Summary
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。
Abstract
小脳はバランスと運動協調の維持において重要な役割を果たし、異なる小脳ニューロンの機能的欠陥は小脳機能障害を引き起こす可能性がある。疾患関連の神経細胞型に関する現在の知識のほとんどは、死後の組織に基づいており、疾患の進行と発症の理解が困難です。動物モデルおよび不死化細胞株は、神経変性疾患のモデルとしても使用されている。しかし、彼らは完全に人間の病気を再現しません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、疾患モデル化の可能性が大きく、再生アプローチの貴重な供給源となります。近年、患者由来のiPSCからの脳オルガノイドの生成は、神経変性疾患モデルの見通しを改善しました。しかし、3D培養系において多数のオルガノイドを産生し、成熟したニューロンの収量が高いプロトコルが欠けている。このプロトコルは、オルガノイドが小脳の同一性を獲得するスケーラブルな単一使用バイオリアクターを使用して、化学的に定義された条件下で、ヒトiPSC由来オルガノイドを再現可能でスケーラブルに生成するための新しいアプローチです。生成されたオルガノイドは、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で特異的なマーカーの発現によって特徴付けられる。タンパク質の特定のグループの分析は、その局在化がオルガノイド構造の評価に重要である異なる小脳細胞集団の検出を可能にします。オルガノイド凍結切除およびオルガノイドスライスのさらなる免疫染色は、特定の小脳細胞集団の存在およびそれらの空間組織を評価するために使用される。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(PSC)の出現は、再生医療および疾患モデリングのための優れたツールを表しており、これらの細胞は人体11,2のほとんどの細胞系統に分化することができるからである。その発見以来、多様なアプローチを用いたPSC分化は、神経変性疾患33、4、5、64,5を含む異なる疾患を6モデル化することが報告されている。
近年、ヒトの脳構造に似たPSC由来の3D培養が報告されている。これらは脳オルガノイド33、7、87と呼ばれています。健康な、患者固有のPSCの両方からのこれらの構造の生成は、人間の発達および神経発達障害をモデル化する貴重な機会を提供する。しかし、これらのよく組織化された脳構造を生成するために使用される方法は、その大規模な生産に適用することは困難です。オルガノイド内部の壊死を伴わずに組織形態形成を再現するのに十分な大きさの構造を作り出すために、プロトコルは静的条件下での初期神経コミットメントに依存し、続いてヒドロゲル中のカプセル化および動的系におけるその後の培養3。しかし、そのようなアプローチは、オルガノイド産生の潜在的なスケールアップを制限する可能性がある。皮質、線条体、中脳,、脊髄ニューロン9、10、11、12を含む中枢神経系の特定の領域にPSC分化を指示9する努力がなされているにもかかわらず、10,11動的な状態で特定の脳領域の生成は依然として課題である。12特に、3D構造における成熟小脳ニューロンの生成については、まだ記載されていない。Mugurumaら.は、初期の小脳の発達13を再現する培養条件の生成を開拓し、最近、ヒト胚性幹細胞が第1三期小脳7を連想させる偏光構造を生成することを可能にするプロトコルを報告した。しかしながら、報告された研究における小脳ニューロンの成熟は、オルガノイドの解離、小脳前駆腫の分類、および単層培養系7、14、15、1614,15におけるフィーダー細胞との共培養を必要7とする16。したがって、規定された条件下での疾患モデリングのための所望の小脳オルガノイドの再現性のある生成は、培養およびフィーダー源変動に関連する課題である。
このプロトコルは、単回使用垂直車輪バイオリアクター(仕様については 材料表 を参照)を用いた小脳ニューロンへのヒトPSCの3D拡張および効率的な分化のための最適な培養条件を提示し、以下バイオリアクターと呼ばれる。バイオリアクターは、U字型の底部と組み合わせた大きな垂直インペラを装備しており、容器内のより均質なせん断分布を提供し、攪拌速度17を低下させた穏やかで均一な混合および粒子懸濁液を可能にする。このシステムにより、形状およびサイズ制御された細胞凝集体が得られ、より均質で効率的な分化のために重要である。さらに、より多くのiPSC由来オルガノイドは、より手間のかかわりのない方法で生成することができます。
通常幹細胞から形成される3D多細胞構造であるオルガノイドの主な特徴は、ヒト形態形成18、19、2019,20に見られるような特定の形状を形成する異なる細胞18型の自己組織化である。したがって、オルガノイド形態は、分化過程で評価される重要な基準である。オルガノイドの細分化と、さらに特定の抗体を用いたオルガノイドスライスの免疫染色により、細胞増殖、分化、細胞集団の同一性、アポトーシスを解析する分子マーカーの空間的可視化が可能になります。このプロトコルを用いて、オルガノイド・クライオセクションを免疫染色することにより、分化の7日目により初期の効率的な神経コミットメントが観察される。分化の間、小脳の同一性を有する複数の細胞集団が観察される。この動的系で35日後、小脳神経エピテリウムは、前駆細胞および基底位置した近味神経系の前駆細胞および基底位置の素端層を有するアピコ基底軸に沿って組織する。成熟過程では、35~90日目の分化から、プルキンエ細胞(カルビンビン+)、顆粒細胞(PAX6+/MAP2+)、ゴルジ細胞(ニューログラニン+、ユニポーラブラシ細胞+(TBR2+)、深小+脳核投影ニューロン(TBR1+)+を含む、異なるタイプの小脳ニューロンが見られる。+また、培養で90日後に発生した小脳オルガノイドでは、有意でない量の細胞死が観察される。
このシステムでは、ヒトiPSC由来オルガノイドは異なる小脳ニューロンに成熟し、解離およびフィーダーの共培養を必要とせずに最大3ヶ月間生存し、疾患モデリングのためのヒト小脳ニューロンの供給源を提供する。
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Protocol
1. 単層培養におけるヒトiPSCの継ぎ手と維持
- プレートの準備
- 4 °Cで基部膜マトリックス( 材料表を参照)ストックを解凍し、60 μLアリコートを調製します。アリコートを-20°Cで凍らせます。
