Summary
Bu protokol, yumurta vakalarını (oothecae) kuluçkadan önce yüzey sterilize ederek gnotobiyotik Amerikan hamamböceği(Periplaneta americana)kurulmasında ve sürdürülmesinde kullanılır. Bu gnotobiyotik böcekler dikey olarak bulaşan Blattabacterium endombiyotlarını içerir, ancak eksenik bağırsaklara sahiptir.
Abstract
Gnotobiyotik hayvanlar, mikrobiyom yapısı ve işlevi üzerindeki kontrollerin incelenmesi için güçlü bir araçtır. Burada sunulan gnotobiyotik Amerikan hamamböceği(Periplaneta americana)kurulması ve bakımı için bir protokoldür. Bu yaklaşım, sürekli kalite kontrolü için yerleşik sterilite kontrollerini içerir. Gnotobiyotik böcekler burada hala dikey olarak iletilen endosimbiyotlarını (Blattabacterium)içeren ancak normalde yüzeylerinde ve sindirim yollarında bulunan diğer mikroplardan yoksun hamamböceği olarak tanımlanır. Bu protokol için yumurta vakaları (oothecae) (nonsterile) stok kolonisinden çıkarılır ve yüzey sterilize edilir. Toplandıktan ve sterilize edildikten sonra, oothecae, yumurtadan çıkana veya kontaminasyon nedeniyle çıkarılana kadar beyin-kalp infüzyonu (BHI) agar üzerinde yaklaşık 4−6 hafta boyunca 30 °C'de inkübe edilir. Yumurtadan çıkan nimfler BHI zemin, steril su ve steril sıçan maması içeren bir Erlenmeyer şişesine aktarılır. Nimflerin verilen koşullarda BHI üzerinde büyüyemeyen mikropları barındırmamasını sağlamak için, ek bir kalite kontrol önlemi,endozbiyotik olmayan mikropları test etmek için kısıtlama parçası uzunluğunda polimorfizm (RFLP) kullanır. Bu yaklaşım kullanılarak üretilen gnotobiyotik nimfler basit veya karmaşık mikrobiyal topluluklarla aşılanabilir ve bağırsak mikrobiyom çalışmalarında bir araç olarak kullanılabilir.
Introduction
Gnotobiyotik hayvanlar mikrobiyom çalışmaları için paha biçilmez araçlar olduğunu kanıtlamıştır1,2,3. Mikropsuz ve tanımlanmış flora hayvanlar, konak immünolojik yanıtlar, bağırsak epitel olgunlaşması ve konak metabolizması 1 , 4 ,5,6,7dahil olmak üzere konak mikrop etkileşimlerinin aydınlatımasına izin vermiştir. Basitleştirilmiş bir toplulukla aşılanmış gnotobiyotik hayvanlar, özellikle çapraz besleme ve düşmanca ilişkileri çözmede, bir bağırsak topluluğundaki mikrop-mikrop etkileşimlerinin daha eksiksiz anlaşılmasına yardımcı oldu 8,9,10,11. Memeli bağırsak mikrobiyomunda yapılan çalışmalar için mevcut tercih edilen model sistemi murine modelidir. Bu sistem yukarıda özetlenen keşiflerde hayati öneme sahip olsa da, önemli bir eksiklik söz konusu maliyettir. Bir gnotobiyotik tesis kurmak ve sürdürmek için özel ekipmanlar ve yüksek eğitimli teknisyenler gereklidir. Bu, gnotobiyotik hayvan bakımının her yönüne verilmesi gereken ekstra bakımla birlikte, bir gnotobiyotik hayvanın standart bir hayvan modelinden on ila yirmi kat daha fazla üremesine neden olur12. Yüksek maliyetler nedeniyle, birçok araştırmacı gnotobiyotik bir murine modelini karşılayamayabilir. Ek olarak, murine modelleri insan sağlığına çevirmek isteyen çalışmalar için en yaygın kabul gören seçim olsa da, insan ve fare bağırsakları arasında hala birçok fizyolojik ve morfolojik farkvardır 13. Açıkçası hiçbir tekil model, bağırsak mikrobiyomunun birçok yönüyle ilgili sürekli artan sayıda soruyu cevaplamak için yeterli değildir.
