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Neuroscience

माउस भ्रूण स्टेम सेल इन विट्रो से न्यूरोनल भेदभाव

Published: June 2, 2020 doi: 10.3791/61190
Automatic Translation
*1, *2
1Wuhan Center for Disease Control and Prevention, 2College of Life Science and Health, Wuhan University of Science and Technology
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हमने एक कम लागत और काम करने में आसान विधि की स्थापना की जो भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं से न्यूरॉन्स में तेजी से और कुशल भेदभाव का निर्देश देती है। यह विधि प्रयोगशालाओं के बीच लोकप्रियकरण के लिए उपयुक्त है और न्यूरोलॉजिकल अनुसंधान के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

Abstract

माउस भ्रूणस्टेम कोशिकाओं (mESCs) का तंत्रिका भेदभाव न्यूरोजेनेसिस में शामिल प्रमुख तंत्र को स्पष्ट करने और पुनर्योजी दवा में संभावित सहायता के लिए एक संभावित उपकरण है। यहां, हमने संयोजन स्क्रीनिंग की रणनीतिका उपयोग करके, विट्रो में एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक कुशल और कम लागत विधि स्थापित की। यहां परिभाषित शर्तों के तहत, 2 दिवसीय भ्रूण शरीर गठन + 6 दिन रेटिनोइक एसिड प्रेरण प्रोटोकॉल एमसीसी से तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में तेजी से और कुशल भेदभाव की अनुमति देता है, जैसा कि अच्छी तरह से खड़ी और न्यूराइट-जैसे A2lox और १२९ डेरिवेटिव के गठन से देखा जाता है जो नेस्टिन पॉजिटिव हैं । भ्रूणीय शरीर की स्वस्थ स्थिति और उस समय बिंदु जिस पर रेटिनोइक एसिड (आरए) लागू किया जाता है, साथ ही आरए सांद्रता, इस प्रक्रिया में महत्वपूर्ण हैं। एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव में, N2B27 मध्यम II (न्यूरोबेसल माध्यम द्वारा पूरक) न्यूरोनल कोशिकाओं के दीर्घकालिक रखरखाव और परिपक्वता का बेहतर समर्थन कर सकता है। प्रस्तुत विधि अत्यधिक दक्षता, कम लागत और काम करने में आसान है, और न्यूरोबायोलॉजी और विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।

Introduction

भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएसएसी) बहुलक हैं और तंत्रिका अग्रदूत कोशिकाओं (एनपीसी) में अंतर कर सकते हैं और बाद में कुछ शर्तों के तहत न्यूरॉन्स में अंतर कर सकते हैं1। ईएससी-आधारित न्यूरोजेनेसिस न्यूरोजेनेसिस की नकल करने के लिए सबसे अच्छा मंच प्रदान करता है, इस प्रकार विकासात्मक जीव विज्ञान अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा रत है और पुनर्योजी दवा2,3में संभावित सहायता करता है। पिछले दशकों में, भ्रूणीय न्यूरोजेनेसिस को प्रेरित करने के लिए कई रणनीतियों की सूचना दी गई है, जैसे ट्रांसजेनिक विधि4,छोटे अणुओं का उपयोग करके5, 3डी मैट्रिक्स माइक्रोएनवायरमेंट6का उपयोग करके, और सह-संस्कृति तकनीक7। हालांकि, इनमें से अधिकांश प्रोटोकॉल या तो सीमित स्थिति हैं या काम करना मुश्किल है, इस प्रकार वे अधिकांश प्रयोगशालाओं में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं हैं।

एमईसी से कुशल तंत्रिका भेदभाव प्राप्त करने के लिए एक आसान और कम लागत विधि खोजने के लिए, यहां एक संयोजन स्क्रीनिंग रणनीति का उपयोग किया गया था। जैसा कि चित्रा 1में वर्णित है, भ्रूण न्यूरोजेनेसिस की पूरी प्रक्रिया को 2 चरणों में विभाजित किया गया था। चरण 1 एमसी से एनपीसी में भेदभाव प्रक्रिया को संदर्भित करता है, और द्वितीय चरण एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव से संबंधित है । आसान ऑपरेशन, कम लागत, आसानी से उपलब्ध सामग्री और उच्च भेदभाव दक्षता के सिद्धांतों के आधार पर, चरण 1 में सात प्रोटोकॉल और द्वितीय चरण में तीन प्रोटोकॉल पारंपरिक अनुयायी मोनोलेयर संस्कृति प्रणाली या भ्रूण शरीर निर्माण प्रणाली8,9के आधार पर चुने गए थे। दोनों चरणों में प्रोटोकॉल की भेदभाव दक्षता सेल आकृति अवलोकन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। प्रत्येक चरण के सबसे कुशल प्रोटोकॉल के संयोजन के माध्यम से, हमने एमएससी से तंत्रिका भेदभाव के लिए अनुकूलित विधि स्थापित की।

