Summary
Thermische Grenzwerte können die Umwelt, die Organismen tolerieren, vorhersagen, was angesichts des raschen Klimawandels wertvolle Informationen ist. Hier werden Protokolle mit hohem Durchsatz beschrieben, um kritische thermische Minima und Wärmeabstoßzeiten bei Insekten zu bewerten. Beide Protokolle maximieren den Durchsatz und minimieren die Kosten der Assays.
Abstract
Obere und niedrigere thermische Grenzwerte von Pflanzen und Tieren sind wichtige Prädiktoren für ihre Leistung, ihr Überleben und ihre geografische Verteilung und sind für die Vorhersage von Reaktionen auf den Klimawandel unerlässlich. Diese Arbeit beschreibt zwei Hochdurchsatzprotokolle zur Messung von thermischen Grenzwerten für Insekten: eines zur Beurteilung kritischer thermischer Minima (CTmin)und das andere zur Beurteilung der Wärmeabschlagzeit (KDT) als Reaktion auf einen statischen Wärmestressor. ImCT-Min-Assay werden Individuen in einer Acryl-Mantelsäule platziert, einer abnehmenden Temperaturrampe ausgesetzt und mit einem Infrarotsensor von ihren Barschen gezählt. In der Hitze KDT Assay, Individuen sind in einer 96 Brunnenplatte enthalten, in einem Inkubator auf eine stressige, heiße Temperatur gesetzt, und Video aufgezeichnet, um die Zeit zu bestimmen, zu der sie nicht mehr aufrecht bleiben und bewegen können. Diese Protokolle bieten Vorteile gegenüber häufig verwendeten Techniken. Beide Assays sind kostengünstig und können relativ schnell abgeschlossen werden (ca. 2 h). Der CTmin Assay reduziert Experimentatorfehler und kann eine große Anzahl von Individuen auf einmal messen. Das Heat-KDT-Protokoll erzeugt eine Videoaufzeichnung jedes Assays und beseitigt somit die Voreingenommenheit der Experimentier und die Notwendigkeit, Personen kontinuierlich in Echtzeit zu überwachen.
Introduction
Thermische Grenzen von Insekten
Die Variation der Umgebungsbedingungen, einschließlich der Temperatur, ist ein wichtiger Faktor, der die Leistung, Fitness, das Überleben und die geografische Verteilung der Organismen1,2beeinflusst. Obere und untere thermische Grenzwerte bestimmen den theoretischen Bereich der Umgebungen, die ein Organismus tolerieren kann, und daher sind diese Grenzwerte wichtige Prädiktoren für Pflanzen- und Tierverteilungen, insbesondere angesichts des Klimawandels3,4. Daher sind Protokolle zur genauen Messung von thermischen Grenzwerten wichtige Werkzeuge unter anderem für Ökologen, Physiologen, Evolutionsbiologen und Naturschutzbiologen.
Als die am häufigsten vorkommenden und vielfältigsten Landtiere werden Insekten häufig für Messungen der thermischen Grenzwerte verwendet. Kritische thermische Maxima (CTmax) und kritische thermische Minima (CTmin) werden häufig verwendet, um intra- und interspezifische Variationen der thermischen Toleranz5,6,7zu bewerten. Während CTmax und CTmin für mehrere Phänotypen gemessen werden können, einschließlich Wachstum, Fortpflanzungsleistung und Verhalten, werden sie am häufigsten auf die Bewegungsfunktion5,6,7angewendet. So werden CTmax (auch Heat Knockdown Temperatur genannt) und CTmin oft definiert als die hohen und niedrigen Temperaturen, bei denen Insekten die Motorfunktion verlieren und nicht aufrecht bleiben können5,6,7,8,9,10,11. CTmin fällt mit dem Beginn des kalten Koma, eine reversible Lähmung durch kalte Temperaturen6. Während Lähmungen an den thermischen Grenzwerten oft reversibel sind, führt die fortgesetzte Exposition gegenüber diesen Temperaturen zum ökologischen Tod5.
Gemeinsame Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte
Eine Vielzahl von Geräten wurden verwendet, um thermische Grenzwerte zu messen (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Kurz gesagt, Insekten werden in Brutkästen12,13erhitzt oder gekühlt, Behälter in Fluidbädern11,,14,15,16, Aluminiumblöcke10,17oder ummantelte Behälter18, und überwacht, bis die Fortbewegung aufhört. Um Insekten während des Assays zu überwachen, ist die häufigste Methode die direkte Beobachtung, bei der Individuen kontinuierlich in Echtzeit oder retrospektiv mit aufgezeichnetem Video6,9,10,11,15,17überwacht werden. Direkte Beobachtungsmethoden haben zwar minimale Ausrüstungsanforderungen, sind aber arbeitsintensiv und begrenzen den Durchsatz. Alternativ können Insekten indirekt beobachtet werden, indem Individuen zu diskreten Zeiten gesammelt werden, wenn sie von Barsche6,,19,,20,21 oder mit Aktivitätsmonitoren13fallen.
Indirekte Methoden zur Messung thermischer Grenzwerte sind im Allgemeinen höher durchsatzweise und potenziell weniger fehleranfällig als direkte Beobachtungsmethoden. Die häufigste Methode für die indirekte Überwachung verwendet eine ummantelte temperaturgesteuerte Säule6,8,19,20,21. Insekten werden in einer Säule mit Barschen platziert, und die Temperatur der inneren Kammer wird durch Pumpen von Flüssigkeit aus einem temperaturgeregelten Flüssigkeitsbad durch das ummantelte Futter der Säule gesteuert. Personen, die ihre thermische Grenze erreichen, fallen von ihrem Barsch und werden in diskreten Temperaturen oder Zeitintervallen gesammelt. Während diese Methode gut für CTminfunktioniert, wurde es für CTmaxungeeignet gefunden, weil Fliegen freiwillig aus dem Boden der Säule gehen, wenn die Temperatur steigt. Die hier beschriebene neue Methode umgeht dieses Problem, indem fliegende Beimessungen einzeln eindämmen.
