このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。
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この記事について
サマリー
要約
小脳はバランスと運動協調の維持において重要な役割を果たし、異なる小脳ニューロンの機能的欠陥は小脳機能障害を引き起こす可能性がある。疾患関連の神経細胞型に関する現在の知識のほとんどは、死後の組織に基づいており、疾患の進行と発症の理解が困難です。動物モデルおよび不死化細胞株は、神経変性疾患のモデルとしても使用されている。しかし、彼らは完全に人間の病気を再現しません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、疾患モデル化の可能性が大きく、再生アプローチの貴重な供給源となります。近年、患者由来のiPSCからの脳オルガノイドの生成は、神経変性疾患モデルの見通しを改善しました。しかし、3D培養系において多数のオルガノイドを産生し、成熟したニューロンの収量が高いプロトコルが欠けている。このプロトコルは、オルガノイドが小脳の同一性を獲得するスケーラブルな単一使用バイオリアクターを使用して、化学的に定義された条件下で、ヒトiPSC由来オルガノイドを再現可能でスケーラブルに生成するための新しいアプローチです。生成されたオルガノイドは、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で特異的なマーカーの発現によって特徴付けられる。タンパク質の特定のグループの分析は、その局在化がオルガノイド構造の評価に重要である異なる小脳細胞集団の検出を可能にします。オルガノイド凍結切除およびオルガノイドスライスのさらなる免疫染色は、特定の小脳細胞集団の存在およびそれらの空間組織を評価するために使用される。
概要
ヒト多能性幹細胞(PSC)の出現は、再生医療および疾患モデリングのための優れたツールを表しており、これらの細胞は人体11,2のほとんどの細胞系統に分化することができるからである。その発見以来、多様なアプローチを用いたPSC分化は、神経変性疾患33、4、5、64,5を含む異なる疾患を6モデル化することが報告されている。
近年、ヒトの脳構造に似たPSC由来の3D培養が報告されている。これらは脳オルガノイド33、7、87と呼ばれています。健康な、患者固有のPSCの両方からのこれらの構造の生成は、人間の発達および神経発達障害をモデル化する貴重な機会を提供する。しかし、これらのよく組織化された脳構造を生成するために使用される方法は、その大規模な生産に適用することは困難です。オルガノイド内部の壊死を伴わずに組織形態形成を再現するのに十....
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プロトコル
1. 単層培養におけるヒトiPSCの継ぎ手と維持
- プレートの準備
- 4 °Cで基部膜マトリックス( 材料表を参照)ストックを解凍し、60 μLアリコートを調製します。アリコートを-20°Cで凍らせます。
- 6ウェルプレートのウェルをコーティングするには、氷の上に基部膜マトリックスの1アリコートを解凍します。解凍すると、60 μL を 6 mL の DMEM-F12 に加えます。上下にピペットを入れ、穏やかに再中断します。
- 希釈した基質膜マトリックス溶液を6ウェルプレートの各ウェルに1mL添加し、RTで少なくとも1時間インキュベートしてから、4°Cで最大1週間保存します。
- EDTAによるiPSCコロニーの通過
- インキュベーター内の6ウェルプレートでiPSCを37°C、湿度95%、CO25%で維持します。
注: このプロトコルでは、3 つの異なる人間の iPSC ラインが使用されました: F002.1A.1321、ヒトエピソーム iPSC ライン (iPSC6.2)22、および市販の iPS-DF6-9-9T.B ( 資料表を参照) 。 - 合格する前に、保存されたプレート(ステップ1.1)を....