- 6ウェルプレートのウェルをコーティングするには、氷の上に基部膜マトリックスの1アリコートを解凍します。解凍すると、60 μL を 6 mL の DMEM-F12 に加えます。上下にピペットを入れ、穏やかに再中断します。
- 希釈した基質膜マトリックス溶液を6ウェルプレートの各ウェルに1mL添加し、RTで少なくとも1時間インキュベートしてから、4°Cで最大1週間保存します。
- EDTAによるiPSCコロニーの通過
- インキュベーター内の6ウェルプレートでiPSCを37°C、湿度95%、CO25%で維持します。
注: このプロトコルでは、3 つの異なる人間の iPSC ラインが使用されました: F002.1A.1321、ヒトエピソーム iPSC ライン (iPSC6.2)22、および市販の iPS-DF6-9-9T.B ( 資料表を参照) 。 - 合格する前に、保存されたプレート(ステップ1.1)を室温(RT)で15分間インキュベートし、mTesR1培地を準備する(表1)。
- 血清ピペットを使用してプレートから溶液を吸引し、すぐに各ウェルにmTeSR1培地の0.5 mLを加えます。
- 使用済み培地をiPSCを含むウェルから吸引し、1ウェルあたり0.5mM EDTAの1mLを使用して1回洗浄します。
- 各ウェルに0.5 mM EDTAの1 mLを加え、RTで5分間インキュベートします。
- EDTAを吸引し、mTeSR1培地を加え、P1000マイクロピペットを用いてコロニーをピペット化することにより、ウェルから細胞を除去する。円錐形の管の細胞を集める。
注:3倍以上のピペットセルを上下にしないでください。 - 各ウェルに1mLの細胞懸濁液(希釈1:4)を加え、各ウェルに細胞懸濁液を加えた後に1.5mLの培地が含まれるようにします。5%CO2、37°Cで細胞を2インキュベーターに戻す。
- 75%~80%の合流が達成された場合、毎日使用済み培地と3日ごとに通過を交換してください。
- インキュベーター内の6ウェルプレートでiPSCを37°C、湿度95%、CO25%で維持します。
バイオリアクターにおけるヒトiPSCの播種
- 10 μMのROCK阻害剤Y-27632(ROCKi)を補ったmTeSR1で単層として成長したインキュベートiPSC。6ウェル組織培養プレートから各ウェルに1mLの添加培地を加え、37°C、湿度95%、CO25%で1時間インキュベートします。
注意:ロッキは、アポトーシス23から解離されたiPSCを保護するために使用されます。 - 1時間のインキュベーションの後、各ウェルから使用済み培地を吸引し、1×PBS1ウェルあたり1mLで1倍洗浄する。
- 6ウェルプレートの各ウェルに細胞剥離培地( 材料表を参照)の1 mLを加え、37°Cで細胞が穏やかな揺れでウェルから容易に切り離されるまで7分間インキュベートします。
- ピペット細胞は、P1000マイクロピペットで上下に、細胞が分離し、単一細胞に解離するまでピペットを使用する。完全な細胞培養培地を各ウェルに2 mL加えて酵素消化を不活性化し、細胞を滅菌状の円錐管に優しくピペットします。
- 210×gで遠心分離g機を3分間、上清を取り除く。
- 細胞ペレットを培養培地中で再懸濁し(すなわち、mTeSR1は10μMのROCKiを補充)、トリパンブルー色素を用いて血球計でiPSCをカウントする。
- 種子15×106個 の単細胞(最大体積100mL)を有する60mLのmTeSR1は、最終的な細胞密度250,000細胞/mLで10μMのROCKiを補った。
- インキュベーターに置かれたユニバーサルベースユニットにiPSCを含む容器を37°C、湿度95%、CO25%に挿入します。
注:バイオリアクターの攪拌は、iPSC凝集を促進するためにユニバーサルベースユニット制御を27rpmに設定することによって24時間維持されます。
3. 小脳オルガノイドにおけるヒトiPSC由来骨体の分化と成熟
- 単一セルシードの日を 0 日として定義します。
- 1日目に、血清ピペットを用いて1mLのiPSC凝集体試料を採取する。サンプルを採取する前に、凝集体を含むバイオリアクターを用いてユニバーサルベースユニットを無菌流に置くことによって、以前のように攪拌下でバイオリアクターを維持する。超低い取り付け24ウェルプレートにセル懸濁液を入れます。iPSC 由来の集合体が形成されていることを確認します。
- 総拡大40倍または100倍の光学顕微鏡で画像を取得し、凝集直径を測定します。
- FIJIソフトウェアを使用して、各画像の集計の面積を測定します。
- を選択して 、分析|メニューバーから「測定」を設定し、「面積」と「OK」をクリックします。
- "ファイル |メニューバーから " を 開いて、保存されたイメージファイルを開きます。ツールバーに表示される線選択ツールを選択し、イメージに表示されるスケール バーの上に直線を作成します。を選択して 、分析 |メニューバーから スケールを設定します。
- 「既知の距離」では、μmで画像のスケールバーの広がりを追加します。「長さの単位」を μm として定義します。設定を維持するには、[グローバル] をクリックし、[OK] をクリックします。ツールバーで[楕円の選択]を選択します。
- 各集計に対して、楕円形ツールを使用して領域を線引します。を選択して 、分析 | ".集計がほぼ球面であることを考慮して、測定面積に基づいて直径を計算します。
A を集計の面積として使用します。
- 凝集体の平均直径が100 μmの場合、使用済み培地の80%をROCKiなしで新鮮なmTeSR1に置き換えます。凝集体の直径が200~250μmに達したら、使用済み培地をすべてgfCDM(表1)に置き換え、オルガノイドをバイオリアクターの底に落ち着かせる。
注:平均総直径が350 μmを超える場合は、分化プロトコルを開始しないでください。単一セルのシード処理を繰り返します。一般的に、総計が平均直径100μmに達するまでに約1日かかります。 - 37°C、湿度95%、および5%CO2でインキュベーターに入れられたユニバーサルベースユニットに凝集体を含むバイオリアクター2を挿入する。
- バイオリアクターの攪拌を25rpmに減らす。
- 2 日目に、手順 3.2、3.3、および 3.4 を繰り返して、集計直径を評価します。FGF2の30 μL(最終濃度、50 ng/mL)と60 μLのSB431542(最終濃度、10 μM)を60 mLのgfCDM分化培地(表1)に加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を、補足されたgfCDMに置き換えます。ステップ 3.6 を繰り返します。
注:SB431542は、神経分化を誘導する、間皮間分化を阻害するために重要です。FGF2は、神経上皮組織25の尾体化を促進するために使用される。 - 5 日目に、ステップ 3.2、3.3、3.4、および 3.8 を繰り返します。