Böcek modelleri, memeli türlerine kıyasla daha düşük bakım maliyeti nedeniyle daha ucuz bir alternatiftir. Çeşitli böcek türlerinde mikropsuz ve gnotobiyotik araştırmalar, yaygın olarak kullanılan birden fazla modelin geliştirilmesine yol açmıştır. Sivrisinekler ve Drosophila, küresel hastalıklarla ve genetik çekiş kabiliyeti ile ilgili olmaları nedeniyle mikropsuz çalışma için yaygınmodellerdir 14,15. Bir başka gelişmekte olan model sistemi bal arısı (Apis mellifera), tozlaşma ve sosyallik araştırmalarındaki önemi göz önüne alındığında16. Bununla birlikte, yaygın olarak kullanılan bu böceklerinçoğu, memelibağırsak topluluklarında görülen taksonomik karmaşıklıktan yoksun 17 , daha yüksek sıralı etkileşimleri modelleme yeteneklerini sınırlar. Sadece Amerikan hamamböceği bağırsaklarında bulunan mikropların toplam çeşitliliği memelilere daha benzer değil, aynı zamanda hamamböceği bağırsaklarında bulunan mikropların çoğu, memelilerin ve insanların bağırsak mikrobiyotasında yaygın olarak bulunan ailelere ve phyla'ya aittir18. Hamamböceğinin arka kısmı da işlevsel olarak memelilerin kalın bağırsağine benzer, çünkü besin maddelerinin çıkarılmasına yardımcı olmak için bakterilerle yoğun bir şekilde dolu bir fermantasyonodasıdır 19,20. Son olarak, hamamböceği omnivor doğası, diyet uzmanları ile mümkün olmayacak çeşitli diyet rejimlerine izin verir.
Amerikan hamamböceği, daha yüksek organizmalardaki bağırsak mikrobiyal topluluklarını anlamak için yararlı bir model sistemi olabilir, ancak hamamböceğinin haşere durumu da bu sistemi haşere kontrolü için uygun hale getirir21. Bağırsak topluluğunun hamamböceği sağlığı ve fizyolojisi üzerindeki etkisi hakkında temel bilgiden yararlanmak, haşere yönetimi için yeni teknikler geliştirmeye yardımcı oluyor.
Bu yöntemin amacı, gnotobiyotik Amerikan hamamböceğinin(Periplaneta americana)kurulması ve bakımının kapsamlı bir açıklamasını özetlemektir, ancak bu protokol herhangi bir oviparous hamamböceğinin nimflerini üretmek için kullanılabilir. Olgun oothecae'nin verimli, noninvaziv toplanması için bir yöntem ve böceklerin gnotobiyotik durumunu izlemek için tahribatsız bir teknik içerir22,23,24. Gnotobiyotik hamamböceği elde etmek ve sürdürmek için önceki yöntemler ootheca koleksiyonu23,24,25,26,27, ootheca olgunluğunu tanımlarken, türe özgü ipuçları açısından yorumlanır (Blattella germanica22,24,25'te ) veya açıkça tarif edilmeyen27,28, sisteme aşina olmayanlar için uygulamayı zorlaştırır. Burada açıklanan yöntem doğal olarak bırakılan oothecae kullandığından, yumurtaları zamanından önce çıkarma hatası yoktur. Bu protokol hem kültüre bağımlı hem de kültürden bağımsız kalite kontrol yöntemlerini içerir ve kültüre bağımlı yöntem böcekleri feda etmeyi gerektirmez. Son olarak, bu yöntem, gnotobiyotik hamamböceği elde etmek ve sürdürmek için gerekli tüm bilgilerle bir, kapsamlı protokol oluşturmak için birden fazla gnotobiyotik hamamböceği çalışmalarından gelen bilgileri bir araya getirir.
Protocol
1. Malzemelerin hazırlanması
- Stok hamamböceği kültürlerinin bakımı
NOT: Bu sağlam böcekleri yetiştirmenin birçok yolu vardır. Barınak ve su sağlama özellikleri erişilebilir malzemelere (yani karton tüpler yerine yumurta kartonlarına) bağlı olarak farklı olabilir. Aşağıdaki sterilizasyon protokolü herhangi bir stok tankı kurulumu için çalışacaktır.- 37,85 L (10 galon) balık tankına, tankın altını yaklaşık 1 inç yatak takımıyla kaplayacak kadar odun yatağı yayın. (Düz) kartonları parçalar halinde x 4'te 2'ye keserek muhafaza hazırlayın. Karton parçaları karton tüplere (örneğin tuvalet kağıdı tüpleri) yerleştirin ve tüpleri tankın bir ucuna yığın(Şekil 1).