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Protocol

1. माउस भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति

  1. 0.1% जिलेटिन कोटेड सेल संस्कृति व्यंजन या प्लेटें तैयार करें।
    1. 60 मिमी सेल संस्कृति व्यंजनों में 0.1% जिलेटिन (पानी में 0.1% w/v) के 2 एमएल जोड़ें। सेल संस्कृति व्यंजनों की भी कोटिंग सुनिश्चित करने के लिए धीरे-धीरे रॉक करें।
    2. व्यंजन को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और 1 घंटे के लिए कोटिंग की अनुमति दें।
    3. कोशिकाओं को सीडिंग करने से पहले 0.1% जिलेटिन समाधान निकालें।
      नोट: जिलेटिन को हटाने के बाद, कोटेड व्यंजन को सूखने या धोने की कोई आवश्यकता नहीं है।
  2. माउस भ्रूण स्टेम सेल (A2lox और 129) संस्कृति
    1. 0.1% जिलेटिन में इनक्यूबेट एमएससी (ए2लॉक्स और 129) कोशिकाएं क्रमशः 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर एमईसी विकास माध्यम में 60मिमी सेल संस्कृति व्यंजन लेपित करती हैं। एमईएससी ग्रोथ मीडियम में 85% नॉकआउट डीएमईएम/एफ12, 15% नॉक आउट सीरम रिप्लेसमेंट (केएसआर), 0.1 एमएम β-मर्केप्टोथेनॉल (2ME), 2 एमएम ग्लूटामैक्स, 1% गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (एनईएए), 1% पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी/एस), १००० यू/एमएल ल्यूकेमिया अवरोधक कारक (एलआईएफ), 10 एनएम चिर-99021 (जीएसके-3 अवरोधक) और ०.३३ एनएम पीडी0325901 (एमईके अवरोधक) ।
      सावधानी: β-मर्केप्टोथेन ज्वलनशील है और इसमें साँस लेना विषाक्तता है। अग्नि स्रोतों से दूर रहें और उपयोग करते समय साँस लेने से बचने के लिए मास्क पहनें।
    2. A2lox और 129 की बेहतर ग्रोथ के लिए रोजाना एमईएससी ग्रोथ मीडियम बदलें।
    3. जब कोशिकाएं 80% संगम तक पहुंचती हैं, तो माध्यम को हटा दें और पकवान में 0.1% ट्राइपसिन का 1 मिलियन एमएल जोड़ें। सभी कोशिकाओं पर ट्राइपसिन का कवर सुनिश्चित करने के लिए 30 एस के लिए धीरे-धीरे रॉक करें।
    4. कोशिकाओं को ट्रिप्सिनइज़ करने के लिए लगभग 1 मिनट तक छोड़ दें और फिर 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ट्राइप्सिन को हटा दें।
    5. एक एकल सेल निलंबन बनाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे, डिश के लिए mESC विकास माध्यम के 2 एमएल जोड़ें ।
    6. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके निलंबन में कोशिकाओं के घनत्व को यथासंभव सटीक रूप से गिनें।
    7. कोशिकाओं को 7 समूहों में विभाजित करें और तालिका 1में दिखाए गए विभिन्न प्रोटोकॉलों का उपयोग करके भेदभाव को प्रेरित करें।