注: 分化プロトコルの間に集計サイズが大きくなるはずです。しかし、このパラメータは分化の有効性に影響を与える可能性があるため、直径は分化が始まるときにのみ重要です。 - 7 日目に、ステップ 3.2、3.3、および 3.4 を繰り返します。希釈FGF2およびSB431542を2/3に:GfCDM分化培地の60 mLにSB431542のFGF2および40 μLのFGF2および40 μLを加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を補助gfCDMに置き換えます。ステップ3.6を繰り返し、バイオリアクター攪拌を30rpmに増やす。
- 14日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。GfCDM分化培地の60 mLにFGF19(最終濃度、100 ng/mL)の60 μLを加えます。FGF19を補充gfCDMでバイオリアクターからすべての使用済み培地を交換してください。ステップ 3.6 を繰り返します。
注:FGF19は、中脳構造26の分極化を促進するために使用されます。 - 18日目に、ステップ3.2、3.3、3.4、および3.11を繰り返します。
- 21日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。バイオリアクターからすべての使用済み培地を完全な神経基底培地に置き換える(表1)。ステップ 3.6 を繰り返します。
注:神経基底培地は、オルガノイド7内の神経細胞集団を維持するために使用される基底培地である。 - 28日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。完全な神経基底培地の60 mLにSDF1の180 μL(最終濃度、300 ng/mL)を加える。バイオリアクターからすべての使用済み培地を、SDF1で補充された完全な神経基底培地に置き換えます。ステップ 3.6 を繰り返します。
注: SDF1 は、個別のセル 層27の編成を容易にするために使用されます。 - 35日目に、ステップ3.2、3.3、および3.4を繰り返します。バイオリアクターからすべての使用済み培地を完全なBrainPhys培地に置き換える(表1)。ステップ 3.6 を繰り返します。
注:脳Physは、共感覚的に活性なニューロン28をサポートする神経培地です。 - 3日毎に総容積の1/3を90日目まで完全なBrainPhys培地に置き換えます。
4. 凍結切除・免疫組織化学のためのオルガノイドの調製
- 免疫染色のためのオルガノイドの収集
- バイオリアクターから15 mL円錐形チューブに血清ピペットを含むオルガノイドを含む培地のサンプル1 mLを収集します。
注:オルガノイドは、日7、14、21、35、56、70、80、および90を含む分化の有効性を評価するために、異なる時点で収集する必要があります。 - 上清を取り出し、1mLの1×PBSで1回洗います。
注:オルガノイドを遠心分離しないでください。オルガノイドを重力でチューブの底に落ち着かせてください。 - 上清を取り除き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の1 mLを加えます。4°Cで30分間インキュベートします。使用済みの PFA を取り出し、1 mL の 1 × PBS を追加します。
- オルガノイドを1mLの1×PBSで4°Cで、凍結切断処理のために保管してください。
注:オルガノイドは、固定後1週間以下の1x PBSで保管してください。
- バイオリアクターから15 mL円錐形チューブに血清ピペットを含むオルガノイドを含む培地のサンプル1 mLを収集します。
- 凍結切断のためのオルガノイドの調製
- 保存されたオルガノイドから上清を取り除く。15%スクロース(w/v、1×PBSで希釈)の1mLを加え、穏やかな渦巻きでよく混ぜ、4°Cで一晩インキュベートします。
- 15%スクロース/7.5%ゼラチン(表2)の溶液を調製し、固化するゼラチンを避けるために調製中に37°Cで維持する。
- 15%のスクロース溶液を取り除き、15%スクロース/7.5%ゼラチンをオルガノイドに1mL加え、穏やかな渦巻きによって素早く混ぜます。37°Cで1時間インキュベートする。
- 15%のスクロース/7.5%ゼラチン溶液をプラスチック容器に加え、その体積の半分まで。RT で固化を待ちます。
- 1時間のインキュベーションの後、慎重にパスツールピペットで固化ゼラチン上にオルガノイドを含むスクロース/ゼラチンドロップを置きます。RTで約15分間固める。気泡の形成を避けるようにしてください。
- 容器が満たされるまでオルガノイドの上に15%スクロース/7.5%ゼラチンを置きます。RT で完全な固化を待ちます。
- 固化後、4°Cで20分間インキュベートする。
- ゼラチンを中央にオルガノイドを含む立方体に切り、O.C.t.化合物の滴で段ボールの一部にゼラチンキューブを固定します。
- 500 mLカップに250mLのイセペンタンを入れ、適切な容器に液体窒素を充填します。鉗子と厚い手袋を使用して、液体窒素の表面にイポペンタンを含むカップを慎重に置き、イポランを-80°Cに冷却します。
- -80°Cに達したら、ゼラチンキューブをイセオペンタンを含むカップに入れ、温度を-80°Cに保ちます。 キューブのサイズによっては、1 ~ 2 分かかる場合があります。
注:-80°C以下の温度や過度の凍結時間は、立方体のひび割れを引き起こす可能性があるため、避けてください。 - 冷凍したら、ゼラチンキューブを-80°Cで素早く保管し、凍結切り分けするまで保管してください。
- オルガノイドの凍結切断
- クライオスタットをオンにし、-25 °Cの両方の標本(OT)と凍結室(CT)温度を定義します。
- 両方の温度が安定したら、O.C.T.化合物を用いて、試料上のオルガノイドを含むゼラチンキューブを固定する。
- 断面厚を12μmで定義します。
- 立方体を切り、接着顕微鏡スライド上の3~4枚のスライスを集めます( 材料表を参照)。
- 使用するまで-20°Cで保管してください。
- オルガノイドスライスの免疫染色
- オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを、50 mLのプリウォーム付き1x PBSを備えた熟止用瓶に入れ、最大10枚のスライドを連続して保持します。
注:すべてのオルガノイドセクションは、液体で水没する必要があります。 - 37°Cで45分間インキュベートし、スライドをデゲルラ化します。