Neben der Beobachtungsmethode werden häufig zwei Arten von Temperaturregimen verwendet, um die oberen thermischen Grenzwerte zu bewerten. Dynamische Assays bestehen darin, die Temperatur schrittweise zu erhöhen, bis die Motorfunktion verloren geht; dass die Temperatur die dynamische CTmax7,8,9,13ist. Im Gegensatz dazu bestehen statische Assays aus einer konstanten Stresstemperatur, bis die Motorfunktion verloren geht; dieser Zeitpunkt ist die Wärme-Knockdown-Zeit (Wärme KDT), auch als statische CTmax (sCTmax) in einem aktuellen Papier von J.7,8,9,16,22. Obwohl CTmax und Heat Knockdown Assays (Heat KD Assays) Metriken mit unterschiedlichen Einheiten erzeugen, zeigt die mathematische Modellierung der beiden Merkmale an, dass sie vergleichbare Informationen über die Wärmetoleranz liefern und beide ökologisch relevant sind8,9. Dynamische Assays ergeben eine Temperatur, die mit Umgebungsbedingungen verglichen werden kann, und sie sind vorzuziehen, wenn es große Unterschiede in der Wärmetoleranz gibt, wie z. B. Vergleiche zwischen Arten mit sehr unterschiedlichen thermischen Nischen. Aufgrund des hohen Q10 für die Akkumulation von Wärmeverletzungen kann jedoch ein statischer Assay für die Erkennung kleiner Effektgrößen, wie z. B. intraspezifische Variationen der Wärmetoleranz9, vorzuziehen sein. Auch in der Praxis erfordert ein statischer Test weniger ausgeklügelte Ausrüstung als ein dynamischer Assay.
Ziel
Ziel dieses Papiers ist es, Methoden fürCT-Min- und Wärme-KD-Assays zu formalisieren, die in zukünftigen Forschungsarbeiten verwendet werden können, um die thermischen Grenzen von motilen Insekten zu bewerten. Die Protokolle sind an bereits etablierte Methoden angepasst und so konzipiert, dass sie mit hohem Durchsatz, automatisiert und kostengünstig sind. Beide Assays können in kurzer Zeit abgeschlossen werden (ca. 2 h), was bedeutet, dass mehrere Experimente an einem einzigen Tag durchgeführt werden können, wodurch große Datenmengen entstehen, ohne die Wiederholbarkeit oder Genauigkeit zu beeinträchtigen. Mit diesem Setup kann die Wärmetoleranz von 96 Fliegen gleichzeitig gemessen werden, während die Säule für CTmin mehr als 100 Fliegen aufnehmen kann, sofern eine ausreichende Oberfläche zum Perching vorhanden ist.
Die Hochdurchsatzmethode zur Beobachtung von CTmin ändert die übliche Jackensäulenmethodik mit einem Infrarotsensor, um Fliegen automatisch zu zählen. Die Verwendung eines Infrarotsensors zum Zählen wurde erstmals 1996 von23 Shuman et al. vorgeschlagen, aber nicht weit verbreitet. Die Zugabe des Infrarotsensors ermöglicht die Generierung kontinuierlicher Daten, anstatt Daten in diskreten Intervallen zu sammeln. Dieses Protokoll minimiert auch Experimentierfehler, indem die manuelle Dateneingabe und die Notwendigkeit, Sammelrohre unter der buchsenden Spalte manuell zu diskreten Zeitpunkten zu wechseln, eliminiert wird.
Die Hochdurchsatzmethode zur Wärmeerfassung KDT wird aus zwei früheren Studien zur Wärmetoleranz bei Insekten10,12modifiziert. Einzelne Fliegen werden in einer 96-Well-Platte in einem temperaturgeregelten Inkubator gelagert und Video aufgenommen. Dieses Protokoll minimiert die Voreingenommenheit der Experimentatoren bei der Bestimmung von Wärme-KDT, da Experimente durch Abspielen der Aufzeichnung überprüft und überprüft werden können. Dieses Protokoll bietet auch eine Reihe von benutzerdefinierten Python-Skripts, die verwendet werden können, um die Videoanalyse zu beschleunigen. Die Verwendung von einzelnen Brunnen eliminiert Interferenzen, die auftreten können, wenn andere Personen sich bewegen oder umfallen, was ein Problem sein kann, wenn Gruppen von Individuen in der gleichen Arena beobachtet werden10,17. Darüber hinaus bietet der temperaturgeregelte Inkubator eine stabile Temperatur über alle 96 Brunnen, im Gegensatz zu dem Temperaturgradienten, der manchmal über einen temperaturgeregelten Aluminiumblock10beobachtet wird. Beachten Sie auch, dass die 96-Well-Aufnahmemethode angepasst werden kann, um dynamische CTmax und potenziell CTmin zu messen (siehe Diskussion).
Um jedes Protokoll zu demonstrieren, wurden die thermischen Grenzen der erwachsenen Drosophila melanogaster Weibchen aus ausgewählten Linien des Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP)24verglichen. Diese Linien wurden ausgewählt, weil vorläufige Experimente auf signifikante Unterschiede in der thermischen Toleranz hindeuteten. Diese Assays erwiesen sich als robuste Methoden zur Unterscheidung von Unterschieden in der thermischen Toleranz. Die folgenden beiden Protokolle, Hochdurchsatz-CT-Min-Assay (Abschnitt 1) und Hochdurchsatz-Wärme-KD-Assay (Abschnitt 2), beschreiben die notwendigen Maßnahmen zur Herstellung vonCT-Min- und Wärme-KDT-Daten für jedes motile Insektenleben, das in die Geräte passen kann, wie z. B. erwachsene Drosophila.min Für CTmin ist es auch wichtig, dass das Insekt in der Lage zu barsch. Hier wird jeder Assay bei erwachsenen Drosophila melanogasternachgewiesen. Änderungen können jedoch für andere Taxa oder Lebensphasen erforderlich sein6. Kleinere Änderungen können die Verwendung von Perching-Material mit größeren Öffnungen sein, um größere Proben imCT-Min-Assay unterzubringen, oder die Verwendung einer höherwertigen Kamera, um die subtile KDT eines sich langsam bewegenden Insekts oder lebenserhaltenden Stadiums im KD-Wärmetest zu erkennen. Dieses Protokoll beschreibt keine Methoden zur Vorbereitung von Fliegen, aber es ist wichtig, Aufzuchtprotokolle zu standardisieren, um die Wiederholbarkeit25 zu gewährleisten (siehe Garcia und Teets26 und Teets und Hahn27). Die bereitgestellten Protokolle enthalten Informationen über den Aufbau und die Einrichtung der Geräte, die Aufzeichnung von Messungen und eine kurze Beschreibung der Datenanalyse.
