Les cils primaires sont des structures extracellulaires associées au centriole. La détection primaire des cils par coloration immunofluorescente est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ce protocole, les fibroblastes exprimant des cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal.
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Article de méthode
Détection simple des cils primaires par immunofluorescence
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cils primaires sont régulés dynamiquement au cours de la progression du cycle cellulaire, en particulier pendant les phases G0/G1 du cycle cellulaire, étant résorbés avant la mitose. Les cils primaires peuvent être visualisés avec des méthodes très sophistiquées, y compris la microscopie électronique de transmission, l’imagerie 3D, ou en utilisant un logiciel pour la détection automatique des cils primaires. Cependant, la coloration immunofluorescente des cils primaires est nécessaire pour effectuer ces méthodes. Cette publication décrit un protocole pour la détection facile des cils primaires in vitro en tachant la tubuline alpha acétylée (axoneme) et la tubuline gamma (corps basal). Ce protocole de coloration immunofluorescente est relativement simple et donne des images de haute qualité. Le présent protocole décrit comment quatre lignées cellulaires (C2C12, MEF, NHLF et fibroblastes cutanés) exprimant des cils primaires ont été fixées, immunostainées et imageuses à l’aide d’un microscope fluorescent ou confocal.
Introduction
Les cils primaires sont des structures sensorielles, solitaires, liées à la membrane, non-motiles associées au centriole mère de la cellule. Les cils primaires se trouvent sur la plupart des cellules vertébrées, à l’exception des globules rouges, des adipocytes1et des hépatocytes2. Les cils primaires sont formés sous forme d’axoneme allongé composé de microtubules, dont le principal composant est l’α-tubuline. L’axoneme pousse à partir du corps basal, qui est structuré à partir de γ-tubuline. La longueur des cils primaires varie entre 2 et 10 μm; cependant, ses dimensions peuvent changer pendant la glycylation, la famine....
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Protocole
1. Préparation des supports culturels, des solutions et des plats
- Autoclavez les couvercles (22 x 22 mm). Préparer 6 assiettes de puits. Décongeler le sérum bovin fœtal (FBS) et la pénicilline/streptomycine antibiotique et réchauffer la température moyenne à ambiante (RT). Utiliser trypsin-EDTA (0.25%) et 1x PBS (saline tamponnée de phosphate avec calcium et magnésium) pour passer les cellules.
- Préparer du paraformaldéhyde frais à 4 % (PFA) en dH2O (800 mg de PFA dans 20 mL de dH2O). La PFA doit être fraîchement préparée pour chaque expérience. Remuer et chauffer la solution à 55 °C pendant 30 min dans le capot. Refroidir à RT....
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Résultats
La coloration immunofluorescente des cils primaires est une procédure relativement simple qui se traduit par des images de haute qualité. Dans ces expériences, les fibroblastes exprimant les cils primaires ont été fixés, immunostained, et photographiés dans un microscope fluorescent ou confocal suivant le protocole décrit ci-dessus. Le cilium primaire a été détecté à l’aide d’acétylated α-tubuline et γ-tubuline. L’évaluation des cils primaires peut être effectuée à divers niveaux et tout changement à cet égard peut être .......
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Discussion
Plusieurs auteurs ont décrit diverses méthodes pour la détection des cils primaires, décrivant parfois également diverses méthodes de fixation qui peuvent affecter leur détection6,20,21,22. Quoi qu’il en soit, il est difficile de trouver un protocole complet et simple pour la détection. La disponibilité immédiate d’une telle méthode serait sans aucun doute d’une grande aide à l’étude de l’étude.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Ministère de la défense de la République tchèque - Plan de développement d’organisations à long terme Aspects médicaux des armes de destruction massive de la Faculté des sciences de la santé militaire de l’Université de la Défense; le Ministère de l’éducation, de la jeunesse et des sports, République tchèque (Projet de recherche spécifique no : SV/ FVZ201703) et PROGRES Q40/06. Merci aussi à Daniel Diaz pour son aimable aide à la révision de la langue anglaise.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Plaque 6 puits | TPP | 92406 | Dimensions 128x86x22 mm |
| Alexa Fluor488 | Jackson ImmunoResearch | 111-546-047 | AffiniPure F(ab' ? Fragment de chèvre Anti-Lapin IgG |
| Anti-Tubuline &gamma ; | Sigma-Aldrich | T5192 | Polyclonal Rabbit anti-Mouse IgG2a |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | Myoblast (souris) |
| Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | Anti-Mouse IgG (molécule entière) F(ab&prime ;)2 fragments&ndash ; Anticorps Cy3 produit chez le mouton |
| Dapi (4&prime ;,6-Diamidino-2-dichlorhydrate de phénylindole) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Dulbecco´ ; s Aigle modifié´ ; s moyen | Thermo Scientific | 11960044 | Glycémie élevée, pas de glutamine, Gibco |
| Dulbecco' s Saline tamponnée au phosphate | Sigma-Aldrich | D8662 | avec MgCl2 et CaCl2, filtrée stérile, adaptée à la culture cellulaire |
| Sérum de veau fœtal | Thermo Scientific | 16000044 | Filtrée stérile, Gibco |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEF | ATCC | SCRC-1039 | Fibroblaste embryonnaire de souris |
| Tubuline monoclonale anti-acétylée | Sigma-Aldrich | T7451 | Anticorps monoclonal anti-acétylé de tubuline produit chez la souris |
| NHLF | Lonza | CC-2512 | Fibroblastes pulmonaires primaires (humain) |
| Sérum de chèvre normale | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | Poudre |
| Pénicilline-Streptomycine | Sigma-Aldrich | P0781 | 10 000 unités de pénicilline et 10 mg de streptomycine par mL dans 0,9 % de NaCl, filtré stérilement |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36961 | |
| Fibroblastes cutanés | Gracieuseté de l’Université Charles, Faculté de médecine de Hradec Krá ; amouré ;. | ||
| Couvercles carrés | Thermo Scientific | 22X22-1.5 | Verre borosilicaté, 22x22mm, |
| Carré Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| Trypsine-EDTA (0.25 %) | Thermo Scientific | 25200072 | Stérile-Filtré, Gibco |
Références
- Alieva, I. B., Vorobjev, I. A. Vertebrate primary cilia: a sensory part of centrosomal complex in tissue cells, but a "sleeping beauty" in cultured cells. Cell Biology International. 28 (2), 139-150 (2004).
- Primary cilia. Sloboda, R. , Elsevier, Acad. Press. Amsterdam. (2009).
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Réimpressions et autorisations