- RTで5分間5×PBSで1倍洗う:新鮮な1×PBSを含むコプリングジャーにスライドを転送します。
- スライドを、作りたてのグリシン50mLを含むコプリングジャーに移し(表2)、RTで10分間インキュベートします。
- スライドを0.1%トリトンの50 mLを含む熟成瓶に移し、RTで10分間透過します。
- 1×PBSで5分間2分洗います。
- 1×PBSに浸した3mm紙で免疫染色皿を準備します。スライスの周りにティッシュを使ってスライドし、3mm紙の上に置きます。パスツールピペットを使用して、スライドあたり〜0.5 mLで、スライドの全面をブロッキング溶液(表2)で覆います。RTで30分間インキュベートします。
- 余分なブロッキング溶液を取り除き、スライスの周りの組織でスライドを乾燥させます。一次抗体の50 μLを配置します (表3)ブロック溶液で希釈し、カバースリップで覆います。スライスを以前に準備した免疫染色皿に入れます。4°Cで一晩インキュベートする。
- スライドをTBST(表2)の50 mLのコプリングジャーに移し、カバーリップを落とし、TBSTで5分間3倍洗います。
- ブロック溶液で希釈した2次抗体の50 μLをセクションの上に置き、カバースリップで覆います。前に準備した免疫染色皿にスライスを入れます。RTで30分間インキュベートし、光から保護します。
- スライドをもう一度コプリングジャーに移し、50 mLのTBSTで5分3倍洗います。
- スライス全体の周りのティッシュでスライドを乾燥させ、以前に準備した免疫染色皿にスライスを入れます。パスツールピペットでスライドの全面に0.5 mLのDAPI溶液を追加します。RTで5分間インキュベートします。
- ステップ 4.4.9 を繰り返します。
- 慎重にティッシュでスライドを乾燥させます。スライドに沿ってドロップして50μLの取り付け媒体を加え、慎重にカバースリップを各スライドに下げ、泡を避けるためにわずかに曲げます。
- オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを、50 mLのプリウォーム付き1x PBSを備えた熟止用瓶に入れ、最大10枚のスライドを連続して保持します。
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Representative Results
プロトコルは、0.1 Lバイオリアクターを用いて細胞凝集を促進することによって開始された(図1A)。iPSCの単一細胞接種を行い、250,000個の細胞/mLを60mLの培地に播種し、撹拌速度は27rpmであった。これは 0 日として定義されました。24時間後、細胞は効率的にスフェロイド状の凝集体(1日目、図1B)を形成し、形態は5日目まで良好に維持され、徐々にサイズが増加し、時間の経過とともに凝集形態およびサイズにおいて高度な均質性を示した。(図1B)。顕微鏡による定量分析では、1日目による集合サイズの正規分布も明らかになった(図1C)。集合サイズは、異なる系統29,30,30に向かって細胞を区別するように求めることができる重要な物理的パラメータです。このため、効率的な神経31、32および32小脳コミットメント21を誘導するために以前の研究で報告された集合体サイズに基づいて、生成された凝集体は、分化を開始する前に所望の直径に達するまで25rpmでmTeSR1培地に維持された(〜200μm)。2日目の平均直径は、F002.1A.13細胞株の平均直径は221.0±54.4μm(平均±SD)、iPSC6.2細胞株の場合は212.1±42.1μmでした。このように、両方のセルラインがこの時点で最適な集合サイズを達成した(図1C)。
iPSCの播種が0日目として行われた日を定義し、2日目に、所望の凝集直径を達成した後、SB431542、FGF2、およびインスリンを同時に使用して神経コミットメントを誘発し、神経外胚葉分化を促進し、中脳パターン化に必要な中程度の尾行化を行った。その後、FGF19及びSDF1をそれぞれ14日及び28日目に培養物に添加し、異なる小脳前駆物質の生成を促進した。神経誘導の最初の日には、25rpmの回転速度を使用し、より大きな凝集物の蓄積と凝集を避けるために7日後に30rpmに増加させた(図2A)。分化の間、オルガノイドは、発光空間を有する神経管様構造に類似した、より顕著な上皮化を示した(図2B)。さらに、オルガノイド径分布の評価は、14日目までの初期小脳コミットメントの間に均質なサイズ分布を示した(図2B)。
免疫蛍光分析は、fGF2およびSB431542を添加した後、iPSC由来オルガノイドの効率的な神経コミットメントが7日目までに既に達成されていることを支持する。オルガノイドの極性部分は、PAX6およびNESTINの神経管染色を連想させる多くの構造を明らかにし、オルガノイド内のほとんどの細胞は分化の7日目と14日目に前駆マーカーNESTINを発現している(図2C)。その後、FGF19およびSDF1は、連続増殖性前駆層(PAX6+)の生成+を促進し、効率的なニューロン分化を達成した、TUJ1、ニューロン特異的クラスIIIβ-チューブリンの発現によって示されるように、21日目および35日目までに(図2C)。さらに、0.1 L VWバイオリアクターでは21日後に効率的な小脳分化も観察され、顆粒細胞前駆腫(BARLH1+細胞、図3A)およびプルキンエ細胞前駆腫(OLIG2+細胞、図3B)の2つの異なる細胞集団の存在によって実証+された。+培養で35日後、オルガノイド内の異なる細胞集団は、異なる層に組織化されるように見えた。オルガノイド内の様々な平らな楕円形の構造は、+これらの楕円形構造の明るい領域において、BARHL1+後方小脳前駆体をオルガノイドの表層側の連続層として観察した(図3C、D)およびSOX2+(図3D)。D+また、TUJ1++新生児ニューロンが表面に向かって移動するように見え、オルガノイドの外表面に放射状の位置合わせを再確立する(図3E)。
小脳前駆物質の生成後、脳栄養因子BDNFおよびGDNFを添加したBrainPhys培地28を用いて更なる成熟が促進された。小脳神経細胞の異なるサブタイプを検出するために、オルガノイド・クライオセクションの免疫蛍光染色を用いた。プルキンエ細胞は、カルシウム結合タンパク質カルビンビンを発現するGABAergicニューロン(CALB、図3F)を、成熟プロトコル後の小脳オルガノイドで検出した。また、別の主要小脳神経型、顆粒細胞は、PAX6とMAP2を共発現する細胞のサブセットとして同定した(図3G)。興味深いことに、MAP2を発現しないPAX6+前駆子のプールは、80日間の分化まで維持されていました。TBR2を発現する単極性ブラシ細胞(図3H)や、TBR1を発現する深小脳核投影ニューロンを含む他のタイプの小脳ニューロンも検出された(図3I)。効率的な小脳分化と成熟に加えて、PBS 0.1 L VWバイオリアクターを用いたこの3D動的培養システムにより、オルガノイドは、有意な細胞死および壊死なしに最大90日間生存可能であり続けることを可能にした(図3J)。