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Protocol
1. Hochdurchsatz CTmin Assay
- Montage der ummantelten Säule (Abbildung 1A, Abbildung 2)
- Schneiden Sie die breitesten (7 cm x 6,35 cm x 0,3 cm) und schmalsten (5,7 cm x 5,1 cm x 0,3 cm) Acrylrohre auf gleiche Längen (31,5 cm) mit einer Hacksäge (Abbildung 2A). Diese beiden Röhren werden die äußeren und innersten Wände der ummantelten Säule sein.
- Schneiden Sie zwei Ringe (2 cm breit) aus dem mittelgroßen (6,35 cm x 5,7 cm x 0,3 cm) Acrylrohr mit einer Hacksäge (Abbildung 2A). Diese beiden Ringe werden die Abstandshalter zwischen den inneren und äußersten Röhren sein, wodurch ein Raum zwischen den beiden langen Acrylröhren entsteht, damit Flüssigkeit fließt.
- Bohren Sie vorsichtig zwei Löcher in das äußere (breiteste) Acrylrohr, ein Loch oben und eines an der Unterseite. Stellen Sie sicher, dass jedes Loch 3,5 cm vom Ende des Rohres entfernt ist. Bohren Sie die Löcher auf gegenüberliegenden Seiten des Rohres (Abbildung 2B).
- Um Risse zu reduzieren, legen Sie Klebeband auf das Rohr über die Stelle des zukünftigen Lochs und bohren Sie sehr langsam auf die niedrigste Drehmomenteinstellung des Bohrers.
- Mit dem Gewindehahn beide Löcher einfädeln, so dass die Schlauchadapter in die beiden Löcher des Außenrohres eingeschraubt werden können. Um Risse zu reduzieren, verwenden Sie Schmiermittel und fädeln Sie langsam von Hand.
- Schieben Sie die beiden Abstandshalter auf die Innenjacke, einen an jedem Ende (unten und oben). Lassen Sie einen kleinen Abstand (0,5 cm) zwischen dem Abstandsraum und dem Ende der innen mantelen (Abbildung 2B).
- Schweißen Sie die Abstandshalter mit Acrylzement an Ort und Stelle.
- Nach dem Zement auf dem Innenrohr und Abstandshaltersetzt, schieben Sie dieses Konstrukt in das größere äußere Rohr mit den Löchern. Stellen Sie sicher, dass die Außen- und Innenrohre an beiden Enden bündig sind. Die Abstandshalter werden 0,5 cm vom Ende entfernt sein und kleine Gräben an beiden Enden der Säule bilden (Abbildung 2C).
- Schweißen Sie das Außenrohr mit Acrylzement an die Abstandshalter und verwenden Sie verstellbare Stahlklemmen, um das Gerät zusammenzuhalten. Warten Sie, bis der Zement gesetzt ist.
- Gewinden Sie die Schlauchadapter in die Löcher des Außenrohres, das nun an den Abstandshaltern und dem Innenrohr befestigt ist.
HINWEIS: Die Adapter sollten nur in das außenrohr und nicht in den offenen Raum zwischen dem inneren und dem äußersten Rohr einfädeln. Wenn die Schlauchadapter zu weit einfädeln, kürzen Sie sie mit einer Hacksäge auf die entsprechende Länge. - Versiegeln Sie die Schlauchadapter in ihre Gewinde am Außenrohr mit Silikondicht.
- Füllen Sie die beiden Gräben zwischen den inneren und äußersten Rohren an beiden Enden der ummantelten Säule mit Silikondicht.
- Um die Säule zu testen, befestigen Sie die Schläuche mit einem Durchmesser von 0,6 cm an den Schlauchadaptern. Schließen Sie den Adapter am unteren Rand der Säule an eine Wasserquelle mit Schläuchen und den Adapter oben in der Säule an einen Abfluss mit einem anderen Schlauchstück an.
- Führen Sie Wasser durch das Gerät von unten nach oben und überprüfen Sie auf Leckagen. Wenn es Lecks gibt, identifizieren Sie, woher sie kommen, und versiegeln Sie sie mit Silikon.
- Einrichten der Jackensäule und des Drosophila Trichtermonitors (DFM)
- Befestigen Sie die ummantelte Säule mit einer dreigleisigen Retortenklemme an einem Retortenständer. Richten Sie die Säule vertikal mit einem Ende an der Decke und dem anderen offen zur Laborbank aus (Abbildung 1B).
- Schließen Sie den Flüssigkeitseingang und -ausgang aus einem temperaturgeregelten Kühlbad an die Adapterdüsen der Säule mit Kunststoffschläuchen mit 0,6 cm Durchmesser an (Abbildung 1B). Schließen Sie den Flüssigkeitseingang mit der Düse am unteren Rand der Säule und den Flüssigkeitsausgang an die Düse am oberen Rand der Säule an.
- Schneiden Sie zwei 3 cm dicke kreisförmige Schaumstoff-Isolierstecker (den gleichen Umfang wie die Öffnung des innersten Fachs der Säule). Stellen Sie sicher, dass die Stecker eng anliegen und die innerste Säule versiegeln, wenn sie an beiden Enden eingesetzt wird (Abbildung 1B).
- Pierce ein Loch durch die Mitte eines der Stecker und Gewinde das nackte Ende eines Thermoelements durch das Loch ca. 5 cm und mit Klebeband sichern. Schließen Sie das andere Ende des Thermoelements an einen Thermoelement-Datenlogger an.
- Schließen Sie den Thermoelement-Datenlogger an den Computer an.
- Keil zwei Stücke Von Kunststoff-Dachrinne-Schutz (5 cm x 7 cm, mit Öffnungen von 0,5 cm Durchmesser) in der Säule, um als Perching-Material zu funktionieren. Platzieren Sie ein Stück Wache 2/3rds von der Oberseite der Spalte und die andere 1/3rd von der Oberseite der Spalte (Abbildung 1B).
