Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

Teresa  P. Silva; Tiago G. Fernandes; Diogo  E. S. Nogueira; Carlos  A. V. Rodrigues; Evguenia  P. Bekman; Yas Hashimura; Sunghoon Jung; Brian Lee; Maria Carmo-Fonseca; Joaquim  M. S. Cabral

doi:10.3791/61143

Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

11.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/61143

⸱

13 июня 2020 г.

Teresa P. Silva¹^,² , Tiago G. Fernandes¹ , Diogo E. S. Nogueira¹ , Carlos A. V. Rodrigues¹ , Evguenia P. Bekman¹^,²^,³ , Yas Hashimura⁴ , Sunghoon Jung⁴ , Brian Lee⁴ , Maria Carmo-Fonseca² , Joaquim M. S. Cabral¹

¹iBB - Institute for Bioengineering and Biosciences and Department of Bioengineering, Instituto Superior Técnico, Universidade de Lisboa, ²Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, ³The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine, Lisbon Campus, Universidade de Lisboa, ⁴PBS Biotech, Inc, Camarillo, CA, USA

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает динамическую культурную систему для производства контролируемых агрегатов размеров человеческих плюрипотентных стволовых клеток и дальнейшего стимулирования дифференциации мозжечковых органоидов в условиях, свободных от химических и фидерных, с использованием одноразового биореактора.

Аннотация

Мозжечок играет важную роль в поддержании баланса и двигательной координации, а функциональный дефект в различных мозжечковых нейронах может вызвать мозжечковую дисфункцию. Большинство современных знаний о связанных с болезнями фенотипах нейронов основано на посмертных тканях, что затрудняет понимание прогрессирования и развития болезни. Модели животных и увековеченные клеточные линии также используются в качестве моделей для нейродегенеративных расстройств. Тем не менее, они не в полной мере повторить болезни человека. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) имеют большой потенциал для моделирования заболеваний и являются ценным источником регенеративных подходов. В последние годы генерация церебральных органоидов из iPSCs, полученных пациентом, улучшила перспективы моделирования нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы, которые производят большое количество органоидов и высокий выход зрелых нейронов в системах 3D культуры отсутствуют. Представленный протокол представляет если представить новый подход к воспроизводимому и масштабируемому поколению органоидов, полученных человеком iPSC, в химически определенных условиях с использованием масштабируемых одноразових биореакторов, в которых органоиды приобретают мозжечковую идентичность. Генерируемые органоиды характеризуются экспрессией специфических маркеров как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ конкретных групп белков позволяет выявлять различные популяции мозжечковых клеток, локализация которых важна для оценки органоидной структуры. Органоидная криозирование и дальнейшее иммуностеление органоидных ломтиков используются для оценки присутствия конкретных популяций мозжечковых клеток и их пространственной организации.

Введение

Появление плюрипотентных стволовых клеток человека (PSCs) представляет собой отличный инструмент для регенеративной медицины и моделирования заболеваний, потому что эти клетки могут быть дифференцированы в большинстве клеточных линий^{человеческого тела 1}^,². С момента своего открытия, PSC дифференциации с использованием различных подходов, как сообщается, модели различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств^3,^,^4,^,^5,^,⁶.

В последнее время п....