2. एमईसी से एनपीसी (चरण 1) तक भेदभाव

  1. 0.1% जिलेटिन कोटेड सेल कल्चर प्लेट्स या कवरस्लिप तैयार करें।
    1. उपयोग से पहले, चरण 1.1 के रूप में 0.1% जिलेटिन कोटेड 6-वेल प्लेटें या कवरलिप तैयार करें।
  2. प्रोटोकॉल 1(तालिका1) का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम के 2 मिलील में लगभग 2 x10 4 एमसीसी बीज 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-वेल प्लेटों में अच्छी तरह से। माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिका घनत्व की जांच करें।
    2. 6 घंटे के लिए 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने के लिए लगाव के लिए अनुमति देते हैं।
    3. लगाव के बाद, इनक्यूबेटर से कोशिकाओं से बाहर निकालें, और पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं।
    4. प्रत्येक कुएं में बेसल विभेदन माध्यम I(टेबल 1)का 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को वापस इनक्यूबेटर में डाल दें।
    5. कोशिकाओं को 8 दिनों के लिए भेदभाव के लिए छोड़ दें। बेसल भेदभाव माध्यम मैं हर 2 दिन बदलें।
  3. प्रोटोकॉल 2(तालिका 1)का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम के 10 एमएल में एक गैर चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में 1.5 x 106 एमसीसी जोड़ें, मैं 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूणीय शरीर केगठन की अनुमति देता हूं।
    2. 2 दिनों के बाद, स्थानांतरण सेल 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में एकत्र होता है और उन्हें गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित होने देता है।
    3. सुपरनेट निकालें और भ्रूणीय निकायों को फिर से खर्च करने के लिए ताजा बेसल भेदभाव माध्यम के 10 एमएल जोड़ें। उन्हें एक नए गैर चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में फिर से लगाया जाए और 2 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति दें।
    4. माइक्रोस्कोप(चित्रा 2A)के तहत भ्रूण निकायों के गठन की जांच करें ।
    5. चरण 2.3.2-2.3.3 में वर्णित भ्रूण निकायों को ले लीजिए। बेसल भेदभाव माध्यम के 2 मिलील में लगभग 50 भ्रूण निकायों के बीज मैं प्रति अच्छी तरह से 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर।
    6. 1 एमएम ऑल-ट्रांस आरए स्टॉक (डीएमएसओ में) तैयार करें और सब-पैकेजिंग के बाद -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में प्रकाश से दूर स्टोर करें।
      नोट: आरए अस्थिर है, और आरए स्टॉक की तैयारी के दौरान इसे प्रकाश से दूर रखने और हवाई संपर्क को कम करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए।
    7. आरए इंडक्शन के लिए, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए प्रत्येक कुएं में आरए स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    8. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और अगले 4 दिनों के लिए अंतर करें।
    9. बेसल विभेदन माध्यम I (1 μM आरए के साथ) के पूरे 2 एमएल हर 2 दिन बदलें।
  4. प्रोटोकॉल 3(तालिका 1)का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम I के 10 एमएल में एक नॉन चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में 1.5 x 106 एमसीसी लगाएं। 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूणीय शरीर के निर्माण के लिए2 दिनों के लिए छोड़ दें।
    2. एक माइक्रोस्कोप(चित्रा 2B)के तहत भ्रूण निकायों के गठन की जांच करें ।
    3. स्थानांतरण सेल 15 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में एकत्र होता है और उन्हें गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित होने देता है।
    4. सुपरनेट को ध्यान से निकालें और उन्हें फिर से खर्च करने के लिए ताजा बेसल विभेदन माध्यम के 10 एमएल जोड़ें।
    5. बेसल भेदभाव माध्यम के 2 मिलील में लगभग 50 भ्रूण निकायों के बीज मैं प्रति अच्छी तरह से 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर।
    6. आरए इंडक्शन के लिए, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए प्रत्येक कुएं में आरए स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    7. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें और अगले 6 दिनों के लिए अंतर करें। हर 2 दिनों में पूरे बेसल भेदभाव माध्यम I (1 μM RA के साथ) बदलें।
  5. प्रोटोकॉल 4(तालिका 1)का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम के 2 मिलील के भीतर लगभग 2 x10 4 एमसीसी बीज मैं 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर अच्छी तरह से। 6 घंटे के लिए लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
    2. अटैचमेंट के बाद पीबीएस के 2 एमएल से दो बार सेल धोएं। प्रत्येक कुएं में बेसल विभेदन माध्यम I के 2 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में4 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति दें।
    3. आरए इंडक्शन के लिए, एक और 4 दिनों के लिए भेदभाव को प्रेरित करने के लिए प्रत्येक कुएं में ऑल-ट्रांस आरए स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें (काम करने वाली एकाग्रता 1 माइक्रोन है) ।
    4. पूरी प्रक्रिया में, हर 2 दिनों में पूरे माध्यम को बदलें।
  6. प्रोटोकॉल 5(तालिका 1)का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम के 2 मिलील के भीतर लगभग 2 x10 4 एमसीसी बीज मैं 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर अच्छी तरह से। 6 घंटे के लिए लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
    2. पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं। प्रत्येक कुएं में बेसल विभेदन माध्यम I के 2 एमएल जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में2 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति दें।
    3. बाद में आरए इंडक्शन के लिए, 1 माइक्रोन की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए प्रत्येक कुएं में आरए स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें। 6 दिनों के लिए भेदभाव को प्रेरित करने के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
    4. पूरी प्रक्रिया में, हर 2 दिनों में पूरे माध्यम को बदलें।
  7. चरण I प्रोटोकॉल 6(तालिका 1)का उपयोग करके भेदभाव करता है
    1. भ्रूणीय निकायों के निर्माण के लिए अनुमति देने के लिए N2B27 मध्यम II (तालिका1) के 10 एमएल में एक गैर चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में1.5 x 10 6एमसीएससी संयंत्र।
    2. 2 दिन, सेल समुच्चय को एकत्र करें जैसा कि चरण 2.3.2-2.3.3 में वर्णित है और ताजा N2B27 मध्यम II के 10 एमएल का उपयोग करके भ्रूण निकायों को फिर से उठाया जाता है।
    3. उन्हें एक नए गैर चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में फिर से लगाया जाए और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में एक और2 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति दें। माइक्रोस्कोप के नीचे भ्रूण निकायों के गठन की जांच करें।
    4. 4वें दिन, भ्रूण शरीर एकत्र करें। बीज के बारे में 50 भ्रूण निकायों प्रति अच्छी तरह से 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटें N2B27 मध्यम द्वितीय के 2 मिलीएल के साथ।
    5. प्रत्येक कुएं में ऑल-ट्रांस आरए स्टॉक के 2 माइक्रोन जोड़ें और एक और 4 दिनों के लिए भेदभाव को प्रेरित करें। हर दो दिन में पूरे माध्यम (N2B27 मध्यम II को 1 μM RA के साथ) बदलें।
  8. प्रोटोकॉल 7(तालिका 1)का उपयोग करके चरण I भेदभाव
    1. बेसल विभेदन माध्यम के 2 मिलील के भीतर लगभग 2 x10 4 एमसीसी बीज मैं 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर अच्छी तरह से। 6 घंटे के लिए लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।
    2. कोशिकाओं को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। फिर, प्रत्येक अच्छी तरह से N2B27 मध्यम II के 2 एमएल जोड़ें और 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 8 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति दें।
    3. हर 2 दिन में पूरे N2B27 मध्यम II को बदलें।