- Befestigung des unteren Steckers (ohne Thermoelement) und des oberen Steckers (mit Thermoelement). Wenn der Stecker oben in der Säule eingesetzt wird, stellen Sie sicher, dass das Thermoelement die Seiten der Säule nicht berührt.
- Passen Sie die Höhe der Säule auf dem Retortenständer so an, dass ein Abstand von 25 cm zwischen der Unterseite der Säule und der Bankspitze besteht.
- Befestigen Sie einen Retortenring (5 cm Durchmesser) am Retortenständer 5 cm unterhalb der Unterseite der Säule und drehen Sie den Ring zur Seite der Säule.
- Stellen Sie den DFM direkt auf den Retortenring (Abbildung 1B). Schließen Sie alle elektronischen Komponenten an: das Netzteil, die Stromversorgungsschnittstelle und den Computer gemäß dem Herstellerprotokoll.
- Sobald die Komponenten angeschlossen sind, folgen Sie dem Herstellerprotokoll, um die Einrichtung der DFM- und DFM-Software abzuschließen.
- CtMin Probe
- Drehen Sie die Ein- und Ausgangsventile des Fluidbades in die offenen Positionen.
- Drücken Sie den Ein-/Ausschalter, um das temperaturgeregelte Flüssigkeitsbad einzuschalten, und drücken Sie dann die Play-Taste, um ein Programm auszuführen, das die Temperatur des Bades auf 25 °C erhöht und aufrechterhält. Geben Sie das Flüssigkeitsbad und die Säule 5-10 min, um 25 °C zu erreichen und zu halten.
- Entfernen Sie den Stecker an der Oberseite der Säule und ersetzen Sie ihn durch einen Trichter (5,08 cm Durchmesser; siehe Abbildung 1C).
- Tippen Sie fliegen von ihrer Nahrungsflasche in die Säule.
- Entfernen Sie den Trichter und ersetzen Sie ihn schnell durch den oberen Stecker, achten Sie darauf, dass fliegen nicht entweichen. Geben Sie den Fliegen 5 min, um sich niederzulassen, und tippen Sie gelegentlich auf den unteren Stecker, um die Fliegen zum Klettern zu ermutigen.
- Drücken Sie den Startknopf am Flüssigkeitsbad und starten Sie das CTmin Ramping Programm (25 °C für 5 min; 25 °C bis 10 °C bei 0,5 °C/min; 10 °C für 2 min; dann 10 °C bis -10 °C bei 0,25 °C/min).
ANMERKUNG: Je nach Forschungsfrage können weitere Varianten diesesCT-Min-Ramping-Protokolls verwendet werden (z. B. Vergleiche der Auswirkungen unterschiedlicher Rampingraten auf CTmin28). - Klicken Sie auf die Thermoelement-Aufnahmesoftware auf dem Computer und klicken Sie dann auf das Aufnahmesymbol, um die Temperatur in der Spalte jede Sekunde für die Dauer des Assays aufzuzeichnen. Stellen Sie sicher, dass jede Temperaturaufzeichnung einen für den zweiten Zeitstempel spezifischen Zeitstempel enthält, damit Temperaturdaten später mit Daten aus dem DFM zusammengeführt werden können.
- Fügen Sie 5 ml 90% Ethanol in ein 15 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr und legen Sie es in ein Rack unter der Säule.
- Gelegentlich tippen Sie auf den unteren Stecker der Säule, um alle Fliegen auf der Unterseite zum Klettern zu locken. Die meisten Fliegen werden auf einem Barsch oder in der Nähe der Oberseite der Säule um 15 °C sein.
- Bei 15 °C den unteren Stecker entfernen und alle Fliegen noch auf dem unteren Stecker im Ethanol sammeln. Zählen sie und beachten Sie, dass diese Fliegen bei 15 °C gesammelt wurden, aber ihr CTmin ist unbekannt.
HINWEIS: Die Temperatur, bei der der untere Stecker entfernt wird, sollte vor dem Test und basierend auf dem vorhergesagtenCT-Min der Testart oder -behandlung festgelegt werden. Für diesen Test wurden 15 °C auf der Grundlage desCT-Min dieser speziellen DGRP-Linien in vorläufigen Assays ausgewählt. - Legen Sie einen 75 mm Außendurchmesser Glastrichter in den DFM. Passen Sie Retortenring, DFM und Trichter so an, dass sie sich unter der Spalte befinden. Stellen Sie sicher, dass die Lippe des Trichters den Unteren Rand der Säule vollständig versiegelt (Abbildung 1D).
- Stecken Sie den Unteren des Trichters in das 15 ml Sammelrohr (Abbildung 1D).
- Öffnen Sie die DFM-Software auf dem Computer, indem Sie auf das Softwaresymbol klicken. Die Software wird sofort mit der Aufzeichnung der Uhrzeit/des Datums beginnen, zu der fliegen ihren CTminerreicht. Fliegen, die ihre CTmin erreichen, verlieren die neuromuskuläre Funktion und fallen von ihren Barschen, und danach durch den DFM.
- Überwachen Sie, ob alle Fliegen ihre CTmin erreicht haben, da die Temperatur abnimmt, indem Sie den oberen Stecker und Barsche überprüfen, um zu sehen, ob fliegen noch thront (d. h. noch die neuromuskuläre Funktion beibehalten). Der Prozess endet, wenn alle Fliegen ihre CTminerreicht haben.
- Passen Sie am Ende der Testversion den DFM an und trichtern Sie von der Spaltenöffnung weg. Einige Fliegen können ihren CTmin erreichen, bleiben aber in der Säule stecken (d.h. in einem Barsch eingekeilt oder baumelnd durch einen einzigen Tarsalhaken). Öffnen Sie den oberen Stecker und entfernen Sie diese Fliegen. Die CTmin dieser Fliegen ist unbekannt.
- Kombinieren Sie die .txt-Ausgabedateien aus der Thermoelement-Aufnahmesoftware (d. h. Temperatur, Datum und Uhrzeit) und der DFM-Software (d. h. Anzahl der Fliegen durch den Trichter, das Datum und die Uhrzeit) mit dem Befehl Zusammenführen in RStudio. Führen Sie die beiden Dateien basierend auf der freigegebenen Datums-/Uhrzeitvariablen zusammen.