図1:スケーラブルなバイオリアクターを用いたサイズ制御凝集体の生成(A) バイオリアクターの設計機能(B) 1日目、2日、5日目の2つの異なるiPSCラインからの集合体を示すブライトフィールド顕微鏡写真。スケールバー= 100 μm(C)バイオリアクター内の異なるiPSCラインからの浮遊凝集体のサイズ分布。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:0.1 Lバイオリアクターを用いたヒトiPSC由来オルガノイドの生成(A) 小脳オルガノイドへのiPSCの分化を誘導する培養手順の概略図細胞を250,000個の密度で播種し、27rpmの攪拌速度を使用して細胞凝集を促進した。分化の最初の日の間に、凝集物は25rpmの攪拌速度で維持された。その後、より大きな凝集体の蓄積を避けるために、攪拌速度を30rpmに増加した。(B)オルガノイドの形状とサイズの特性0.1 L VWバイオリアクターにおける小脳分化中のiPSC由来オルガノイドを示すブライトフィールド顕微鏡写真。スケールバー= 100 μmオルガノイド径の分布は、分化プロトコルに沿った均質なオルガノイドサイズを培養が維持していることを示している。(C) iPSC由来オルガノイドにおける効率的な神経誘導小脳分化中のネスチン、PAX6、およびTUJ1の免疫蛍光。スケールバー= 50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ヒトiPSC由来オルガノイドにおける効率的な小脳分化と成熟(A-E)効率的な小脳コミットメント。小脳分化プロトコルの示された時点におけるBARHL1、SOX2、OLIG2、NCAD、およびTUJ1マーカーに対する免疫染色分析。(F-I)ヒトiPSC由来小脳オルガノイドの効率的な成熟プルキンエ細胞(CALB、F)、顆粒細胞(PAX6およびMAP2、G)、単極性ブラシ細胞(TBR2)、および深小脳核投影ニューロン(TBR1)を含む、異なるタイプの小脳ニューロンを示す免疫蛍光。(J)小脳成熟後の高い細胞生存率生死(カルセインAM、緑およびヨウ化プロピジウム、赤)オルガノイドの染色は、高い細胞生存率を示し、バイオリアクターで80日後に壊死領域の証拠を示さなかった。スケールバー= 50 μm この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| メディアの準備 |
mTeSR1 最終容積:500 mL |
1. mTeSR1 5×室温(RT)または4 °Cで一晩で補い、基底培地と混合して解凍 2. 4 °Cで完全なmTeSR1培地を最大2週間保存するか、40 mLのアリコートを準備して-20 °Cで保管する 3. 使用前にRTで事前暖かい完全なmTeSR1 |
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gfCDM (成長因子非含有化学的定義培地) 最終容積:60 mL |
30 mL ハムズ F12 30 mL IMDM 600 μL化学定義脂質濃縮物(1%v/v) 2.4 μL モノチオグリセロール (450 μM) 30 μL アポトランスフェリン(水中30mg/mLのストック溶液、最終濃度:15 μg/mL) 300 mgの結晶化精製 BSA (5 mg/mL) 42 μLインスリン(10mg/mLでのストック濃度、最終濃度:7 μg/mL) 300 μL P/S (0.5% v/v, 50 U/ml ペニシリン/50 μg/ml ストレプトマイシン) |
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神経基底 最終容積:60 mL |
神経基底培地 60 mL 600 μL N2 サプリメント 600 μL グルタマックス I 300 μL P/S (0.5 % v/v)。 |
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完全な脳の菌 最終容積:60 mL |
60mL の脳の菌 1.2 mL ニューロカルト SM1 神経サプリメント 600 μL N2 サプリメント 12 μL BDNF(最終濃度:20 ng/mL) 12 μL GDNF(最終濃度:20 ng/mL) 300 μL ジブチル-cAMP (ストック濃度: 水中 100 mg/mL, 最終濃度: 1 mM) 42 μL アスコルビン酸(ストック濃度:水中50μg/mL、最終濃度:200 nM) |
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| 成長因子と小分子のストックソリューション |
基礎線維芽細胞増殖因子(bFGF/FGF2) ストック濃度:100 μg/mL |
1. 5 mM トリス、pH 7.6、10 mg/mL の濃度で再構成 2. PBS(v/v)で0.1%BSAで希釈し、最終在庫濃度100μg/mLに |
|
間質細胞由来因子1 (SDF1) ストック濃度:100 μg/mL |
1. 10 mg/mLの濃度で水に再構成する 2. PBSで0.1%BSA(v/v)で希釈し、最終在庫濃度100μg/mLにします。 |
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|
脳由来神経栄養因子(BDNF) ストック濃度:100 μg/mL |
||
|
グリア細胞由来神経栄養因子(GDNF) ストック濃度:100 μg/mL |
||
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線維芽細胞増殖因子19 (FGF19) ストック濃度:100 μg/mL |
1. 5 mM リン酸ナトリウム、pH 7.4、10 mg/mL の濃度で再構成 2. PBS(v/v)で0.1%BSAで希釈し、最終在庫濃度100μg/mLに |
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ROCK阻害剤 Y-27632 在庫濃度:10mM |
10 mMの濃度でDMSOで再構成する。 | |
