本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。
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本文内容
摘要
摘要
骨膜骨骼干细胞（P-SSCs）对终身骨骼维持和修复至关重要，因此是开发促进骨折愈合疗法的理想靶点。 骨膜细胞会迅速迁移至损伤部位，为骨折愈合提供新的软骨细胞和成骨细胞。传统上，细胞因子诱导细胞迁移能力的有效性仅通过体外实验（如Transwell或划痕实验）进行评估。随着多光子激发活体显微技术的进步，近期研究发现：1）P-SSCs表达迁移相关基因CCR5；2）使用CCR5配体CCL5处理可改善骨折愈合，并促进P-SSCs向CCL5的迁移。这些结果已实现实时捕获。本文描述了一种可视化P-SSC从颅骨缝骨骼干细胞（SSC）生态位在CCL5处理后向损伤部位迁移的实验方案。该方案详细介绍了小鼠固定装置与成像支架的构建、小鼠颅骨的手术准备、颅骨缺损的诱导以及延时成像的采集过程。
引言
骨折修复是一个动态的多细胞过程，与胚胎期骨骼发育和骨骼重塑过程截然不同。在此过程中，受损组织产生的损伤信号会迅速诱导骨骼干细胞/祖细胞的募集、增殖及后续分化，这些过程对骨折整体的稳定与固定至关重要1。尤其在骨折愈合的早期阶段，需要形成软性骨痂，这一过程主要归因于骨膜中的常驻细胞2。当骨骼受到损伤时，一部分骨膜细胞会迅速响应，并分化为骨痂内的软骨中间产物和成骨细胞3，这表明骨膜中存在一类独特的骨骼干细胞/祖细胞群体。因此，鉴定并功能表征骨膜驻留的骨骼干细胞（SSCs）为退行性骨病及骨缺损的治疗提供了极具前景的策略4。
人们认为骨骼干细胞（SSCs）存在于多个组织部位，包括骨髓。类似于骨髓，成骨/软骨生成性SSCs也在骨膜中被发现4,5,6。 这些骨膜来源的SSCs（P-SSCs）在胎儿骨骼发育过程中可被早期间充质谱系标记物标记（例如，Prx1-Cre5、Ctsk-Cre
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方案
所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验程序均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 小鼠准备
- 将 Mx1-Cre17 小鼠和 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 小鼠（购自杰克逊实验室）与 αSMA-GFP 小鼠（由 Ivo Kalajzic 博士和 Henry Kronenberg 博士提供）杂交，以生成 Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) 报告基因小鼠（图 2A）。
- 为诱导 Mx1-Cre 表达，每隔一天向小鼠注射一次 25 mg/kg 的 pIpC，持续 10 天。
- 在静脉移植 1 × 106 个野生型 C57BL/6 小鼠全骨髓单个核细胞（WT-BMT）19 前 1 天，对小鼠进行 9.5 Gy 的照射。 ....
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结果
已有研究提出，骨骼祖细胞可能具有迁移或循环潜能20。近期构建了Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+（Mx1/Tomato/αSMA-GFP）报告基因小鼠模型，其中P-SSCs通过Mx1+αSMA+双标记进行标识（图2A,B）。在损伤后24–48小时内，Mx1+αSMA+ P-SSCs大量从骨缝间充质迁移而出11。此外，还检测了颅骨缺损后24小时体内P-SSCs实时迁移的可能性。成像后1小时内几乎未观察到Mx1+αSMA+
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讨论
在骨愈合过程中，骨膜细胞是损伤骨痂内新分化的软骨细胞和成骨细胞的主要来源3。类似于骨髓，成骨/软骨生成性干细胞（SSC）也在骨膜中被鉴定出来4,5,6。评估内源性骨膜干细胞（P-SSC）功能特征在技术上具有挑战性。通常，干细胞的迁移动态是在体外进行评估，这使得对其相应体内系统的解释变得困难。由于活体动物共聚焦显微成像技术的最新进展以及新型报告小鼠（Mx1/Tomato/αSMA-GFP）的构建，现已可实现对单个细胞在体内的动态追踪。因此，该方法能够实现实时记录CCL5诱导的P-SSCs在体内的迁移过程。
该方法存在若干可能影响成像一致性的技术挑战。其中主要的技术挑战之一是维持Z轴方向的成像平面。Z轴漂移（Z-drift）在固定样本和活体样本的长期成像过程中普遍存在，主要归因于成像环境中温度的变化。 尽管无法完全消除这一伪影，但对载物台、物.......