2. Hochdurchsatz-Wärme KD-Assay
- Vorrichtungsmontage und -vorbereitung
- Mit einem Klebstoff das Stahlgewebdrahtgitter (Ca. 1,5 mm Blende) an der Unterseite einer 96-Gutbodenplatte befestigen.
- Befestigen Sie Magnete an den gegenüberliegenden Seiten der Unterseite einer 96 gut bodenfreien Platte mit einer Heißklebepistole und Heißkleber (Abbildung 3).
- Um einen benutzerdefinierten Septumdeckel mit Klebefolie für 96 Brunnenplatten herzustellen, kleben Sie zwei Folien klebrige Seiten zusammen, um eine gerittene Kunststofffolie zu bilden.
- Legen Sie die Kunststoffplatten über die 96-Well-Platte und verwenden Sie Klebeband, um sie an allen vier Seiten der Platte zu befestigen. Über die Öffnung zu jedem Brunnen auf der Platte, schneiden Sie ein 'x' in der Kunststofffolie mit einem Kastenschneider (d.h. 96 insgesamt x's).
- Fliegen mit CO2 anästhesieren und einzeln in jeden Brunnen der modifizierten 96-Bodenplatte mit Aspirator und Septumdeckel laden. Entfernen Sie den Septumdeckel von der 96-Well-Platte, während die Fliegen mit CO2 betäubt werden, und ersetzen Sie ihn durch einen eng anliegenden klaren Deckel.
- Legen Sie die 96 gut bodenfreie Platte mit Fliegen beladen und mit einem klaren dicht sitzenden Deckel auf das Essen. Stellen Sie sicher, dass die2 Fliegen zwischen der CO2-Anästhesisierung und dem Beginn des Assays mindestens 48 h haben (Schritte 2.2.1-2.2.5).
HINWEIS: Der Boden der modifizierten 96 Well No-Bottom Platten ist aus Mesh, so fliegen mit CO2 beästhestisiert kann geladen werden und auf Nahrung für mindestens 48 h, bevor eine Studie beginnt. Jeder Kunststoffbehälter >8,5 cm breit x 13 cm lang, der mindestens 2 cm tief ist, um eine 1 cm tiefe Schicht von Lebensmitteln aufzunehmen, kann verwendet werden. - Befestigen Sie eine Webcam an der Unterseite der Innenseite eines temperaturgeregelten Inkubators mit Klebeband. Richten Sie die Kamera direkt nach oben (Abbildung 4). Befestigen Sie ein Inkubatorregal ca. 10 cm über der Kamera.
HINWEIS: Die Webcam zeigt nach oben und zeichnet die 96 Well-Platte von unten auf, um sicherzustellen, dass ein möglichst großer Teil der Brunnenoberfläche sichtbar ist (z. B. nicht von den Brunnenwänden der Platte aus dem Blickfeld herausgehalten). Wenn die Fliegen ihren KDT erreichen, fallen sie auf den Grund des Brunnens; in diesem Fall die Seite am nächsten an der Webcam, und sind daher im Blick, unabhängig davon, wie weit ihr Brunnen von der Mitte der Ansicht ist. - Verbinden Sie die Webcam mit einem Computer.
- Mit Klebeband, befestigen Sie ein weißes Blatt Papier (8,5 cm x 13 cm; die genaue Fläche der Unterseite der 96 Well Platte) an der Unterseite des Regals(Abbildung 4). Stellen Sie sicher, dass das Papier den gesamten Rahmen füllt, wenn es über die Webcam angezeigt wird.
- Legen Sie eine Lichtquelle in den Inkubator. Verwenden Sie Papier oder andere Materialien, um die Beleuchtung zu dämpfen und Blendung zu minimieren.
ANMERKUNG Schritt 2.1.10 ist spezifisch für jeden Inkubator, da Beleuchtung und Reflexionen zwischen Inkubatoren variieren. Das Ziel ist es, genügend Beleuchtung im Inkubator zu haben, um einen guten Kontrast zwischen den Fliegen in jedem Brunnen und dem weißen Blatt Papier hinter der Platte zu bieten, wenn man es mit der Webcam betrachtet.
- Durchführung des KD-Testes
- Stellen Sie den Inkubator auf 37,5 °C und warten Sie etwa 30 min, um dem Inkubator Zeit zu geben, um die gewünschte Temperatur zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Die genaue Temperatur hängt davon ab, ob das Insekt bewertet wird und andere Zeitüberlegungen.
- Legen Sie die 96-Well-Platte invertiert in den Inkubator, so dass die Unterseite der Platte (Netzseite) gegen das weiße Papier auf der Unterseite des Fachs ist (Abbildung 4). Beachten Sie die Ausrichtung der Brunnen (Spalten- und Zeilennamen) auf dem Tablett und im Rahmen der Webcam. Farbiges Klebeband an den Seiten der 96-Well-Platte und die Ränder des weißen Blattes Papier können die Ausrichtung überprüfen (Abbildung 4).
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Inkubatortemperatur mit der Temperatur innerhalb der 96-Well-Platte übereinstimmt, indem Sie die Temperatur im Inneren der Platte mit einem Thermoelement während eines Testversuchs des KD-Testes der Wärme aufzeichnen. Es ist auch ratsam zu überprüfen, ob es eine vernachlässigbare Temperaturschwankungen zwischen den Brunnen der 96-Well-Platte mit mehreren Thermoelementen gibt, bevor der Wärme-KD-Test durchgeführt wird. - Schließen Sie die Inkubatortür.
- Klicken Sie auf die Videoaufzeichnungssoftware auf Aufzeichnen.
- Nach 2 h, überprüfen Sie die Aufnahme, um zu sehen, dass alle Fliegen ihren letzten Ruheplatz erreicht haben und aufhören, sich zu bewegen. Sobald sich alle Fliegen nicht mehr bewegen, klicken Sie auf Stopp in der Videoaufzeichnungssoftware. Für die hier getesteten Genotypen, die bei 25 °C aufgezogen werden, erreichen die meisten Fliegen ihr KDT um 60 min bei 37,5 °C (siehe auch J.R.nensen et al.9).
- Entsorgen Sie die Fliegen.
- Verwenden Sie die benutzerdefinierten Python-Skripte (Supplementary Coding Files 1-3), um die Zeit im Video anzunähern, wenn Fliegen ihre Hitze KDT erreichen.