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SB431542 在庫濃度:10mM |
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インスリン ストック濃度:10 mg/mL |
1. 10 mM NaOHの300 μLで10mgのインスリンを再構成する 2. 溶液が透明になるまで 1 M NaOH を慎重に追加 3. 滅菌水で1mLに充填します。 |
表1:ストックソリューションとメディアの準備 iPSCのメンテナンスおよび分化プロトコル用のメディアの準備に使用されるすべてのコンポーネントとボリューム、および成長因子と低分子のストックソリューションが記載されています。ストックソリューションの場合、再構成のための全てのストック濃度とプロトコルがリストされます。
|
ゼラチン/スクロース 最終濃度: 7.5%/15% w/w |
1. 滅菌ショットガラス瓶にスクロース15gとゼラチン7.5gの重量を量り、よく混ぜる 2. PBSを65°Cで1×前温める 3. 事前に温めたPBS 1×を最終重量100gに加え、よく混ぜる 4. ショットグラスボトルを65°Cの加熱プレートに入れ、ゼラチンが溶けるまで振る 5. 溶液が安定するまで37°Cでインキュベート |
|
グリシン 最終濃度:0.1 M |
0.37gグリシンを50mLの新たに調製したPBS1×に加えます。 |
|
トリトンソリューション 最終濃度:0.1% w/v |
1. 10% トリトンX-100ストックを準備します: 5 g のトリトン X-100 を 50 mL の PBS 1× 2. 0.5 mLのトリトンX-100ストックをPBS1×の50 mLに加えます。 |
|
TBST 20 mM トリス-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、0.05 % w/v Tween-20 |
20 mL トリス1 M 30 mL ナクル 5 M 5 mL Tween-20 (10% ストック: 50 mL水でトウィーン-20の5 g) 水で1 Lに充填します。 |
| ソリューションのブロック | 5mLの牛胎児血清(FBS、最終濃度:10%v/v)を50mLのTBSTに加えます。 |
| DAPI ソリューション | 15 μL の DAPI ストック溶液 (1 mg/mL) を 10 mL の淡水水に加える |
| モウィオール | 1. 6gのグリセロールに2.4gのモウィオールを加え、50°Cで予め温めたプレートに1時間振る 2. 6 mLの蒸留水を加え、2時間振る 3. トリス200 mM(pH 8.5)の12 mLを加え、10分間振ります 4. 5,000×gで15分間遠心分離機 5. アリコートと-20 °Cで保管してください。 |
表2:凍結切除および免疫染色のためのオルガノイドの調製のためのソリューション。 リストは、凍結切除および免疫染色のためのオルガノイドの調製に使用される溶液を調製するために使用されるすべての成分および容積である。
| 抗体 | 宿主種 | 希釈 |
| バルル1 | ウサギ | 1/500 |
| カルビンディン | ウサギ | 1/500 |
| マップ2 | マウス | 1/1000 |
| N-カドヘリン | マウス | 1/1000 |
| ネスティン | マウス | 1/400 |
| オリグ2 | ウサギ | 1/500 |
| パック6 | ウサギ | 1/400 |
| SOX2 | マウス | 1/200 |
| TBR1 | ウサギ | 1/200 |
| TBR2 | ウサギ | 1/200 |
| TUJ1 | マウス | 1/1000 |
表3:一次抗体。 免疫染色に使用される一次抗体、クローン、および最適化された希釈液が挙げられる。
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Discussion
大規模な細胞数と、薬物スクリーニングおよび再生医療用途向けに特定の細胞タイプを生成するための定義された培養条件の必要性が、スケーラブルな培養システムの開発を推進してきました。近年、いくつかのグループは、神経前駆物質および機能的ニューロンのスケーラブルな生成を報告しています32,,33,,34,神経変性疾患の新しいモデルの開発に大きな進歩を提供.それにもかかわらず、胚発生のいくつかの重要な事象の再現はまだ欠けていて、そして長期間の懸濁液中での生成された機能ニューロンの維持は34を達成していない。ここでは、小脳の同一性を持つiPSC由来神経オルガノイドを生成し、動的培養における化学的に定義されたフィーダーフリー条件下での機能的小脳ニューロンへの成熟をさらに促進することができる動的3D培養システムを紹介します。
小脳分化を始める前に、ヒトのiPSCの品質を維持することが重要です。したがって、分化を妨げないように、iPSCの3回以下の通路を解凍からバイオリアクターの接種まで行うべきではありません。分化プロトコルの重要なステップは、集計サイズを評価することです。集合サイズは、特定の細胞系に対する分化を誘導する上で重要な役割を果たす29.それに加えて、分化35を支持するように見える最小サイズのしきい値があります。既に報告されているように、効率的な神経コミットメント31、32および32小脳分化21を促進するための最適なiPSC由来の凝集直径は、〜200μmの直径である。
さらに、この動的プロトコルでは、培養の最初の日に使用される攪拌速度は、凝集直径および神経誘導を制御するために重要である。培養は27rpmで始まり、iPSCの凝集を促進し、より大きな凝集体の形成を避けるのに十分です(直径350μm以上の直径は避けるべき)。単一細胞の播種後の細胞凝集を促進するために使用される攪拌は、細胞の生存率に影響を与えることなく30rpmに増加させることができました;しかし、より高い攪拌速度はより小さい凝集体を生成することが期待される。27 rpm を使用したセルシード後の iPSC ライン、24 時間に応じて、形成された凝集体の小径(<200 μm)、またはサイズの範囲に 200 ~300 μm の範囲に達した 2 つのシナリオが予想されます。細胞播種後24時間で凝集体が350μmより大きい場合、分化を行うべきではなく、分化の効率が非常に低くなるので、細胞の播種を繰り返す必要があります。凝集体が200μmより小さい場合、使用済み培地をiPSCメンテナンス媒体に置き換え、攪拌速度を25rpmに下げます。この調整により、凝集直径は、攪拌速度の低下によって促進される個々の凝集体の合流により、1日目から2日目まで増加すると予想される。200~300μmの大きさの凝集体の場合、使用済み培地を分化培地に置き換え、FGF2による神経誘導は培養2日後に開始する必要があります。この時点で、細胞は分化媒体の存在下でせん断ストレスに敏感であるため、この時点で、過度の細胞死を防ぐために攪拌速度をわずかに低下させるべきである。さらに、母集団の均質性は、標準偏差と集合直径の平均を相関させることによって変動を測定する変動係数(CV)を使用して分析することができます。