3. सेल आकृति विज्ञान अवलोकन

  1. एक उल्टे चरण कंट्रास्ट प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदिन उपरोक्त 7 समूहों की भेदभाव स्थिति की जांच करें।
  2. बेतरतीब ढंग से कम से कम 12 फ़ील्ड का चयन करें और डी 8 पर प्रत्येक समूह के रूपात्मक परिवर्तनों को रिकॉर्ड करने के लिए फ़ोटो लें।

4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. नमूना तैयारी: 0.1% जिलेटिन-लेपित कवरस्लिप पर बीज एमएससी और चरण 2 में उल्लिखित प्रोटोकॉल का उपयोग करके 8 दिनों के लिए भेदभाव की अनुमति देते हैं।
  2. कुल्ला: 8वें दिन, इनक्यूबेटर से नमूने बाहर ले और आकांक्षा द्वारा भेदभाव माध्यम को दूर। धीरे से 5 मिनट के लिए PBS के 1 एमएल के साथ एक बार कोशिकाओं कुल्ला ।
  3. फिक्सेशन: प्रत्येक नमूने में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड का 1 एमएल जोड़ें और कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए कोशिकाओं को ठीक करें।
  4. कुल्ला: निर्धारण के बाद, धीरे से 5 मिनट प्रत्येक के लिए, PBS 3 बार के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
  5. पारमेबिलाइजेशन: प्रत्येक नमूने में पीबीएस में 0.2% ट्राइटनएक्स-100 का 1 मिलियन मिलियन जोड़ें और आरटी में 8 मिनट के लिए छोड़ दें।
  6. कुल्ला: पार करने के बाद, धीरे से 5 मिनट प्रत्येक के लिए, 3 बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं कुल्ला ।
  7. ब्लॉकिंग: किसी भी गैर-विशिष्ट इंटरैक्शन को ब्लॉक करने के लिए प्रत्येक नमूने में पीबीएस में 10% बकरी सीरम का 1 मिलियन जोड़ें और 1 घंटे के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  8. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. पीबीएस में 5% बकरी सीरम का उपयोग करके 1:100 के अनुपात में एंटी-नेस्टिन एंटीबॉडी को पतला करें।
    2. विभिन्न नमूनों में पतला एंटीबॉडी के 500 माइक्रोन लागू करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट करें।
  9. कुल्ला: एंटीबॉडी निकालें और 8 मिनट प्रत्येक के लिए 3 बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ धीरे से नमूनों कुल्ला ।
  10. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेशन
    1. पीबीएस में 5% बकरी सीरम का उपयोग करके 1:500 के अनुपात में एलेक्सा फ्लोर 488-लेबल बकरी एंटी-माउस आईजीजी को पतला करें।
    2. विभिन्न नमूनों के लिए पतला एंटीबॉडी के 500 μL लागू करें और आरटी में 2 घंटे के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट।
      नोट: फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी लगाने के बाद, फ्लोरेसेंस शमन को रोकने के लिए अंधेरे में बाद के सभी चरणों को करें।
  11. कुल्ला: माध्यमिक एंटीबॉडी निकालें और प्रत्येक 8 मिनट के लिए 3 बार पीबीएस के 1 एमएल के साथ नमूनों को धीरे से कुल्ला।
  12. परमाणु धुंधला और बढ़ते
    1. दापी बढ़ते माध्यम की एक बूंद को साफ माइक्रोस्लाइड पर रखें।
    2. ध्यान से प्लेटों से नमूनों से बाहर ले और सेल चेहरे के साथ DAPI बढ़ते माध्यम के शीर्ष पर नमूना जगह नीचे । आरटी में 5 मिनट के लिए अंधेरे में छोड़ दें ।
    3. शोषक कागज के साथ अतिरिक्त DAPI बढ़ते माध्यम को हटा दें।
  13. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी अवलोकन
    1. नमूनों को फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के नीचे रखें और उचित फिल्टर का उपयोग करके DAPI और एलेक्सा फ्लोर 488 के लिए संकेत का पता लगाएं।
    2. समान रूप से और बेतरतीब ढंग से प्रत्येक नमूने के लिए 10-15 अलग-अलग दृश्य फ़ील्ड चुनें और छवियों को सीसीडी कैमरे के साथ रिकॉर्ड करें।