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披露
L.C.O. 和 D.P. 披露了一项待审批的专利，名为“Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair”（BAYM.P0264US.P1）。其余作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究由德克萨斯州骨科疾病项目奖、Caroline Wiess Law 基金奖以及美国国立卫生研究院国家关节与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助，项目编号分别为 R01 AR072018、R21 AG064345、R01 CA221946，授予 D.P.。 我们感谢贝勒医学院光学成像与活体显微技术核心实验室的 M.E. Dickinson 和 T.J. Vadakkan 以及 BCM先进科技核心平台 由中国国家卫生研究院（NIH）资助（AI036211， CA125123 和 DK056338）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| ½” 光学支架 | ThorLabs | TR2 | 用于成像固定装置 |
| 1 mL 注射器 | BD | 309659 | |
| 27G 针头 | BD PercisionGlide | 305111 | |
| 29G 胰岛素注射器 | McKesson | 102-SN05C905P | |
| 50 mL 锥形管 | Falcon | 352098 | 用于小鼠固定 |
| 可调角度板 | Renishaw | R-PCA-5023-50-20 | 用于成像固定装置 |
| 酒精棉片 | Coviden | 6818 | |
| 聚维酮碘外科洗手液 | Henry Schen | 67618-151-16 | |
| Buprenorphine SR-LAB | ZooPharm | 1 mg/mL 缓释剂型 | |
| Combo III | 由兽医工作人员提供 | N/A | 37.6 mg/mL 氯胺酮；1.9 mg/mL 赛拉嗪；0.37 mg/mL 乙酰丙嗪 |
| 盖玻片 | Fisher | 12-545-87 | 24 × 40 优质超薄盖玻片 |
| 精细镊子 | FST | 11254-20 | |
| 氯胺酮 | KetaVed | 50989-161-06 | 100 mg/mL |
| Leica TCS SP8MP 配 DM6000CFS | Leica Microsystems | N/A | |
| Matrigel | R & D Systems | 344500101 | |
| 医用胶带 | McKesson | 100199 | 3" × 10 码（7.6 cm × 9.1 m） |
| 甲基纤维素 | Electron Microscopy Sciences | 19560 | |
| 显微解剖剪刀 | FST | 1456-12 | |
| 电动载物台 | Anaheim Automation | N/A | |
| 持针器 | FST | 12500-12 | |
| 不可吸收缝线 | McKesson | S913BX | 单丝尼龙 5-0 不可吸收缝线，配 C-1 反向切割针 |
| 眼科软膏 | Rugby | 0536-1086-91 | |
| RANTES | Biolegend | 594202 | 10 µg/50 µL |
| 适用于 ½” 支架的直角夹具，3/16” 六角接口 | ThorLabs | RA90 | 用于成像固定装置 |
| 弹簧加载式 3/16” 六角锁紧 ¼” 旋钮螺钉 | ThorLabs | TS25H | 用于成像固定装置 |
| 无菌棉签 | Henry Schen | 100-9249 | |
| 无菌 DPBS (1×) | Corning | 21-030-CV | |
| 无菌手术单 | McKessen | 25-517 | |
| 外科手套 | McKessen | 3158VA | |
| 三重抗生素软膏 | Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc. | 51672-2120-2 | |
| 真空采血管采集套件 | BD | REF 367298 | 25G 蝶形针输液套件，配 12" 管路 |
参考文献
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Murao, H., Yamamoto, K., Matsuda, S., Akiyama, H. Periosteal cells are a major source of soft callus in bone fracture. ....
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重印与许可