HINWEIS: Schritt 2.2.7 ist optional. Um die Videoanalyse zu beschleunigen, wurden eine Reihe benutzerdefinierter Python-Skripte entwickelt, um Änderungen der Pixeldichte im Laufe der Zeit in jedem Bohrwert zu messen (siehe Ergänzende Codierungsdatei). Wenn sich die Fliegen nicht mehr bewegen, ist die Pixeldichte konstant, und ein Diagramm dieser Daten kann verwendet werden, um die ungefähre Zeit im Video zu lokalisieren, wenn Fliegen niedergeschlagen werden. Während es möglich sein kann, dieses Skript zu verwenden, um die Datenanalyse zu automatisieren, führen derzeit leichte Unvollkommenheiten im Video zu geringfügigen Abweichungen zwischen Änderungen der Pixeldichte und der tatsächlichen KD-Zeit. - Klicken Sie auf die Videodatei öffnen und die KDT jeder Fliege in jedem Brunnen aufzeichnen. Das beständigste Maß für die Hitze KDT zwischen Versuchs- und Beobachtern ist die Aufzeichnung der Zeit, zu der eine Fliege ihren letzten Ruhepunkt erreicht.
- Verfolgen Sie das Video rückwärts, konzentrieren Sie sich auf einen einzelnen Brunnen und notieren Sie die Zeit, zu der sich die Fliege zuerst von ihrem letzten Ruheplatz entfernt. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Brunnen.
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Representative Results
Die thermischen Grenzwerte (d.h. CTmin und Wärme KDT) von Weibchen aus dem Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel (DGRP) wurden gemessen, um die hochdurchsatzbasierten Daten zu demonstrieren, die aus den beiden beschriebenen Protokollen generiert wurden. CTmin wurde anhand der DGRP-Linien 714 (n = 37) und 913 (n = 45) geprüft. Heat KDT wurde untersucht und mit den DGRP-Linien 189 (n = 42) und 461 (n = 42) verglichen, und Videodateien wurden manuell analysiert. Die Gesamtzeit der Experimente, einschließlich des Ansehens des Videos, dauerte <2 h für jedes Protokoll.
Frauen aus der DGRP-Linie 913 wiesen deutlich niedrigere mittlereCT-Min-Temperaturen auf als Frauen aus der DGRP-Linie 714(Abbildung 5A; Wilcoxon-Rangsummentest, W = 1585, P < 0,001). Die beiden Linien hatten deutlich unterschiedliche Verteilungen von CTmin:Linie 913 hatte eine CTmin von 5,00 ± 1,35 °C (mittel± SD) und Linie 714 hatte eine CTmin von 9,60 ± 1,53 °C.
Die Wärme-KDT bei 37,5 °C unterschied sich zwischen den Weibchen der DGRP-Linien 73 und 461 erheblich(Abbildung 5B; Wilcoxon-Rangsummentest, W = 1658,5, P < 0,001). Obwohl es Unterschiede in der KDT beider Linien gab, wurden Unterschiede in Wärme-KDTs zwischen den Leitungen leicht erkannt. Die Linie 73 hatte einen durchschnittlichen KDT-Wert von 14,8 min als die Linie 461 (Linie 73 bedeutet KDT, 55,58 ± 6,92 min; Linie 461 bedeutet KDT, 40,78 ± 6,64 min).
Abbildung 1: Einrichten der Ummantelungssäule für den CTmin Assay. (A) Montierte Ummantelernsäule. (B) Jackensäule mit oberen und unteren Steckern, die die Innenkammer abdichten. Das Thermoelement wird durch ein Loch im oberen Stecker eingefädelt. Der DFM wird an einem Retortenring unterhalb der Säule montiert und zur Seite verschoben. (C) Beginn eines CTmin Assays. Der obere Stecker wurde entfernt und Fliegen wurden über einen Trichter an der oberen Öffnung der Säule in die Innenkammer gegossen. (D) Jacked Säule und DFM während eines CTmin Assay. Der untere Stecker wurde aus der Spalte entfernt und dFM und Trichter wurden unterhalb der Spalte positioniert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Technische Abbildung der ummantelten Säule. (A) Jedes Stück Acrylschläuche wird auf Die Länge geschnitten: i) zwei Abstandsringe, die auf 3,5 cm Länge geschnitten sind (Schritt 1.1.2):ii). der breiteste Acrylschlauch, der auf 31,5 cm geschnitten ist (Schritt 1.1.1); und iii die schmalsten Acrylschläuche auf 31,5 cm geschnitten (Schritt 1.1.1). (B) Zwei Löcher (in grau) in das breiteste Stück Acrylschläuche gebohrt, 3,5 cm von jedem Ende und an gegenüberliegenden Seiten (i; Schritt 1.1.2). Montage des schmalsten Acrylschlauchs mit den beiden Abstandsringen (ii; Stufen 1.1.6 und 1.1.7). (C) Die fertige Ummantelersäule nach den Schritten 1.1.8-1.1.12. Schlauchadapter sind grau gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Untere (links) und obere (rechte) Ansicht der 96-Gut-Bodenplatte. Stahlgewebe geweben ist an der Unterseite einer modifizierten 96 gut Bodenplatte befestigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Inkubator-Setup für einen Heat-KD-Test. (A) Webcam und Bühne in der Ferne eingerichtet. (B) Webcam und Bühneneinrichtung im Inkubator, bevor ein Test beginnt. Die Webcam ist auf dem Boden des Inkubators befestigt und das Tablett ist 10 cm über der Webcam. (C) Ausrichtung der 96-Wellplatte auf der weißen Bühne über der Webcam während eines Heat KD-Assays. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Untere und obere thermische Grenzwerte ausgewählter Linien aus dem Drosophila Genetic Reference Panel (DGRP). (A)CT-Min-Werte von zwei DGRP-Linien. (B) Erhitzen Sie KDT von zwei DGRP-Leitungen bei 37,5 °C. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Aktivitätsausgabe aus den Videoanalyseskripts eines Test-Datasets. Jedes Diagramm stellt die Aktivitätsdaten aus einem Brunnen einer 96-Well-Platte dar. Insgesamt wurden 84 Proben getestet und werden gezeigt. Well ID ist auf der rechten Seite jedes Histogramms gekennzeichnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Codierungsdatei 1. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 2. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Codierungsdatei 3. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Die beiden oben beschriebenen Methoden erzeugen Hochdurchsatzdaten ökologisch relevanter Metriken für obere und untere thermische Grenzwerte. Diese Protokolle bauen auf bereits etablierten Methoden auf, die für die Erforschung von Insektengrenzwerten üblich sind (zusammengefasst in Sinclair et al.) 6.Beide Protokolle können in kurzer Zeit (jeweils 2 h) abgeschlossen werden, erstellen Datensätze mit großen Stichprobengrößen, opfern keine Wiederholbarkeit oder Genauigkeit und minimieren Experimentierfehler, indem sie manuelle Datenaufzeichnung und -eingabe (CTmin assay) eliminieren oder Backup-Videoaufzeichnungen jedes Assays erstellen (Heat KD-Test).