5. एनपीसी से न्यूरॉन्स (द्वितीय चरण) के लिए भेदभाव

  1. चरण 2.4 में विस्तृत प्रोटोकॉल 3 (8 दिन, टेबल 1)का उपयोग करके चरण 1 भेदभाव के तहत एमईएससी डेरिवेटिव तैयार करें, जिसमें सबसे अधिक भेदभाव दक्षता है (चित्र 3देखें)।
    नोट: चरण I भेदभाव के बाद, एक स्वस्थ और उच्च उपज एनपीसी सुनिश्चित करने के लिए, ऊपर उल्लिखित सेल आकृतिविज्ञान अवलोकन और इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करके गुणवत्ता नियंत्रण किया जाना चाहिए।
  2. बेसल भेदभाव माध्यम के 2 मिलील के भीतर बीज के बारे में 5 x 105 एमईसी डेरिवेटिव मैं 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों पर अच्छी तरह से। बेतरतीब ढंग से एमईएससी डेरिवेटिव को 3 समूहों में विभाजित करें, क्रमशः चरण II प्रोटोकॉल 1, प्रोटोकॉल 2 और प्रोटोकॉल 3 के रूप में।
  3. 6 घंटे के लिए लगाव के लिए अनुमति देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में प्लेट रखें। उन्हें पीबीएस के 2 एमएल के साथ दो बार धोएं।
  4. उपरोक्त समूहों के प्रत्येक कुएं में क्रमशः बेसल विभेदन माध्यम I, N2B27 मध्यम I और N2B27 मध्यम II(तालिका 2)के 2 एमएल जोड़ें।
  5. प्लेटों को इनक्यूबेटर में रखें और एक और 10 दिनों के लिए अंतर करने की अनुमति दें। हर 2 दिन में इसी माध्यम को बदलें।
  6. विभेदन स्थिति की जांच करें और चरण 3 में उल्लिखित रूपात्मक परिवर्तनों को रिकॉर्ड करें।
  7. 18 दिन, न्यूरॉन्स (β-तुबुलिन III सकारात्मक) की पीढ़ी का मूल्यांकन करें और चरण 4 में उपयोग करके 3 प्रोटोकॉल की भेदभाव दक्षता निर्धारित करें।

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Representative Results

2-दिवसीय भ्रूणीय शरीर निर्माण + 6 दिवसीय आरए इंडक्शन एनपीसी (चरण 1) में एमसी के भेदभाव को निर्देशित करने पर सबसे अच्छा काम करता है। एनपीसी (चरण 1) में एमसी के भेदभाव को बढ़ावा देने वाले इष्टतम प्रोटोकॉल का निर्धारण करने के लिए, A2lox और 129 एमसी(तालिका 1)दोनों पर 7 प्रोटोकॉल का परीक्षण किया गया था और हल्के माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक समूह की भेदभाव स्थिति की निगरानी की गई थी। जैसा कि चित्रा 3 एमें दिखाया गया है, "2-दिवसीय भ्रूणीय शरीर के गठन + 6-दिवसीय आरए इंडक्शन" उपचार (चरण I-प्रोटोकॉल 3) के तहत अधिकांश A2lox और 129 डेरिवेटिव अच्छी तरह से खड़ी और न्यूराइट-जैसे मॉर्फोलोजी दिखाए गए, जो एनपीसी के गठन का संकेत देते हैं। हालांकि, "4 दिन भ्रूण शरीर के गठन + 4 दिन आरए प्रेरण" उपचार (चरण I-प्रोटोकॉल 2) के साथ कोशिकाओं को गरीब और apoptotic स्थिति है, जो भ्रूण शरीर के भीतर पोषक तत्वों की कमी के कारण हो सकता है दिखाया । मोनोलेयर संस्कृति आरए प्रेरण (चरण I-प्रोटोकॉल 4 और 5) के साथ संयुक्त रूप से भी एमसी के भेदभाव को निर्देशित कर सकती है, जबकि न्यूराइट जैसी कोशिकाओं का अनुपात चरण I-प्रोटोकॉल 3 में उतना नहीं था। इस बीच, चरण I-प्रोटोकॉल 6 और 7 में अधिकांश A2lox और 129 डेरिवेटिव्स ने छोटे सेल निकायों को दिखाया और एपोप्टोसिस से गुजरने के लिए खड़ा किया, सुझाव दिया कि N2B27 मध्यम II भ्रूण न्यूरोजेनेसिस का प्रभावी ढंग से समर्थन नहीं कर सकता है।

एनपीसी के गठन की पुष्टि करने के लिए, प्रत्येक समूह में नेस्टिन + कोशिकाओं (एनपीसी के लिए मार्कर) का प्रतिशत इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख का उपयोग करके पाया गया । चित्रा 3बीमें, चरण I-प्रोटोकॉल 3 में नेस्टिन + कोशिकाओं का प्रतिशत सबसे अधिक था और क्रमशः 4.33% और 69.33 ± ± क्रमशः 2.33% और 129 डेरिवेटिव में 77.67 तक पहुंच गया। सामूहिक रूप से, चरण I-प्रोटोकॉल 3 एनपीसी में एमसी के भेदभाव को निर्देशित करने पर सबसे अच्छा काम करता है।

N2B27 मध्यम II सबसे प्रभावी रूप से एनपीसी से न्यूरॉन्स (चरण द्वितीय) में भेदभाव को प्रेरित कर सकता है। द्वितीय चरण के भेदभाव में तीन प्रोटोकॉल की जांच की गई । जैसा कि चित्रा 4 एमें दिखाया गया है, रूपात्मक अवलोकन से पता चला है कि द्वितीय चरण-प्रोटोकॉल 3 (N2B27 मध्यम II के साथ भेदभाव) में अधिकांश A2lox और 129 डेरिवेटिव 18 दिन तक स्पष्ट न्यूराइट्स और सेल बॉडी एक्सटेंशन के साथ सबसे लंबे समय तक न्यूरॉन जैसी संरचनाएं दिखाई दीं, जो न्यूरोजेनेसिस की कुशल घटना का संकेत देती हैं। इम्यूनोफ्लोरेसेंस ने न्यूरॉन्स की पीढ़ी की पुष्टि की, β-तुबुलिन III + कोशिकाओं के प्रतिशत के साथ 67.75 ± 4.01% और 58.73 ± क्रमशः 7.25%, A2lox में और D18(चित्रा 4B)पर 129 डेरिवेटिव) ।