δは、総体直径の標準偏差を表し、μ平均直径です。この動的系では、観察された平均CVはF002.1A.± 13細胞株の場合は3.3%(平均±SD)、2日目のiPSC6.2細胞株では19.0±0.37%であった。したがって、このシステムでは、CVが0.2(<変動の20%)未満の均質なサイズの集団が期待される。7日間の分化後、平均総直径は300~360μmの範囲で、0.1 L VWバイオリアクターの底部に凝集体が落ち着くのを防ぐために攪拌速度を30rpmに増加させた。
35日目までの小脳オルガノイドの分化と静的条件下での集合体サイズの分析は、最近報告された21.著者らは、分化の7日目までプレート(例えば、Aggrewell)で形成および維持された3D凝集体が、サイズおよび形状21において均質であることを示した。しかしながら、極低添付ファイル6ウェル培養プレートに凝集体を移した後、凝集体は大きさおよび形態21において変化し始めた。静的条件下では35日目、3D凝集体の一部は異なる細胞株に対して1,000μmに達し、栄養素と酸素の拡散が制限されました。これに対し、当社の動的条件を使用すると、35日目までに凝集体の直径が800μmを超えるものではなく、垂直ホイールによって促進される媒体の一定の撹拌による質量移動が改善されました。さらに、凝集サイズは成熟プロセスの終わりまで維持され、90日までに104.2μm±646.6の総直径を示し、0.1 L VWバイオリアクターで行われた最長の培養を行った。
効率的な小脳誘導は、この3D動的系におけるSB431542、FGF2、FGF19、およびSDF1の順次添加によって誘導された。このプロトコルは、センデ皮分化を阻害する形素成長因子β(TGF-ß)受容体遮断薬であるSB431542と、神経上皮組織25の尾体化に大きな効果を有するFGF2との組み合わせから始まる。したがって、培養の最初の日にこれら2つの分子を添加することは、小脳組織を生じさせる領域である中脳への細胞分化を促進するために不可欠である。中脳組織への初期誘導後、後方腹側極性を有する中脳構造の自発的発生を促進するためのFGF19を追加する必要があるとともに、異なる小脳前駆物質36,26,26の生成も必要である。SDF1は、小脳神経新生が27に起こる発達段階で見られるように、小脳前駆細胞の異なる層の組織化を促進する。35日目まで、これらの分子は、第1三期小脳に対応するヒト小脳の発達を再現できる小脳オルガノイドの組織を促進することができる。小脳前駆物質を異なる層に組織化した後、定義されたニューロン培地を使用して成熟28を促進した。神経細胞を維持するために使用される他の培地もテストすることができますが、効率の低下が予想されます。従って、このプロトコルにおいて、脳病細胞の小脳ニューロンへの分化を促進するために、脳内ニューロン環境をよりよく模倣し、生成されたニューロン28の神経生理活性を支持することが報告されているために使用された。
これらの動的条件を使用して、栄養素、酸素、および成長因子のより効率的な拡散を達成することができます。しかし、いくつかの制限は、分化プロトコルで使用される攪拌に関連付けられている。いくつかのせん断応力は、細胞の生存、増殖、および分化に影響を与えることができる攪拌プロセスによって導入することができます。したがって、成熟段階において、細胞がより敏感である場合、培養は注意深く監視されなければならない。
ヒト胚性小脳の発達を思わせる小脳オルガノイドの分化は既に報告されている。しかし、これらの胚小脳オルガノイドを3D培養を用いた小脳ニューロンへのさらなる成熟は依然として課題である。機能的小脳ニューロンの生成は、様々なソース44、7、157,15からの顆粒細胞との共培養によってのみ達成された。このプロトコルは、ヒトiPSCの小脳コミットメントをうまくアップスケールしました。さらに、これはフィーダー細胞との共培養を伴わない3D培養系における異なる小脳ニューロンの分化のための最初のプロトコルである。具体的には、プルキンエ細胞(カルビンビン+)、顆粒細胞(PAX6+/MAP2+)、単極ブラシ細胞(TBR2+)、および深小脳核投影ニューロン(TBR1+)の細胞は、3ヶ月もの間懸濁+液中に維持された。.+++
小脳オルガノイドのスケーラブルな生成は、小脳の胚発生とこの器官の変性に関与する病理学的経路を研究するための貴重なツールを表しています。さらに、小脳機能を回復させる分子のハイスループットスクリーニングは、このスケーラブルなシステムで得られたオルガノイドを用いて行うことができる。全体的に見て、この方法は、様々な生物医学用途に重要である可能性のある高品質の小脳オルガノイドの生成のためのスケーラブルなプロトコルの満たされていない必要性を満たす。
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Disclosures
著者YHとSJはPBSバイオテクノロジーの従業員です。著者BLは、PBSバイオテック社のCEO兼共同創設者です。これらの共同研究者は、原稿に使用されるバイオリアクターの開発に参加しました。これは、データと資料の共有に関するジャーナルのすべてのポリシーに対する著者の遵守を変更するものではありません。他のすべての著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この作品は、フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)、ポルトガル(UIDB/04565/2020)がプログラム・オペラシオナル・リージョナル・デ・リスボア2020、プロジェクトN.007317によって支援されました。 PD/BD/105773/2014からT.P.SとPD/BD/128376/2017からD.E.S.N.へ、FEDER(PORリスボア2020)が共同出資するプロジェクト 2020)とFCTは、PAC精密リスボア-01-0145-FEDER-016394および運動失調研究のための小脳オルガノイドのCEREBEX世代を通じてLISBOA-01-0145-FEDER-029298を付与します。欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムからも資金が寄せられたのは、助成金協定番号739572(再生精密医療発見センターH2020-WIDESPREAD-01-2016-2017)の下で行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3MM paper | WHA3030861 | Merck | |