Repräsentative Ergebnisse wurden durch den Vergleich der thermischen Grenzwerte erwachsener Frauen aus ausgewählten Linien der DGRP24erzielt. Beide Assays zeigten signifikante Unterschiede in der thermischen Toleranz zwischen den Linien. Die Effektgröße zwischen den Linien in jedem dieser Assays war relativ groß, was wiederum eine zuverlässige Differenzierung von Gruppen mit visuellen und statistischen Vergleichen ermöglichte. Der große Unterschied in KDT zwischen den beiden DGRP-Linien zeigt einen potenziellen Vorteil eines statischen Assays gegenüber einem dynamischen Ramping-Assay; statische Assays sind möglicherweise besser in der Lage, kleinere Unterschiede zwischen Gruppen zu erkennen als dynamische Assays9. Die beiden DGRP-Linien, die dem Wärme-KD-Assay unterzogen wurden, unterschieden sich im mittleren KDT um 14,8 min. Als Referenz zeigten Rolandi et al.13 anhand eines dynamischen Rampenprotokolls, dass die Differenz der höchsten und niedrigstenCT-Höchstwerte von 34 DGRP-Leitungen nur 1,42 °C oder <6 min mit einer 0,25 °C/min Rampe betrug.
Im Vergleich zu anderen Methoden gibt es mehrere Vorteile sowohl für den CTmin Assay als auch für den hier beschriebenen Wärme-KD-Assay. Die automatisierte Zählung imCT-Min-Assay reduziert die Zeit, die ein Experimentator am Gerät verbringt, wodurch die Zeit, die für andere Aufgaben aufgewendet werden kann, erhöht wird. Die Kosten für den Bau der Acryl-Jackensäule betragen 50 USD, verglichen mit den geschätzten 400 USD für den Kauf einer maßgeschneiderten Glasmantelsäule. Für den Heat KD-Assay eliminiert die Videoaufzeichnung die Notwendigkeit direkter Beobachtungen in Echtzeit und belegt eine kleine Menge an physischem Raum pro Probe. Andere Protokolle, wie die, die von J.9verwendet werden, verwenden ein großes Aquarium, um Personen zu betrachten, die in separate Fläschchen getaucht sind, aber diese Methode erfordert gut ausgebildete Forscher, um Fläschchen schnell auf Bewegung und eine große Menge an Platz für das Gerät zu überprüfen. Rolandi et al.13 verwendeten Infrarotsensoren, um Bewegungen oder Bewegungsmangel bei CTmax in 96 Wellplatten zu erkennen, während dieser Wärme-KD-Assay eine preiswerte Webcam (ca. 70) zur Erkennung von Bewegungen verwendet. Diese Kamera kann subtile Bewegungen erkennen, die von einem Infrarot-Aktivitätsmonitor übersehen werden können.
Darüber hinaus wurden eine Reihe von anpassbaren Skripten entwickelt, um KDT im Heat KD Assay schnell zu schätzen (Supplementary Coding File 1-3). Diese Skripte können verwendet werden, um Zeit zu sparen, indem eine grobe Annäherung der Wärme KDT in jedem Well vor dem Ansehen des Videos erhalten, und mit höherer Videoqualität könnten diese Skripte möglicherweise die Datenaufzeichnung automatisieren. Drei Skripte zur Verarbeitung des Videos wurden zur Verfügung gestellt: FirstFrame.py (Supplementary Coding File 1), die den ersten Bildrahmen des Videos definiert; WellDefine.py (Supplementary Coding File 2), die jeden einzelnen Brunnen der 96-Well-Platte im ersten Bildrahmen definiert; und MotionDetect.py (Supplementary Coding File 3), die die Videodatei in ein Aktivitätssignal transformiert, indem die Änderung der Pixeldichte zwischen sequenziellen Frames berechnet wird. Die einzige Eingabe für das Programm ist die Videodatei, und die Ausgabe enthält Zusammenfassende Statistiken und ein Zeitreihen-Dataset der Aktivität pro Brunnen (Abbildung 6). Unterschiede in der Pixeldichte zwischen Videoframes werden mithilfe eines Graustufenfilters transformiert, um Bildabmessungen zu reduzieren, eines Gaußschen Tiefpassfilters zur Reduzierung von Bildrauschen und einer morphologischen Dilatation, um die Grenzen sich bewegender Objekte zu vergrößern. In diesem Fall ist die Aktivität definiert als die absolute Differenz der Pixelwerte zwischen sequenziellen Frames. Die Wärme-KDT kann dann als Index des letzten Frames geschätzt werden, der einen Aktivitätswert größer als Null enthält. Beispielsweise lag der Rahmen, in dem die Aktivität zuletzt in gut g12 eines Beispieldatensatzes aufgezeichnet wurde (Abbildung 6), kurz nach 2.000 s (33,33 min), wie durch eine flache Linie angegeben. Ein Beobachter kann dann das digitale Video wiedergeben und mit diesem Zeitstempel schnell die Heat KDT von well g12 finden.