इसे स्पष्ट करने के लिए, भ्रूण न्यूरोजेनेसिस के लिए अनुकूलित विधि का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 5में दिखाया गया है। संक्षेप में, 1.5 x 106 एमएससी को बेसल विभेदन माध्यम के 10 एमएल में एक गैर चिपकने वाले बैक्टीरियल डिश में वरीयता दी जाती है और 2 दिनों के लिए भ्रूणीय शरीर के गठन की अनुमति देती है। फिर, भ्रूण निकायों को एकत्र किया जाता है और 0.1% जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी प्लेटों में लगाया जाता है जिसमें 50 भ्रूण निकायों की एकाग्रता के साथ अच्छी तरह से लगाया जाता है। इस बीच, आरए (1 μM) एक और 6 दिनों के लिए जोड़ा जाता है। दिन 8 से 18 दिन तक, आरए को हटा दिया जाता है, और एन 2बी 27 मध्यम II को एनपीसी से न्यूरॉन्स में बाद के भेदभाव को निर्देशित करने के लिए लागू किया जाता है। इस तरह के एक संयुक्त विधि के साथ, मजबूत न्यूरॉन्स 18 दिन पर गठन किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: भ्रूण न्यूरोजेनेसिस प्रक्रिया का आरेख। इस आंकड़े को ली एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: भ्रूण शरीर की आकृति विज्ञान। (A)भ्रूणीय शरीर 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत । (ख)भ्रूणीय शरीर 2 दिनों के लिए सुसंस्कृत । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: A2lox और 129 mESCs का उपयोग कर चरण I भेदभाव पर 7 प्रोटोकॉल की दक्षता तुलना। (A)8 दिन में ए2लॉक्स और 129 एमएससी डेरिवेटिव का रूपात्मक विश्लेषण। ऊपरी पैनल: A2lox डेरिवेटिव; लोअर पैनल: 129 डेरिवेटिव। (ख)एनपीसी (नेस्टिन+, ग्रीन) के गठन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन । नाभिक को डीएपीआई के साथ नीला लेबल किया गया था। ऊपरी पैनल: D8 पर A2lox डेरिवेटिव; लोअर पैनल: डी 8 पर 129 डेरिवेटिव। हर समूह की नेस्टिन + कोशिकाओं के प्रतिशत हिस्टोग्राम द्वारा दिखाए गए थे। प्रत्येक कॉलम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब±SEM का प्रतिनिधित्व करता है। *, पी≤0.05; **, पी≤0.01। इस आंकड़े को ली एट अल से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: द्वितीय चरण भेदभाव पर 3 प्रोटोकॉल की दक्षता तुलना। (A)18 दिन में ए2लॉक्स और 129 एमईएससी डेरिवेटिव का रूपात्मक विश्लेषण। ऊपरी पैनल: A2lox डेरिवेटिव; लोअर पैनल: 129 डेरिवेटिव। (ख)न्यूरॉन्स (β-तुबुलिन III +, लाल) के गठन के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन। नाभिक को डीएपीआई के साथ नीला लेबल किया गया था। ऊपरी पैनल: D18 पर A2lox डेरिवेटिव; लोअर पैनल: D18 पर 129 डेरिवेटिव। हर समूह की β-तुबुलिन III + कोशिकाओं के प्रतिशत हिस्टोग्राम द्वारा दिखाए गए थे। प्रत्येक स्तंभ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के मतलब ± एसईएम का प्रतिनिधित्व करता है। *, पी≤0.05; **, पी≤0.01। इस आंकड़े को ली एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: विट्रो में एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए अनुकूलित विधि का संक्षिप्त मॉडल इस आंकड़े को Liet अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

भेदभाव चरण I (8d)
प्रोटोकॉल मीडिया
प्रोटोकॉल 1 स्वाभाविक रूप से भेदभाव: बेसल भेदभाव माध्यम के साथ मैं केवल बेसल भेदभाव माध्यम मैं:
DMEM/F12 +15%FBS + 1% NEAA +0.1mM 2ME + 1% P/S
प्रोटोकॉल 2 4 दिवसीय भ्रूण निकायों का गठन + 4 दिवसीय आरए प्रेरण
प्रोटोकॉल 3 2 दिवसीय भ्रूण निकायों का गठन + 6 दिवसीय आरए प्रेरण
प्रोटोकॉल 4 मोनोलेयर संस्कृति आरए प्रेरण के साथ संयुक्त: 4d (-RA) 4d (+RA)
प्रोटोकॉल 5 मोनोलेयर संस्कृति आरए प्रेरण के साथ संयुक्त: 2d (-RA) 6d (+RA)
प्रोटोकॉल 6 भ्रूण निकायों के गठन (4 डी) और N2B27 मध्यम द्वितीय के साथ प्रेरित भेदभाव N2B27 मध्यम II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% न्यूरोबेसल मीडियम + 2% B27 +1% ग्लूटामैक्स + 0.1 mM 2ME
प्रोटोकॉल 7 N2B27 मध्यम II के साथ मोनोलेयर संस्कृति

तालिका 1: चरण I भेदभाव में उपयोग किए गए 7 प्रोटोकॉल का विवरण। इस तालिका को ली एट अल10से संशोधित किया गया है ।

