פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.
המוח הקטן ממלא תפקיד קריטי בתחזוקה של איזון וקואורדינציה מוטורית, פגם תפקודי בנוירונים המוח שונים יכול לעורר תפקוד המוח הקטן. רוב הידע הנוכחי על פנוטיפים עצביים הקשורים למחלות מבוסס על רקמות שלאחר המוות, מה שהופך את ההבנה של התקדמות המחלה ופיתוח קשה. מודלים של בעלי חיים וקווי תאים מונצחים שימשו גם כמודלים להפרעות ניווניות. עם זאת, הם אינם לגמרי לסיכום מחלות אנושיות. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs) יש פוטנציאל גדול עבור מידול מחלות ולספק מקור יקר ערך עבור גישות רגנרטיביות. בשנים האחרונות, הדור של אורגנואידים מוחיים מ-iPSCs הנגזרים ממטופל שיפר את הסיכויים למודלים של מחלות ניווניות. עם זאת, פרוטוקולים המייצרים מספר גדול של אורגנואידים ותשואה גבוהה של נוירונים בוגרים במערכות תרבות 3D חסרים. הפרוטוקול שהוצג הוא גישה חדשה לדור רפרודוק ומדרגי של אורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC בתנאים המוגדרים כימית באמצעות ביו-כוערים חד-פעמיות מדרגיים, שבהם אורגנואידים רוכשים זהות מוחית. האורבנואידים שנוצרו מאופיינים בביטוי של סמנים ספציפיים הן ברמת mRNA והן ברמת החלבון. הניתוח של קבוצות ספציפיות של חלבונים מאפשר זיהוי של אוכלוסיות שונות של תאים המוח הקטן, אשר התיור חשוב להערכת מבנה אורגנואיד. cryosectioning אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד משמשים כדי להעריך את הנוכחות של אוכלוסיות ספציפיות של תאים המוח הקטן והארגון המרחבי שלהם.
הופעתם של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (PSCs) מייצגת כלי מצוין לרפואה רגנרטיבית ומידול מחלות, כי תאים אלה יכולים להיות מובדילים לתוך רוב תוחוני התא של גוףהאדם 1,,2. מאז הגילוי שלהם, פידול PSC באמצעות גישות מגוונות דווח המודל מחלות שונות, כולל הפרעות ניווניות3,,4,,5,6.
לאחרונה, היו דיווחים על תרבויות 3D נגזר PSCs דומה מבנים מוחיים אנושיים; אלה נקראים אורגנואידים במוח3,,7,,8. הדור של מבנים אלה הן PSCs בריא וסבלני מספק הזדמנות רבת ערך כדי מודל התפתחות אנושית והפרעות נוירו-התפתחותיות. עם זאת, השיטות המשמשות ליצירת מבנים מוחיים מאורגנים היטב אלה קשה להגיש בקשה לייצור בקנה מידה גדול שלהם. כדי לייצר מבנים גדולים מספיק כדי לתמצת מורפוגנזה רקמה ללא נמק בתוך organoids, פרוטוקולים להסתמך על המחויבות העצבית הראשונית בתנאים סטטיים, ואחריו אנקפולציה הידרוג’לים ותרבות עוקבותבמערכות דינמיות 3. עם זאת, גישות כאלה עשויות להגביל את קנה המידה הפוטנציאלי של ייצור אורגנואידים. למרות נעשו מאמצים לכוון את בידול PSC לאזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, סטריאטל, המוח האמצעי, ונוירונים חוט השדרה9,10,11,12, הדור של אזורי מוח ספציפיים בתנאים דינמיים הוא עדיין אתגר. בפרט, הדור של נוירונים המוח הקטן בוגר במבנים 3D עדיין לא תואר. Muguruma ואח ‘. חלוץ הדור של תנאי תרבות כי סיכוםמוקדם המוח הקטן פיתוח 13 ולאחרונה דיווח פרוטוקול המאפשר לתאי גזע עובריים אנושיים ליצור מבנה מקוטב המזכיר את המוח הקטן של השלישהראשון 7. עם זאת, התבגרות של נוירונים המוח הקטן במחקרים שדווחו דורש תנתק של אורגנואידים, מיון של נבונות המוח הקטן, וcoculture עם תאי ההזנהבמערכת תרבות מונו-שכבתית 7,14,15,16. לכן, הדור הניתן לשחזור של אורגנואידים המוח הקטן הרצוי עבור מידול מחלות בתנאים מוגדרים הוא עדיין אתגר הקשורים תרבות ושונות מקור מאכיל.
