neuronale fenotypes is gebaseerd op postmortem weefsels, waardoor het begrijpen van de progressie van de ziekte en ontwikkeling moeilijk. Dierlijke modellen en vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt als modellen voor neurodegeneratieve aandoeningen. Ze vatten echter niet volledig de menselijke ziekte samen. Door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC's) hebben een groot potentieel voor ziektemodellering en vormen een waardevolle bron voor regeneratieve benaderingen. In de afgelopen jaren verbeterde de generatie van cerebrale organoïden uit door patiënten afgeleide iPSC's de vooruitzichten voor neurodegeneratieve ziektemodellering. Echter, protocollen die grote aantallen organoïden produceren en een hoge opbrengst van volwassen neuronen in 3D-cultuursystemen ontbreken. Het gepresenteerde protocol is een nieuwe aanpak voor reproduceerbare en schaalbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide organoïden onder chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van schaalbare bioreactoren voor eenmalig gebruik, waarin organoïden een cerebellaire identiteit verwerven. De gegenereerde organoïden worden gekenmerkt door de expressie van specifieke markers op zowel mRNA- als eiwitniveau. De analyse van specifieke groepen eiwitten maakt de detectie van verschillende cerebellar celpopulaties mogelijk, waarvan de lokalisatie belangrijk is voor de evaluatie van de organoïde structuur. Organoïde cryosectioning en verdere immunostaining van organoïde plakjes worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke cerebellar celpopulaties en hun ruimtelijke organisatie te evalueren.
Inleiding
De opkomst van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) is een uitstekend hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering, omdat deze cellen kunnen worden onderscheiden in de meeste cellijnen van het menselijk lichaam1,2. Sinds hun ontdekking is psc-differentiatie met behulp van verschillende benaderingen gemeld om verschillende ziekten te modelleren, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen3,4,5,6.
Onlangs zijn er meldingen van 3D-cultur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Doorgeven en onderhouden van menselijke IPSCs in monolaagcultuur
- Bereiding van platen
- Ontdooi de keldermembraanmatrix (zie Tabel van Materialen)voorraad bij 4 °C en bereid 60 μL aliquots voor. Vries de aliquots op -20 °C.
- Om de putten van een 6 putplaat te coaten, ontdooi je een aliquot van de keldermembraanmatrix op ijs. Eenmaal ontdooid voeg 60 μL toe aan 6 mL DMEM-F12. Voorzichtig resuspend door pipetting op en neer.
- Voeg 1 mL verdunde keldermembraanmatrijsoplossing toe aan elke put van een 6 putplaat en broed gedurende ten minste 1 uur bij RT voordat u passeert of bewaar maximaal 1 week bij 4 °C.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het protocol werd geïnitieerd door celaggregatie te bevorderen met behulp van de 0,1 L bioreactoren (figuur 1A). Eencellige inenting van de iPSCs werd uitgevoerd, met 250.000 cellen/mL gezaaid in 60 mL van medium met een agitatiesnelheid van 27 rpm. Dit werd gedefinieerd als dag 0. Na 24 uur vormden de cellen efficiënt sferoïde-vormige aggregaten (dag 1, figuur 1B),en de morfologie werd goed onderhouden tot dag 5, met een geleidelijke toename in grootte, waaruit.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De behoefte aan grote celaantallen en gedefinieerde kweekomstandigheden om specifieke celtypen te genereren voor toepassingen voor geneesmiddelenscreening en regeneratieve geneeskunde heeft de ontwikkeling van schaalbare cultuursystemen aanstuurd. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen gemeld de schaalbare generatie van neurale voorouders en functionele neuronen32,33,34, het verstrekken van aanzienlijke vooruitgang i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Auteurs YH en SJ zijn medewerkers van PBS Biotech. De auteur BL is CEO en mede-oprichter van PBS Biotech, Inc. Deze samenwerkende auteurs namen deel aan de ontwikkeling van de bioreactoren die in het manuscript werden gebruikt. Dit verandert niets aan de naleving van alle beleidsmaatregelen van het tijdschrift voor het delen van gegevens en materialen. Alle andere auteurs verklaren geen belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 door Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 naar T.P.S en PD/BD/128376/2017 naar D.E.S.N.), projecten medegefinancierd door FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) en FCT door subsidie PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 en CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Er werd ook financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie, onder het grant agreement nummer 739572— het Disc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrine | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
Referenties
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