भेदभाव चरण द्वितीय (10d)
प्रोटोकॉल मीडिया
प्रोटोकॉल 1 स्वाभाविक रूप से भेदभाव: बेसल भेदभाव माध्यम के साथ मैं केवल बेसल भेदभाव माध्यम I: DMEM/F12 +15% FBS +1% NEAA +0.1mM 2ME + 1% P/S
प्रोटोकॉल 2 N2B27 माध्यम के साथ भेदभाव मैं N2B27 मध्यम I: DMEM/F12 + 1% N2 + 2% B27 + 1% ग्लूटामैक्स + 0.1mM 2ME
प्रोटोकॉल 3 N2B27 मध्यम II के साथ भेदभाव N2B27 मध्यम II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% न्यूरोबेसल मीडियम + 2% B27 +1% ग्लूटामैक्स + 0.1 mM 2ME

तालिका 2: द्वितीय चरण के भेदभाव में उपयोग किए जाने वाले 3 प्रोटोकॉल का विवरण। इस तालिका को ली एट अल10से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

वर्तमान अध्ययन में, हमने कम लागत और आसानी से प्राप्त सामग्रियों के साथ, एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक सरल और प्रभावी विधि स्थापित की। इस विधि में, आरए प्रेरण के 6 दिनों के बाद भ्रूण शरीर के गठन के 2 दिन एनपीसी (चरण I-प्रोटोकॉल 3) में एमसी के भेदभाव को प्रभावी ढंग से बढ़ावा दे सकते हैं। द्वितीय चरण के भेदभाव के लिए, N2B27 मध्यम द्वितीय (चरण द्वितीय-प्रोटोकॉल 3) सबसे प्रभावी ढंग से एनपीसी से न्यूरॉन्स में भेदभाव को प्रेरित करते हैं । सफलता सुनिश्चित करने के लिए, कई महत्वपूर्ण चरणों पर अधिक ध्यान दिया जाना चाहिए।

सबसे पहले, भ्रूण शरीर की स्वस्थ स्थिति पूरे भेदभाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है । त्रि-आयामी भ्रूण शरीर के गठन का उपयोग आमतौर पर ईएसएसी 8 के भेदभाव को निर्देशित करने के लिए कियाजाताहै। इस अध्ययन में, हम भ्रूण शरीर के उचित निलंबन संस्कृति समय की जांच की । जैसा कि चित्रा 2में दिखाया गया है, इस स्थिति में 2 दिनों के लिए निलंबन संस्कृति के बाद उज्ज्वल कोर के साथ गोल भ्रूण निकायों का गठन किया गया था। हालांकि, जब 4 दिनों के लिए सुसंस्कृत, कई भ्रूण निकाय एक दूसरे का पालन करते हैं, और कोर अंधेरे हो जाते हैं, कोर में कोशिकाओं के एपोप्टोसिस का संकेत देते हैं। बाद में भेदभाव आगे लंबे समय तक भ्रूण शरीर के गठन के बदतर प्रभाव की पुष्टि की । कुछ रिपोर्ट किए गए अध्ययनों में, भ्रूणीय निकायों की निलंबन संस्कृति 10 दिनों तक चल सकती है, कम एफबीएस एकाग्रता के साथ या एफबीएस11के बिना माध्यम का उपयोग कर सकती है। अध्ययन में भ्रूण शरीर के गठन के लिए कम समय उच्च FBS एकाग्रता (15%) यहां इस्तेमाल किया, और यह साबित हो गया है कि 15% FBS बेहतर गठन और भ्रूण निकायों के भेदभाव को बढ़ावा कर सकते हैं ।

दूसरे, जिस समय बिंदु पर आरए लागू किया जाता है और आरए काम एकाग्रता mESCs के सेल भाग्य निर्धारण के लिए महत्वपूर्ण हैं । आरए, विटामिन ए का व्युत्पन्न, प्लियोट्रोपिक कार्यों12के साथ सबसे महत्वपूर्ण मॉर्फोजन में से एक है। आरए कई सिग्नल रास्तों को विनियमित कर सकता है और ईएससी13,14के सेल भाग्य निर्धारण को प्रभावित कर सकता है । रिपोर्टों से पता चला है कि प्रारंभिक विभेदन चरण के दौरान आरए के साथ एमसी के साथ एमसी के अल्पकालिक उपचार ने सहज भेदभाव को रोका और एमएससी15की आत्म-नवीकरण क्षमता बनाए रखी । अन्य लोगों ने सुझाव दिया कि आरए ईएसएसी से रोगाणु कोशिका भेदभाव और तंत्रिका भेदभाव दोनों को विनियमित कर सकता है, जो समय बिंदु निर्भर16,17,18हैं। यहां प्रस्तुत की गई स्थिति में, आरए ने भ्रूण शरीर गठन के बाद2 दिन में कहा कि एनपीसी में भेदभाव को निर्देशित करने के लिए उपयुक्त है । इस बीच, आरए की कार्य एकाग्रता भी महत्वपूर्ण है । कम आरए सांद्रता (~ 10 एनएम) एमईएससी के विभेदन को एंडोडर्म जैसी कोशिकाओं में प्रेरित कर सकती है, जबकि उच्च आरए सांद्रता (1-5 माइक्रोन) एनपीसी13,14, 15,16,17,18, 19में भेदभाव को प्रेरित करने की अधिक संभावना है। आरए के उपयोग के कारण, कोई भी कौडलीकरण प्रभाव की उम्मीद करेगा; सामने ब्रेन न्यूरॉन्स में विभेदन शायद ही कभी देखा जाएगा और हिंडब्रेन और रीढ़ की हड्डी फैट्स के न्यूरॉन्स उपज20,21हो जाएगा . इसके अलावा, आरए एक आसानी से उपलब्ध और कम लागत वाला एजेंट है, और इस प्रोटोकॉल का उपयोग अधिकांश प्रयोगशाला के लिए अनुसंधान धन बचा सकता है।