Mit kleineren Modifikationen und Fehlerbehebung gibt es zusätzliche Anwendungen für beide Assays, vor allem mit dem Wärme-KD-Assay. Das Setup für Videoaufzeichnungen kann geändert werden, um statische Kaltausfallzeiten, Kühlkoma-Wiederherstellungszeit oder potenziell dynamische CTmax- undCT-Min-Werte aufzuzeichnen. Chill-Coma-Erholungszeit ist die Zeit, die eine Person braucht, um die Bewegung nach Kältestress wieder aufzunehmen29. Daher könnte die Kühlkoma-Wiederherstellungszeit mit diesem Setup gemessen werden, indem man Chill Koma in die 96-Well-Platte induzieren und dann das Video-Setup verwenden, um die Erholungszeit im Inkubator aufzuzeichnen. Schließlich konnte mit sorgfältiger Feinabstimmung dynamischeCTmax oder CTmin in einem programmierbaren Rampen-Inkubator aufgenommen werden. Eine sorgfältige Aufmerksamkeit auf die Temperatur in jedem der 96 Brunnen wäre ein Problem, da leichte Temperaturschwankungen im Inkubator zwischen den Brunnen vergrößert werden könnten, wenn sich die Temperatur ändert.
Bei der Durchführung des CTmin oder des KD-Wärme-Assays sind mehrere Überlegungen zu berücksichtigen. In erster Linie können die Qualität, das Alter, das Geschlecht, das Lebensstadium, der genetische Hintergrund und die vorangegangene Erfahrung eines Insekts die thermischen Grenzen6,13,30,31beeinflussen. Für beide Tests müssen die Probanden motil sein. Zweitens kann für jedenCT-Min-Gerät jeweils nur eine Gruppe geprüft werden. Daher müssen Variablen wie die tagesweise Variation der thermischen Toleranz32,33 beim Vergleich von Behandlungen berücksichtigt werden. Eine Lösung für dieses Problem besteht darin,CT-Min-Assays mehrerer Behandlungsbedingungen mit mehreren Geräten gleichzeitig durchzuführen. Drittens sind einige Arten möglicherweise nicht für einen oder beide Assays geeignet. Zum Beispiel können einige Arten nicht ohne weiteres klettern oder fliegen zu Barsche in der CTmin assay oder kann die Aktivität bei hohen Temperaturen vor ihrer Hitze KDT erreicht, was es schwierig machen würde, eine Knockdown-Zeit zu erkennen. Um genaue Vergleiche im KD-Wärmetest zu gewährleisten, ist es entscheidend, dass die Kriterien für KDT (Schritt 2.2.8) zwischen Replikationen, Beobachtern, Versuchen usw. konsistent sind. Um verschiedenen Insektenarten entgegenzukommen, können Änderungen an beiden Prüfgeräten erforderlich sein. Mögliche Modifikationen umfassen die Verwendung verschiedener Arten von Barschen für den CTmin Assay, die Verwendung von Zellkulturplatten mit weniger Brunnen und mehr Platz (48, 24, 12 oder 6 Brunnen) anstelle der 96 Brunnenplatte, um größere Insekten aufzunehmen, oder die Einstellung der für den KD-Wärmetest verwendeten Temperatur, um eine nicht zu schnelle oder zu langsame Knockdown-Zeit zu gewährleisten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Ellie McCabe für die Unterstützung bei der Fliegenzucht. Diese Arbeit wird vom United States Department of Agriculture National Institute of Food and Agriculture Hatch Project Grant 1010996 und National Science Foundation Grant OIA-1826689 an N.M.T. unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ARCTIC A40 Refrigerated fluid circulator (Programable teperature ramps) | Thermo Scientific; Waltham, MA | 153-5401 | |
| C922 Pro Stream Webcam | Logitech; Newark, CA | 960-001087 | |
| Circular adjustable steel clamp – 5.08 cm to 7.62 cm | Any | Any | |
| Clear acrylic tubing – 5.7 cm x 5.1 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44036 | |
| Clear acrylic tubing – 6.35 cm x 5.7 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 440515 | |
| Clear acrylic tubing – 7 cm x 6.35 cm x 0.3 cm | United States Plastic Corp., OH | 44041 | |
| Clear silicone sealant | Any | Any | |
| Collection tube (15 ml) | Any | Any | |
| Cordless Drill | Any | Any | |
| Drosophila Funnel Monitor (DFM) | TriKinetics; Waltham, MA | DFM | Used to count the number of flies that fall through the funnel at a given time point |
| DAM data collection software | TriKinetics; Waltham, MA | Records data input from the DFM | |
| Fly Storage Lid | FlySorter; Seatle, WA | FS-96LID-5PK | Used to load flies into the storage plate for the sCTmax assay |
| Fly Storage Plate | FlySorter; Seatle, WA | FS-96PLATE-5PK | Used to hold flies during in the sCTmax assay |
| Fly Food Tray | FlySorter; Seatle, WA | FS-TRAY-5PK | Used to keep flies on food after loading into the 96-well plate until the sCTmax assay |
| Glass funnel | Kimax | 28950-75 | 75mm |
| Gutter guard | Any | Any | ~0.5 cm diameter openings |
| Hacksaw | Any | Any | |
| Heratherm Thermo Scientific incubator | Thermo Scientific; Waltham, MA | OMS100 | |
| Hose nylon adapters (2) – ¼ MNPT x 3/8 | United States Plastic Corp., OH | 61135 | |
| Hot glue gun and glue | Any | Any | |
| Light Source | Any | Any | |
| Magnets | Any | Any | |
| OMEGA TC-08 Recorder and TC-08 Player Software | OMEGA; Norwalk, CT | ||
| OMEGA thermocouple (Type T) | OMEGA; Norwalk, CT | 5LRTC-TT-K-20-36 | |
| Plastic funnel | Any | Any | 2" diameter |
| Plastic tubing - 0.6 cm diameter | United States Plastic Corp., OH | 62852 | |
| Retort ring | Any | Any | 2" diameter |
| Retort stand | Any | Any | |
| Retort three-prong clamp | Any | Any | |
| Rstudio | |||
| Serial port connector (PSIU9) | TriKinetics; Waltham, MA | PSIU9 | Intermediate connection between the DFM and computer, allows for multiple DFM connections |
| Styrofoam (2" thick) | Any | Any | |
| Tape | Any | Any | |
| Uninterrupted Power Supply (PS9-1) | TriKinetics; Waltham, MA | PS9-1 | Power supply for the DFM and PSIU9 |
| Weld-on #4 Acrylic Cement | United States Plastic Corp., OH | 45737 |
References
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