- インキュベーター内の6ウェルプレートでiPSCを37°C、湿度95%、CO25%で維持します。
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結果
プロトコルは、0.1 Lバイオリアクターを用いて細胞凝集を促進することによって開始された(図1A)。iPSCの単一細胞接種を行い、250,000個の細胞/mLを60mLの培地に播種し、撹拌速度は27rpmであった。これは 0 日として定義されました。24時間後、細胞は効率的にスフェロイド状の凝集体(1日目、図1B)を形成し、形態は5日目まで良好に維持され、徐々にサイズが増加し、時間の経過とともに凝集形態およびサイズにおいて高度な均質性を示した。(図1B)。顕微鏡による定量分析では、1日目による集合サイズの正規分布も明らかになった(図1C)。集合サイズは、異なる系統29,30,30に向かって細胞を区別するように求めることができる重要な物理的パラメータです。このため、効率的な神経
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ディスカッション
大規模な細胞数と、薬物スクリーニングおよび再生医療用途向けに特定の細胞タイプを生成するための定義された培養条件の必要性が、スケーラブルな培養システムの開発を推進してきました。近年、いくつかのグループは、神経前駆物質および機能的ニューロンのスケーラブルな生成を報告しています32,,33,,34,神経変性疾患の新しいモデルの開発に大きな進歩を提供.それにもかかわらず、胚発生のいくつかの重要な事象の再現はまだ欠けていて、そして長期間の懸濁液中での生成された機能ニューロンの維持は34を達成していない。ここでは、小脳の同一性を持つiPSC由来神経オルガノイドを生成し、動的培養における化学的に定義されたフィーダーフリー条件下での機能的小脳ニューロンへの成熟をさらに促進することができる動的3D培養システムを紹介します。
小脳分化を始める前に、ヒトのiPSCの品質を.......
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開示事項
著者YHとSJはPBSバイオテクノロジーの従業員です。著者BLは、PBSバイオテック社のCEO兼共同創設者です。これらの共同研究者は、原稿に使用されるバイオリアクターの開発に参加しました。これは、データと資料の共有に関するジャーナルのすべてのポリシーに対する著者の遵守を変更するものではありません。他のすべての著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
この作品は、フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)、ポルトガル(UIDB/04565/2020)がプログラム・オペラシオナル・リージョナル・デ・リスボア2020、プロジェクトN.007317によって支援されました。 PD/BD/105773/2014からT.P.SとPD/BD/128376/2017からD.E.S.N.へ、FEDER(PORリスボア2020)が共同出資するプロジェクト 2020)とFCTは、PAC精密リスボア-01-0145-FEDER-016394および運動失調研究のための小脳オルガノイドのCEREBEX世代を通じてLISBOA-01-0145-FEDER-029298を付与します。欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムからも資金が寄せられたのは、助成金協定番号739572(再生精密医療発見センターH2020-WIDESPREAD-01-2016-2017)の下で行われました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3MM紙 | WHA3030861メルク | ||
| アキュターゼ | A6964-500mL | シグマ | 細胞剥離培地 |
| 抗BARHL1抗体 | HPA004809 | アトラス抗体 | |
| 抗カルビンジンD-28k抗体 | CB28 | ポア | |
| 抗MAP2抗体 | M4403 | グマ | |
| 抗N-カドヘリン抗体 | 610921 | BD形質導入 | |
| 抗NESTIN抗体 | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 抗体 | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 抗体 | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 抗体 | MAB2018 | R&D | |
| 抗 TBR1 抗体 | AB2261 | ミリポア | |
| 抗 TBR2 抗体 | ab183991 | アブカム | |
| 抗 TUJ1 抗体 | 801213 | Biolegend | |
| アポトランスフェリン | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A &SM1キット | 5793-500mL | 幹細胞技術 | |
| 化学的に定義された脂質濃縮物 | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| 結晶化精製BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| ジブチリルcAMP | SC-201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| ウシ胎児血清 | A3840001 | ThermoFisher | |
| ウシの皮からのゼラチン | G9391 | シグマ | |
| ガラス コプリング ジャー | E94 | ThermoFisher | |
| グルタマックス I | 10566-016 | サーモフィッシャー | |
| グリシン | MB014001 | NZYtech | |
| ハムs F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| イソペンタン | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-アスコルビン酸 | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | 基底膜マトリックス |
| モノチオグリセロール | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | ミリポア | 実装剤 |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | 幹細胞技術 | |
| N2 サプリメント | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| パラホルムアルデヒド | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 シングルユース容器 | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive ベースユニット | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS | |
| 組換えヒト BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| 組換えヒト bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| 組換えヒト FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| 組換えヒト GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| 組換えヒト SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK阻害剤 Y-27632 | 72302 | 幹細胞技術 | |
| SB431542 S4317 | シグマ | ||
| ショ糖 | S7903 | シグマ | |
| スーパーフロスト顕微鏡 スライド | 12372098 | サーモフィッシャー | 接着顕微鏡スライド |
| ティッシュテック O.C.T. 化合物 | 25608-930 | VWR | |
| トリス-HCL 1M | T3038-1L | シグマ | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
参考文献
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Thomson, J. A. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
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再版と許可