तीसरी बात यह है कि यहां प्रस्तुत की गई स्थिति में, प्रथम चरण के बाद उत्पन्न एनपीसी को उचित परिस्थितियों में संग्रहित और पारित किया जा सकता है । स्टेम-सेलबैंकर का उपयोग करके उच्च सेल घनत्व (>2 x 106)के साथ क्रायोप्रिजर्वेशन उच्च वसूली दर प्राप्त करने के लिए ठंड के कारण होने वाले सेल नुकसान को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है। इस बीच, अध्ययन में उत्पन्न एनपीसी को N2B27 माध्यम (49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% न्यूरोबेसल माध्यम + 2% B27) का उपयोग करके 5 x 105/सेमी2से अधिक सेल घनत्व के साथ पारित किया जा सकता है। कम सेल घनत्व (0.5 x 105/सेमी2से कम) के तहत, एनपीसी अंतर करते हैं। इस तरह के सेल क्रायोप्रिजर्वेशन और रिकवरी से रिसर्च में बड़ी सहूलियत आ सकती है।

इसके अलावा, द्वितीय चरण के भेदभाव के लिए न्यूरोबेसल माध्यम आवश्यक है। न्यूरोबेसल माध्यम विशेष रूप से न्यूरोनल सेल के दीर्घकालिक रखरखाव और परिपक्वता के लिए डिज़ाइन किया गया है। जैसा कि N2B27 मध्यम II(तालिका 2)में सूचीबद्ध है, न्यूरोबेसल माध्यम के अलावा एनपीसी से न्यूरॉन्स में भेदभाव को बेहतर तरह से समर्थन दे सकता है।

सामूहिक रूप से, हमने संयोजन स्क्रीनिंग की रणनीतियों का उपयोग करके, विट्रो में एमएससी से न्यूरोनल भेदभाव के लिए एक कुशल और कम लागत वाली विधि की सूचना दी। स्थापित विधि को लागू करने के लिए बहुत आसान है और अधिकांश प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग के लिए उपयुक्त है। इस तरह के एक अनुकूलित विधि न्यूरोबायोलॉजी और विकासात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर ३१५०१०९९) और हुबेई प्रांत के शिक्षा विभाग के अधेड़ उम्र और युवा (नहीं) ने सपोर्ट किया । Q20191104) । और, हम माउस भ्रूणस्टेम सेल लाइनों A2lox प्रदान करने के लिए विज्ञान और प्रौद्योगिकी के वुहान विश्वविद्यालय में प्रोफेसर वेनशेंग देंग का शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Nestin antibody [Rat-401] Abcam Ab11306 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit Sigma Aldrich T2200 stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing
Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG Beyotime A0428 stored at -20 °C and protect from light
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044 stored at -20 °C, and protect from light
CHIR-99021 (CT99021) Selleck S1263 stored at -20 °C
Coverslips NEST 801007
Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG Beyotime A0516 stored at -20 °C and protect from light
DME/F-12 1:1 (1x) HyClone SH30023.01B stored at 4 °C
Fetal bovine serum HyClone SH30084.03 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Fluorescence microscopy Olympus CKX53
Gelatin Gibco CM0635B stored at room temperature
GlutaMAX Supplement Gibco 35050061 stored at 4 °C
Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer Beyotime P0103 stored at 4 °C
KnockOut DMEM/F-12 Gibco 12660012 stored at 4 °C
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028 stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Leukemia Inhibitory Factor human Sigma L5283 stored at -20 °C
Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield Abcam ab104139 stored at 4 °C and protect from light
MEM Non-essential amino acids solution Gibco 11140076 stored at 4 °C
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048 stored at -20 °C and protect from light
Normal goat serum Jackson 005-000-121 stored at -20 °C
Neurobasal Medium Gibco 21103049 stored at 4 °C
Nonadhesive bacterial dish Corning 3262
Phosphate Buffered Saline (1X) HyClone SH30256.01B stored at 4 °C
Penicillin/ Streptomycin Solution HyClone SV30010 stored at 4 °C
PD0325901(Mirdametinib) Selleck S1036 stored at -20 °C
Retinoic acid Sigma R2625 stored at -80 °C and protect from light
Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells Cyagen MUAES-01001 Maintained in feeder-free culture system
Stem-Cellbanker (DMSO free) ZENOAQ stem cellbanker DMSO free stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing
Trypsin 0.25% (1X) Solution HyClone SH30042.01 stored at 4 °C
Triton X-100 Sigma T8787
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023 stored at 4 °C and protect from light
4% paraformaldehyde Beyotime P0098 stored at -20 °C
6 - well plate Corning 3516
60 mm cell culture dish Corning 430166
15 ml centrifuge tube NUNC 339650

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