פרוטוקול זה מציג תנאי תרבות אופטימליים להרחבת תלת-מיתד ובידול יעיל של PSCs אנושיים לנוירונים המוחליים באמצעות ביו-סיבה של גלגל אנכי חד-ספרתי (ראה טבלת חומרים למפרטים), הנקראים להלן ביו-כואבי החיים. ביו-גורם מצוידים במדחף אנכי גדול, אשר בשילוב עם תחתית בצורת U, לספק התפלגות גייה הומוגנית יותר בתוך כלי השיט, המאפשר עדין, ערבוב אחיד ומתלי חלקיקים עם מהירויות תסיסהמופחתת 17. עם מערכת זו, ניתן להשיג אגרגטים של תאים הנשלטים על-ידי צורה וגודל, דבר שחשוב להבדיל הומוגני ויעיל יותר. יתר על כן, מספר גדול יותר של אורגנואידים נגזר iPSC ניתן ליצור באופן פחות מייגע.
התכונה העיקרית של organoids, שהם מבנים רב תאיים 3D בדרך כלל נוצר מתאי גזע, הוא ארגון עצמי של סוגי תאים שונים שיוצרים צורות ספציפיות כמו אלה לראות מורפוגנזהאנושית 18,,19,20. לכן, מורפולוגיה אורגנואידית היא קריטריון חשוב שיש להעריך במהלך תהליך ההבחנה. Cryosectioning של אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד עם קבוצה ספציפית של נוגדנים לאפשר הדמיה מרחבית של סמנים מולקולריים לנתח התפשטות תאים, בידול, זהות אוכלוסיית התא, אפופטוזיס. עם פרוטוקול זה, על ידי קריוסות אורגנואידים חיסוניות, מחויבות עצבית יעילה ראשונית נצפתה על ידי היוםה-7 של בידול. במהלך בידול, מספר אוכלוסיות תאים עם זהות המוח הקטן נצפו. לאחר 35 ימים במערכת דינמית זו, neuroepithelium המוח הקטן מארגן לאורך ציר apicobasal, עם שכבה apical של פרוגניטורים משגשגים ונוירונים פוסט מיתוטיים הממוקמים בהתבססות. במהלך תהליך ההתבגרות, מימים 35-90 של בידול, ניתן לראות סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן, כולל תאי Purkinje (קלבינדין+), תאי גרגר (PAX6+/ MAP2+), תאי גולגי (Neurogranin+ ),תאי מברשת חד קוטביים (TBR2+), ונוירונים הקרנת גרעין המוח הקטן עמוק (TBR1+). כמו כן, כמות לא משמעותית של מוות תאים נצפתה באורגנואידים המוח הקטן שנוצר לאחר 90 ימים בתרבות.
במערכת זו, אורגנואידים הנגזרים על-ידי IPSC אנושיים מתבגרים לנוירונים המוח שונים ושורדים עד 3 חודשים ללא צורך בתחוך ומזון coculture, מתן מקור של נוירונים המוח הקטן האנושי עבור מידול מחלות.
הצורך במספרי תאים גדולים, כמו גם תנאי תרבות מוגדרים כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים עבור סינון תרופות ויישומי רפואה רגנרטיבית כבר נהיגה בפיתוח של מערכות תרבות מדרגית. בשנים האחרונות דיווחו מספר קבוצות על הדור המדרגי של תובנים עצבייםונוירונים פונקציונליים 32,33</sup…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל (UIDB/04565/2020 באמצעות Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, פרויקט N. 007317, PD/BD/105773/2014 ל-T.P.S ו-PD/BD/128376/2017 ל-D.E.S.N), פרויקטים במימון שיתוף של FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa פורטוגל 2020) ו-FCT באמצעות מענק PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ו-CEREBEX Generation של אורגנואידים המוח הקטן למענק מחקר אטקסיה LISBOA-01-0145-FEDER-029298. המימון התקבל גם מתכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, במסגרת הסכם המענק מספר 739572 – מרכז התגליות לרפואה רגנרטיבית ודיוקה H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.
3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
Accutase | A6964 – 500mL | Sigma | cell detachment medium |
Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 – 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
DAPI | 10236276001 | Sigma | |
Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
Glycine | MB014001 | NZYtech | |
Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
Insulin | 91077C | Sigma | |
iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
SB431542 | S4317 | Sigma | |
Sucrose | S7903 | Sigma | |
SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
Tween-20 | P1379 | Sigma | |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |