Summary
Här etablerade vi en låg kostnad och lättanvänd metod som leder snabb och effektiv differentiering från embryonala stamceller till nervceller. Denna metod är lämplig för popularisering bland laboratorier och kan vara ett användbart verktyg för neurologisk forskning.
Abstract
Neural differentiering av mus embryonala stamceller (mESCs) är ett potentiellt verktyg för att belysa de viktigaste mekanismerna som är involverade i neurogenes och potentiellt stöd i regenerativ medicin. Här etablerade vi en effektiv och lågkostnadsmetod för neuronal differentiering från mESCs in vitro, med hjälp av strategin för kombinatorisk screening. Under de förhållanden som definieras här tillåter 2-dagars embryoidkroppsbildning + 6-dagars retinsyrainduktionsprotokoll snabb och effektiv differentiering från mESCs till neurala prekursorceller (NPCs), vilket ses av bildandet av välstackade och neuritliknande A2lox och 129 derivat som är Nestin positiva. Det friska tillståndet hos embryoidkroppar och den tidspunkt vid vilken retinsyra (RA) appliceras, liksom RA-koncentrationerna, är avgörande i processen. I den efterföljande differentiering från NPCs till nervceller, N2B27 medium II (kompletteras av Neurobasal medium) kan bättre stödja långsiktiga underhåll och mognad av neuronala celler. Den presenterade metoden är mycket effektiv, låg kostnad och lätt att använda, och kan vara ett kraftfullt verktyg för neurobiologi och utvecklingsbiologisk forskning.
Introduction
Embryonala stamceller (EIC) är pluripotenta och kan differentieras till neurala prekursorceller (NPC) och därefter till nervceller under vissa förhållanden1. ESC-baserad neurogenes ger den bästa plattformen för att efterlikna neurogenes, vilket fungerar som ett användbart verktyg för utvecklingsbiologiska studier och potentiellt stöd i regenerativ medicin2,3. Under de senaste decennierna har många strategier rapporterats för att inducera embryonal neurogenes, såsom den transgena metoden4, med hjälp av småmolekyler 5, med hjälp av en 3D-matrismikromiljö6, och samkulturtekniken7. De flesta av dessa protokoll är dock antingen tillståndsbegränsade eller svåra att använda, vilket innebär att de inte är lämpliga för användning i de flesta laboratorier.
För att hitta en lättanvänd och billig metod för att uppnå effektiv neural differentiering från mESCs användes en kombinatorisk screeningstrategi här. Som beskrivs i figur 1var hela processen med embryonal neurogenes uppdelad i 2 faser. Fas I avser differentieringsprocessen från mESC till nödlidande lån, och fas II avser den efterföljande differentieringen från nödlidande lån till nervceller. Baserat på principerna om enkel drift, låg kostnad, lättillgängliga material och hög differentieringseffektivitet valdes sju protokoll i fas I och tre protokoll i fas II baserat på det traditionella vidhäftande monolayerkultursystemet eller embryoidkroppsbildningssystemet8,9. Differentieringseffektiviteten av protokoll i båda faserna utvärderades med hjälp av cell morfologi observation och immunofluorescens analys. Genom att kombinera det mest effektiva protokollet i varje fas etablerade vi den optimerade metoden för neural differentiering från mESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mus embryonal stamcellskultur
- Förbered 0,1% gelatinbelagda cellkulturrätter eller tallrikar.
- Tillsätt 2 ml steriliserat 0,1% gelatin (0,1% w/v i vatten) till 60 mm cellkulturrätter. Rocka försiktigt för att säkerställa jämn beläggning av cellkulturrätterna.
- Sätt disken i en 5% CO2 inkubator vid 37 °C och låt beläggningen vara 1 timme.
- Ta bort 0,1% gelatinlösningen innan du sår cellerna.
OBS: När du har tagit bort gelatinet behöver du inte torka eller tvätta de belagda diskarna.
- Mus embryonala stamceller (A2lox och 129) kultur
- Inkubera mESCs (A2lox och 129) celler i 0,1% gelatin belagda 60 mm cellkultur rätter i mESC tillväxt medium vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator, respektive. MESC-tillväxtmediet består av 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serum replacement (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% icke-essentiell aminosyra (NEAA), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/mL leukemihämmande faktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hämmare) och 0,33 nM PD0325901 (MEK-hämmare).
VARNING: β-mercaptoethanol är brandfarlig och har inandningstoxicitet. Håll dig borta från brandkällor och använd en mask för att undvika inandning vid användning. - Ändra mESC-tillväxtmediet dagligen för bättre tillväxt av A2lox och 129.
- När cellerna når 80% sammanflöde, ta bort mediet och tillsätt 1 ml 0,1% trypsin till skålen. Vagga försiktigt i 30 s för att säkerställa jämnt skydd av trypsin på alla celler.
- Lämna cellerna i ca 1 min för att trypsinize och ta sedan bort trypsin med 1 mL pipett.
- Tillsätt 2 ml mESC-tillväxtmedium till skålen, pipetten upp och ner flera gånger för att göra en enda cellupphängning.
- Räkna cellernas densitet i suspensionen så exakt som möjligt med hjälp av hemocytometer.
- Dela upp cellerna i 7 grupper och inducera differentiering med hjälp av olika protokoll som visas i tabell 1.
- Inkubera mESCs (A2lox och 129) celler i 0,1% gelatin belagda 60 mm cellkultur rätter i mESC tillväxt medium vid 37 °C i en 5% CO2 inkubator, respektive. MESC-tillväxtmediet består av 85% knock-out DMEM/F12, 15% Knock-out serum replacement (KSR), 0,1 mM β-mercaptoethanol (2ME), 2 mM GlutaMAX, 1% icke-essentiell aminosyra (NEAA), 1% penicillin/streptomycin (P/S), 1000 U/mL leukemihämmande faktor (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3-hämmare) och 0,33 nM PD0325901 (MEK-hämmare).
2. Differentiering från mESC till nödlidande lån (fas I)
- Förbered 0,1% gelatinbelagda cellkulturplattor eller täckplattor.
- Före användning, förbered 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor eller täcklips som i steg 1.1.
- Fas I-differentiering med protokoll 1 (tabell 1)
- Frö ca 2 x 104 mESCs i 2 ml basal differentiering medium I per brunn i 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Kontrollera celltätheten under ett mikroskop.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator i 6 timmar för att möjliggöra fastsättning.
- Efter fastsättning, ta ut ur cellerna från inkubatorn och tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS.
- Tillsätt 2 ml basal differentieringsmedium I (tabell 1) till varje brunn och sätt tillbaka cellerna i inkubatorn.
- Lämna cellerna för differentiering i 8 dagar. Byt ut basal differentieringsmediet I varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 2 (tabell 1)
- Tillsätt 1,5 x 106 mESC i en icke-sadhesiv bakterierätt i 10 ml basal differentieringsmedium I för att möjliggöra embryoidkroppsbildning vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator.
- Efter 2 dagar aggregerar överföringscellen till 15 ml centrifugrör och låt dem bosätta sig genom gravitationen.
- Ta bort supernatanten och tillsätt 10 ml färskt basal differentieringsmedium I för att återanvända embryoidkropparna. Plantera om dem i en ny icke-sadhesiv bakteriell maträtt och tillåt differentiering i ytterligare 2 dagar.
- Kontrollera bildandet av embryoidkroppar under mikroskopet(figur 2A).
- Samla embryoidkroppar enligt beskrivningen i steg 2.3.2-2.3.3. Frö ca 50 embryoidkroppar i 2 ml basal differentieringsmedium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor.
- Förbered 1 mM all-trans RA-lager (i DMSO) och förvara bort från ljus i en -80 °C frys efter underförpackning.
OBS: RA är instabilt, och uppmärksamhet bör ägnas åt att hålla det borta från ljus och minska luftkontakten under beredningen av RA-lager. - För RA-induktion, tillsätt 2 μL RA-lager i varje brunn för att göra en slutlig koncentration på 1 μM.
- Placera plattan i 5% CO2 inkubatorn vid 37 °C och differentiera i ytterligare 4 dagar.
- Byt hela 2 ml basal differentieringsmedium I (med 1 μM RA) varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 3 (tabell 1)
- Växt 1,5 x 106 mESC i en icke-sedhesiv bakteriell maträtt i 10 ml basal differentieringsmedium I. Lämna i 2 dagar för embryoidkroppsbildning vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator.
- Kontrollera bildandet av embryoidkroppar under ett mikroskop (figur 2B).
- Överför cellaggregat till 15 ml centrifuger och låt dem sätta sig genom gravitationen.
- Ta bort supernatanten försiktigt och tillsätt 10 ml färskt basal differentieringsmedium I för att återanvända dem.
- Frö ca 50 embryoidkroppar till 2 ml basal differentieringsmedium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor.
- För RA-induktion, tillsätt 2 μL RA-lager i varje brunn för att göra en slutlig koncentration på 1 μM.
- Placera plattan i 5% CO2 inkubatorn vid 37 °C och differentiera i ytterligare 6 dagar. Byt hela basala differentieringsmediet I (med 1 μM RA) varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 4 (tabell 1)
- Frö ca 2 x 104 mESCs inom 2 ml basal differentiering medium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Placera plattan i 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C för att möjliggöra fastsättning i 6 timmar.
- Efter fastsättning, tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS. Tillsätt 2 ml basal differentieringsmedium I till varje brunn och tillåt differentiering i 4 dagar i 5% CO 2-inkubatorn vid 37 °C.
- För RA-induktion, tillsätt 2 μL all-trans RA-lager i varje brunn (arbetskoncentrationen är 1 μM) för att inducera differentiering i ytterligare 4 dagar.
- I hela processen, byt ut hela mediet varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 5 (tabell 1)
- Frö ca 2 x 104 mESCs inom 2 ml basal differentiering medium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Placera plattan i 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C för att möjliggöra fastsättning i 6 timmar.
- Tvätta cellerna två gånger med 2 ml PBS. Tillsätt 2 ml basal differentieringsmedium I till varje brunn och tillåt differentiering i 2 dagar i 5% CO 2-inkubatorn vid 37 °C.
- För efterföljande RA-induktion, tillsätt 2 μL RA-bestånd i varje brunn för att göra en slutlig koncentration på 1 μM. Placera plattan i 5% CO 2-inkubatorn vid 37 °C för att inducera differentiering i ytterligare 6 dagar.
- I hela processen, byt ut hela mediet varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 6 (tabell 1)
- Plantera 1,5 x 106 mESC i en bakteriell maträtt i 10 ml N2B27 medium II(tabell 1)för att möjliggöra embryoidkroppsbildning.
- På andra dagen,samla in cellaggregaten enligt beskrivningen i steg 2.3.2-2.3.3 och återanvänd embryoidkropparna med 10 ml färsk N2B27 medium II.
- Plantera om dem i en ny icke-sadhesiv bakterierätt och tillåt differentiering i ytterligare 2 dagar i 5% CO 2-inkubatorn vid 37 °C. Kontrollera bildandet av embryoidkroppar under mikroskop.
- På den4: e dagen, samla embryoidkroppar. Frö ca 50 embryoida kroppar per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor med 2 ml N2B27 medium II.
- Tillsätt 2 μL alltrans RA-lager i varje brunn och inducera differentiering i ytterligare 4 dagar. Byt ut hela mediet (N2B27 medium II mot 1 μM RA) varannan dag.
- Fas I-differentiering med protokoll 7 (tabell 1)
- Frö ca 2 x 104 mESCs inom 2 ml basal differentiering medium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Placera plattan i 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C för att möjliggöra fastsättning i 6 timmar.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS. Tillsätt sedan 2 ml N2B27 medium II till varje brunn och tillåt differentiering i 8 dagar vid 37 °C i en 5% CO 2-inkubator.
- Byt hela N2B27 medium II varannan dag.
3. Cell morfologi observation
- Kontrollera differentieringsstatusen för ovan nämnda 7 grupper dagligen under ett inverterat faskontrastljusmikroskop.
- Välj slumpmässigt minst 12 fält och ta bilder för att registrera de morfologiska förändringarna i varje grupp på D8.
4. Immunofluorescens färgning
- Provberedning: Frö mESCs på 0,1% gelatinbelagda täcklips och möjliggör differentiering i 8 dagar med hjälp av de protokoll som nämns i steg 2.
- Skölj: Ta utproverna från inkubatorn den 8:e dagen och avlägsna differentieringsmediet genom aspiration. Skölj försiktigt cellerna en gång med 1 ml PBS i 5 min.
- Fixering: Tillsätt 1 ml 4% paraformaldehyd till varje prov och fixera cellerna i 20 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Skölj: Skölj försiktigt cellerna med 1 ml PBS 3 gånger efter fixeringen i 5 minuter vardera.
- Permeabilisering: Tillsätt 1 ml 0,2% TritonX-100 i PBS till varje prov och lämna i 8 minuter på RT.
- Skölj: Skölj cellerna försiktigt med 1 ml PBS 3 gånger efter permeabilisering i 5 minuter vardera.
- Blockering: Tillsätt 1 ml 10% getserum i PBS till varje prov och inkubera vid RT i 1 timme för att blockera icke-specifika interaktioner.
- Inkubation med primär antikropp
- Späd anti-Nestin-antikroppen med ett förhållande av 1:100 med 5% getserum i PBS.
- Applicera 500 μL utspädd antikropp på olika prover och inkubera över natten vid 4 °C.
- Skölj: Ta bort antikroppen och skölj proverna försiktigt med 1 ml PBS 3 gånger i 8 minuter vardera.
- Inkubation med sekundär antikropp
- Späd Alexa Fluor 488-märkt get antimus IgG vid ett förhållande av 1:500 med 5% getserum i PBS.
- Applicera 500 μL utspädd antikropp på olika prover och inkubera i mörker i 2 timmar på RT.
OBS: Efter applicering av fluorescerande sekundär antikropp, utför alla efterföljande steg i mörkret för att förhindra fluorescenssläckande.
- Skölj: Ta bort den sekundära antikroppen och skölj proverna försiktigt med 1 ml PBS 3 gånger i 8 minuter vardera.
- Kärnfärgning och montering
- Placera en droppe DAPI-monteringsmedium på den rena mikrosliden.
- Ta försiktigt ut proverna från plattorna och placera provet ovanpå DAPI-monteringsmediet med cellen vänd nedåt. Lämna i mörkret i 5 minuter på RT.
- Ta bort överflödigt DAPI-monteringsmedium med absorberande papper.
- Fluorescensmikroskopi observation
- Placera proverna under fluorescensmikroskopin och detektera signalen för DAPI och Alexa Fluor 488 med rätt filter.
- Jämnt och slumpmässigt välja 10-15 olika visuella fält för varje prov och spela in bilderna med en CCD-kamera.
5. Differentiering från NPC till nervceller (fas II)
- Bered mESC-derivat under fas I-differentiering med protokoll 3 (8 dagar, tabell 1) enligt steg 2.4, som har den högsta differentieringseffektiviteten (se figur 3).
OBS: Efter fas I-differentiering bör kvalitetskontroll utföras med hjälp av cellmorfologiobservation och immunofluorescensanalys som nämns ovan, för att säkerställa en hälsosam och högavkastande NPC. - Frö ca 5 x 105 mESC derivat inom 2 ml basal differentiering medium I per brunn på 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattor. Dela slumpmässigt mESC-derivaten i 3 grupper, som fas II-protokoll 1, protokoll 2 respektive protokoll 3.
- Placera plattan i 5% CO2-inkubatorn vid 37 °C för att möjliggöra fastsättning i 6 timmar. Tvätta dem två gånger med 2 ml PBS.
- Tillsätt 2 ml basal differentieringsmedium I, N2B27 medium I respektive N2B27 medium II (tabell 2) till varje brunn i ovanstående grupper.
- Placera plattorna i inkubatorn och låt differentiera i ytterligare 10 dagar. Ändra motsvarande medium varannan dag.
- Kontrollera differentieringsstatusen och registrera de morfologiska förändringarna som nämns i steg 3.
- På dag 18, utvärdera genereringen av nervceller (β-Tubulin III positiva) och bestämma differentieringseffektiviteten hos de 3 protokollen som använder i steg 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
2-dagars embryoidkroppsbildning + 6-dagars RA-induktion fungerar bäst för att styra differentiering av mESC till NPC (fas I). För att fastställa det optimala protokoll som bäst främjar differentiering av mESC till nödlidande lån (fas I) testades 7 protokoll på både A2lox och 129 mESCs(tabell 1)och differentieringsstatusen för varje grupp övervakades med hjälp av ljusmikroskop. Som visas i figur 3Avisade de flesta A2lox- och 129-derivat under "2-dagars embryoidkroppsbildning + 6-dagars RA-induktionsbehandling" (fas I-protokoll 3) väl staplade och neuritliknande morfologier, vilket indikerar bildandet av NPC. Celler med "4-dagars embryoidkroppsbildning + 4-dagars RA-induktion" behandling (fas I-protokoll 2) visade dock dålig och apoptotisk status, vilket kan bero på bristen på näringsämnen i embryoidkroppar. Monolayer kultur i kombination med RA induktion (fas I-protokoll 4 och 5) kunde också styra differentiering av mESCs, medan andelen neurit-liknande celler inte var så mycket som i fas I-protokoll 3. Under tiden visade de flesta A2lox och 129 derivat i fas I-protokoll 6 och 7 mindre cellkroppar och tenderade att genomgå apoptos, vilket tyder på att N2B27 medium II inte kunde stödja embryonal neurogenes effektivt.
För att ytterligare bekräfta bildandet av nödlidande lån upptäcktes procentandelen Nestin+-celler (markör för NPC) i varje grupp med hjälp av en immunofluorescensanalys. I figur 3Bvar andelen Nestin+-celler i fas I-protokoll 3 den högsta och nådde upp till 77,67 ± 4,33 % respektive 69,33 ± 2,33 % i A2lox respektive 129 derivat. Tillsammans fungerar fas I-protokoll 3 bäst på att styra differentiering av mESCs till nödlidande lån.
N2B27 medium II kan mest effektivt inducera differentiering från NPC till nervceller (fas II). Tre protokoll i fas II differentiering undersöktes. Som visas i figur 4Avisade morfologisk observation att de flesta A2lox- och 129-derivat i fas II-protokoll 3 (differentiering med N2B27 medium II) föreföll de mest långvariga neuronliknande strukturerna med tydliga neuriter och cellkroppsförlängningar vid dag 18, vilket indikerar effektiv förekomst av neurogenes. Immunofluorescensanalyser bekräftade vidare genereringen av nervceller, med andelen β-Tubulin III+ celler upp till 67,75 ± 4,01% respektive 58,73 ± 7,25% i A2lox respektive 129 derivat på D18 (Figur 4B).
För att göra det tydligare visas ett schematiskt diagram över den optimerade metoden för embryonal neurogenes i figur 5. Kort, 1,5 x 106 mESCs sås i en nonadhesive bakteriell maträtt i 10 ml basal differentiering medium I och möjliggör embryoid kroppsbildning i 2 dagar. Därefter samlas embryoidkroppar in och planteras i de 0,1% gelatinbelagda 6-brunnsplattorna med koncentrationen av 50 embryoidkroppar per brunn. Under tiden läggs RA (1 μM) till i ytterligare 6 dagar. Från dag 8 till dag 18 tas RA bort och N2B27 medium II tillämpas för att rikta den efterföljande differentiering från NPC till nervceller. Med en sådan kombinerad metod kan robusta nervceller bildas på dag 18.
Figur 1: Diagram över den embryonala neurogenesprocessen. Denna siffra har ändrats från Li et al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Embryoidkroppens morfologi. A)Embryoida kroppar odlade i 4 dagar. B)Embryoidkroppar odlade i 2 dagar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Effektivitetsjämförelse av de 7 protokollen om fas I-differentiering med A2lox och 129 mESCs. A)Morfologisk analys av A2lox och 129 mESC derivat dag 8. Övre panel: A2lox derivat; Nedre panel: 129 derivat. (B) Immunofluorescensdetektering för bildandet av nödlidande lån (Nestin+, grön). Atomkärnorna var märkta blå med DAPI. Övre panel: A2lox derivat på D8; Nedre panel: 129 derivat på D8. Procentandelar av Nestin+-celler i varje grupp visades med histogram. Varje kolumn representerar medelvärdet ±SEM för tre oberoende experiment. *, p≤0,05; **, p≤0.01. Denna siffra har ändrats från Li et al.10. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Effektivitetsjämförelse av de tre protokollen om differentiering av fas II. A)Morfologisk analys av A2lox och 129 mESC derivat dag 18. Övre panel: A2lox derivat; Nedre panel: 129 derivat. (B) Immunofluorescensdetektering för bildandet av nervceller (β-Tubulin III+, röd). Atomkärnorna var märkta blå med DAPI. Övre panel: A2lox derivat på D18; Nedre panel: 129 derivat på D18. Procentandelar av β-Tubulin III+ celler i varje grupp visades av histogram. Varje kolumn representerar medelvärdet ± SEM för tre oberoende experiment. *, p≤0,05; **, p≤0.01. Denna siffra har ändrats från Li et al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Kort modell av den optimerade metoden för neuronal differentiering från mESCs in vitro Denna siffra har ändrats från Liet al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Differentiering fas I (8d) | ||
| Protokoll | Media | |
| protokoll 1 | Differentiering naturligt: Med basal differentieringsmedium I endast | Basal differentiering medium I: DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokoll 2 | 4-dagars embryoidkroppsbildning + 4-dagars RA-induktion | |
| protokoll 3 | 2-dagars embryoidkroppsbildning + 6-dagars RA-induktion | |
| protokoll 4 | Monolayerkultur i kombination med RA-induktion: 4d (-RA) 4d (+RA) | |
| protokoll 5 | Monolayerkultur i kombination med RA-induktion: 2d (-RA) 6d(+RA) | |
| protokoll 6 | Embryoidkroppsbildning (4 d) och differentiering inducerad med N2B27 medium II | N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
| protokoll 7 | Monolayerkultur med N2B27 medium II | |
Tabell 1: Uppgifter om de 7 protokoll som används i fas I-differentiering. Denna tabell har ändrats från Li et al.10.
| Differentiering fas II (10d) | ||
| Protokoll | Media | |
| protokoll 1 | Differentiering naturligt: Med basal differentieringsmedium I endast | Basal differentiering medium I: DMEM/F12 +15%FBS +1%NEAA +0.1mM 2ME+ 1%P/S |
| protokoll 2 | Differentiering med N2B27 medium I | N2B27 medium I: DMEM/F12 + 1%N2 + 2%B27 + 1%GlutaMAX +0.1mM 2ME |
| protokoll 3 | Differentiering med N2B27 medium II | N2B27 medium II: 49% DMEM/F12+ 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27 +1%GlutaMAX+ 0.1mM 2ME |
Tabell 2: Närmare uppgifter om de 3 protokoll som används vid differentiering i fas II. Denna tabell har ändrats från Li et al.10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den aktuella studien etablerade vi en enkel och effektiv metod för neuronal differentiering från mESCs, med låg kostnad och lättåthållna material. I denna metod kan 2 dagars embryoidkroppsbildning följt av 6 dagars RA-induktion effektivt främja differentiering av mESC till nödlidande lån (fas I-protokoll 3). För fas II-differentiering inducerar N2B27 medium II (fas II-protokoll 3) mest effektivt differentiering från NPC till nervceller. För att säkerställa framgång bör mer uppmärksamhet ägnas åt flera kritiska steg.
För det första är embryoidkroppars hälsosamma tillstånd nyckeln till hela differentieringsprocessen. Tredimensionell embryoidkroppsbildning används vanligtvis för att styra differentiering av EIC8. I denna studie undersökte vi den korrekta suspensionskulturtiden för embryoidkroppar. Som visas i figur 2bildades runda embryoida kroppar med ljusa kärnor efter suspensionskultur i 2 dagar i detta tillstånd. Men när de odlas i 4 dagar följer många embryoida kroppar varandra, och kärnorna blir mörka, vilket indikerar apoptosen hos celler i kärnorna. Den efterföljande differentiering bekräftade ytterligare den sämre effekten av långvarig embryoid kroppsbildning. I vissa rapporterade studier kan suspensionskulturen hos embryoider vara så länge som 10 dagar, med medel med lägre FBS-koncentration eller utan FBS11. Den minskade tiden för embryoidkroppsbildning i studien kan bero på den högre FBS-koncentrationen (15%) används här, och det har bevisats att 15% FBS bättre kan främja bildandet och differentiering av embryoidkroppar.
För det andra är den tidsram inom vilken RA tillämpas och RA:s arbetskoncentration avgörande för cellernas ödesbestämning av mESC. RA, ett derivat av vitamin A, är en av de viktigaste morfogenerna med pleiotropa åtgärder12. RA kan reglera flera signalvägar och påverka cellens ödesbestämning av EIC13,14. Rapporter visade att korttidsbehandling av mESC med RA under det tidiga differentieringsstadiet förhindrade spontan differentiering och bibehåller självförnyelsekapaciteten hos mESCs15. Andra föreslog att RA kunde reglera både bakteriecells differentiering och neural differentiering från ESCs, som är tidspunktsberoende16,17,18. I det tillstånd som presenteras här, RA läggs till den2: a dagen efter embryoid kroppsbildning är lämplig för att rikta differentiering till NPC. Samtidigt är den fungerande koncentrationen av RA också kritisk. Låga RA-koncentrationer (~ 10 nM) kan inducera differentiering av mESC till endodermliknande celler, medan höga RA-koncentrationer (1-5 μM) är mer benägna att inducera differentiering i NPC13,14,15,16,17,18,19. På grund av användningen av RA kan man förvänta sig en kaudaliseringseffekt; differentiering i förhjärnneuroner skulle sällan ses och att ge nervceller av bakben och ryggmärg öden skulle uppstå20,21. Dessutom är RA ett lättillgängligt och lågkostnadsagent, och användningen av detta protokoll kan spara forskningsmedel för de flesta laboratorier.
För det tredje, i tillstånd som presenteras här, kan de nödlidande lån som genereras efter fas I-differentiering lagras och passeras under lämpliga förhållanden. Kryopreservation med hög celltäthet (>2 x 106) med Stem-Cellbanker kan effektivt minska cellskadorna som orsakas av frysning för att få en hög återvinningsgrad. Under tiden kan NPC som genereras i studien passeras med N2B27 medium (49% DMEM / F12 + 1% N2 + 48% Neurobasal medium + 2% B27) med en celltäthet mer än 5 x 105/ cm2. Under låg celltäthet (mindre än 0,5 x 105/cm2)tenderar NPC:er att skilja sig åt. Sådan cell kryopreservation och återhämtning kan ge stor bekvämlighet till forskningen.
Dessutom är neurobasalt medium viktigt för fas II-differentiering. Neurobasal medium är speciellt utformat för långsiktigt underhåll och mognad av neuronal cell. Som anges i N2B27 medium II (Tabell 2), tillägget av Neurobasal medium skulle bättre kunna stödja differentiering från NPCs till nervceller.
Tillsammans rapporterade vi en effektiv och billig metod för neuronal differentiering från mESCs in vitro, med hjälp av strategierna för kombinatorisk screening. Den etablerade metoden är mycket lätt att implementera och är lämplig för användning av de flesta laboratorier. En sådan optimerad metod kan vara ett kraftfullt verktyg för neurobiologi och utvecklingsbiologisk forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (nr 31501099) och medelålders och unga vid utbildningsdepartementet i Hubeiprovinsen, Kina (nr. Q20191104). Och vi tackar professor Wensheng Deng vid Wuhan University of Science and Technology för att ha tillhandahållit musens embryonala stamcellslinjer A2lox.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Nestin antibody [Rat-401] | Abcam | Ab11306 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Anti-β-Tubulin III antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | T2200 | stored at -80 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG | Beyotime | A0428 | stored at -20 °C and protect from light |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Gibco | 17504044 | stored at -20 °C, and protect from light |
| CHIR-99021 (CT99021) | Selleck | S1263 | stored at -20 °C |
| Coverslips | NEST | 801007 | |
| Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG | Beyotime | A0516 | stored at -20 °C and protect from light |
| DME/F-12 1:1 (1x) | HyClone | SH30023.01B | stored at 4 °C |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30084.03 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Fluorescence microscopy | Olympus | CKX53 | |
| Gelatin | Gibco | CM0635B | stored at room temperature |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | stored at 4 °C |
| Immunol Staining Primary Antibody dilution Buffer | Beyotime | P0103 | stored at 4 °C |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | stored at 4 °C |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Leukemia Inhibitory Factor human | Sigma | L5283 | stored at -20 °C |
| Mounting Medium With DAPI - Aqueous, Fluoroshield | Abcam | ab104139 | stored at 4 °C and protect from light |
| MEM Non-essential amino acids solution | Gibco | 11140076 | stored at 4 °C |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | stored at -20 °C and protect from light |
| Normal goat serum | Jackson | 005-000-121 | stored at -20 °C |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | stored at 4 °C |
| Nonadhesive bacterial dish | Corning | 3262 | |
| Phosphate Buffered Saline (1X) | HyClone | SH30256.01B | stored at 4 °C |
| Penicillin/ Streptomycin Solution | HyClone | SV30010 | stored at 4 °C |
| PD0325901(Mirdametinib) | Selleck | S1036 | stored at -20 °C |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | stored at -80 °C and protect from light |
| Strain 129 Mouse Embryonic Stem Cells | Cyagen | MUAES-01001 | Maintained in feeder-free culture system |
| Stem-Cellbanker (DMSO free) | ZENOAQ | stem cellbanker DMSO free | stored at -20 °C, avoid repeated freezing and thawing |
| Trypsin 0.25% (1X) Solution | HyClone | SH30042.01 | stored at 4 °C |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | stored at 4 °C and protect from light |
| 4% paraformaldehyde | Beyotime | P0098 | stored at -20 °C |
| 6 - well plate | Corning | 3516 | |
| 60 mm cell culture dish | Corning | 430166 | |
| 15 ml centrifuge tube | NUNC | 339650 |
References
- Vieira, M. S., et al. Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications. Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).
- Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy. Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).
- Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).
- Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene. Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).
- Yoshimatsu, S., et al. Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs. Neuroscience research. , (2019).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).
- Gazina, E. V., et al. Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks. Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).
- Ohnuki, Y., Kurosawa, H. Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies. Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).
- Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture. Journal of Visualized experiments. (99), e52823 (2015).
- Li, Y., et al. An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486 (2020).
- Zhou, P., et al. Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method. Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).
- Lu, J. F., et al. All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways. BMC Cell Biology. 10, 57 (2009).
- Kanungo, J. Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation. Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).
- Rochette-Egly, C. Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).
- Wang, R., et al. Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism. Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).
- Wu, H. B., et al. Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells. Cell Death Disease. 8, 2953 (2017).
- Chen, W., et al. Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway. Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).
- Nakayama, Y., et al. A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line. Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).
- Bibel, M., et al. Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), 16174 (2011).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).