| Accutase | A6964 - 500mL | Sigma | cell detachment medium |
| Anti-BARHL1 Antibody | HPA004809 | Atlas Antibodies | |
| Anti-Calbindin D-28k Antibody | CB28 | Millipore | |
| Anti-MAP2 Antibody | M4403 | Sigma | |
| Anti-N-Cadherin Antibody | 610921 | BD Transduction | |
| Anti-NESTIN Antibody | MAB1259-SP | R&D | |
| Anti-OLIG2 Antibody | MABN50 | Millipore | |
| Anti-PAX6 Antibody | PRB-278P | Covance | |
| Anti-SOX2 Antibody | MAB2018 | R&D | |
| Anti-TBR1 Antibody | AB2261 | Millipore | |
| Anti-TBR2 Antibody | ab183991 | Abcam | |
| Anti-TUJ1 Antibody | 801213 | Biolegend | |
| Apo-transferrin | T1147 | Sigma | |
| BrainPhys Neuronal Medium N2-A & SM1 Kit | 5793 - 500mL | Stem cell tecnhnologies | |
| Chemically defined lipid concentrate | 11905031 | ThermoFisher | |
| Coverslips 24x60mm | 631-1575 | VWR | |
| Crystallization-purified BSA | 5470 | Sigma | |
| DAPI | 10236276001 | Sigma | |
| Dibutyryl cAMP | SC- 201567B -500mg | Frilabo | |
| DMEM-F12 | 32500-035 | ThermoFisher | |
| Fetal bovine serum | A3840001 | ThermoFisher | |
| Gelatin from bovine skin | G9391 | Sigma | |
| Glass Copling Jar | E94 | ThermoFisher | |
| Glutamax I | 10566-016 | ThermoFisher | |
| Glycine | MB014001 | NZYtech | |
| Ham’s F12 | 21765029 | ThermoFisher | |
| Human Episomal iPSC Line | A18945 | ThermoFisher | iPSC6.2 |
| IMDM | 12440046 | ThermoFisher | |
| Insulin | 91077C | Sigma | |
| iPS DF6-9-9T.B | WiCell | ||
| Iso-pentane | PHR1661-2ML | Sigma | |
| L-Ascorbic acid | A-92902 | Sigma | |
| Matrigel | 354230 | Corning | basement membrane matrix |
| Monothioglycerol | M6154 | Sigma | |
| Mowiol | 475904 | Millipore | mounting medium |
| mTeSR1 | 85850 -500ml | Stem cell technologies | |
| N2 supplement | 17502048 | ThermoFisher | |
| Neurobasal | 12348017 | ThermoFisher | |
| Paraformaldehyde | 158127 | Sigma | |
| PBS-0.1 Single-Use Vessel | SKU: IA-0.1-D-001 | PBS Biotech | |
| PBS-MINI MagDrive Base Unit | SKU: IA-UNI-B-501 | PBS Biotech | |
| Recombinant human BDNF | 450-02 | Peprotech | |
| Recombinant human bFGF/FGF2 | 100-18B | Peprotech | |
| Recombinant human FGF19 | 100-32 | Peprotech | |
| Recombinant human GDNF | 450-10 | Peprotech | |
| Recombinant human SDF1 | 300-28A | Peprotech | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | 72302 | Stem cell technologies | |
| SB431542 | S4317 | Sigma | |
| Sucrose | S7903 | Sigma | |
| SuperFrost Microscope slides | 12372098 | ThermoFisher | adhesion microscope slides |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | 25608-930 | VWR | |
| Tris-HCL 1M | T3038-1L | Sigma | |
| Triton X-100 | 9002-93-1 | Sigma | |
| Tween-20 | P1379 | Sigma | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | 15575020 | ThermoFisher |
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