- Böcek kaçışını önlemek için tankın içinin üst iki inçine ince bir petrol jeli tabakası sürün.
NOT: Tankın köşelerinin içini düzgün bir şekilde kaplayın. - Önceki bir stok tankından (işgal edilmiş) karton tüpleri aktararak, sakinlerini serbest bırakmak için sallayarak hamamböceği ekleyin. Her transfer için, 100−200 karışık yaş, karışık cinsiyet hamamböceği taşıyın. Köpek maması (20−30 adet) ekleyin, tanktaki köpek maması miktarını izleyin ve düşük olduğunda yeniden doldurun.
- Bir su kabı kurun.
- Küçük bir plastik yeniden kullanılabilir gıda kabını çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Selüloz süngerlerini ve yiyecek kabının kapağındaki delikleri yaklaşık olarak aynı boyuta kesin.
NOT: Selüloz süngerleri hamamböceğinin su kabında boğulmasını önler.
- Küçük bir plastik yeniden kullanılabilir gıda kabını çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Selüloz süngerlerini ve yiyecek kabının kapağındaki delikleri yaklaşık olarak aynı boyuta kesin.
- Süngerleri kapaktaki deliklere yerleştirin ve kapağı dolu kabın üzerine yerleştirin. Kabı tanka yerleştirin ve düşük olduğunda yeniden doldurun. Tankı pamuklu bezle örtün ve elastik bir bantla yerine sabitleyin.
- Tanklar aşırı miktarda frass ve böcek karkası biriktirmeye başladıkça, yeni tanklar kurun ve hamamböceği aktarın.
NOT: Tanklar genellikle her 6 ayda bir aktarılır. Kullanımdan kaldırılan stok tanklarında kalan hamamböceği / yumurtaları 1 saat boyunca -20 °C'de dondurularak ötenaziye tabi edilir ve stok tankının içeriği daha sonra bir otoklav torbasına aktarılır ve imha edilmeden önce otoklavlanır (1 saat, yerçekimi döngüsü). Stok tankları kullanımlar arasında% 2 çamaşır suyu ile sterilize edilir.
- İkincil bir kabı dezenfekte edin.
NOT: Bu kap filtre içermez, bunun yerine ücretsiz hava değişimine izin verir.- Hem kapağın hem de tabanın içini% 2 çamaşır suyu ile püskürtün ve 10 dakika boyunca ıslatmalarını bırakın. Çamaşır suyunu temiz bir kağıt havlu ile silin.
- Kapağın içini ve altını % 70 etanol ile püskürtün ve temiz bir kağıt havlu ile kurulayın. Kullanıma kadar kapağı değiştirin.
- Yumurtaları kuluçkaya yatırıp nimfleri muhafaza etmek için BHI çekikleri ve mataraları yapın.
- BHI'yi paket talimatlarına göre hazırlayın, % 2 agar ekleyerek. BHI-agar çözeltisini netleşene kadar kaynatın.
- Eğimler için, 5 mL aliquots'ı 18 mm x 150 mm cam test tüplerine ve kapağına aktarın. Otoklav ile sterilize edin (sterilizasyon süresi = 20 dk, sıvı döngüsü). Çekiklere soğuması için otomatik kapatılmış tüpleri 45° açıyla yerleştirin. Katılaştıktan sonra, kurumasını önlemek için kullanıma kadar soğutun.
- Şişeler için, şişenin altını tamamen örtmek için 10 mL'lik haşlanmış BHI-agar çözeltisini 250 mL Erlenmeyer şişelerine aktarın. Şişeyi folyo ile örtün ve otoklav (20 dk, sıvı döngüsü) ile sterilize edin. Kurumasını önlemek için otomatik kapatılmış şişelerin soğumasını ve kullanıma kadar soğutulmasını bekleyin.
NOT: Bu kurulum için hava filtresi gerekmez. Folyo kapak, açık hava akışından kaynaklanan kirlenmeyi önlerken gaz değişimine izin vermek için yeterlidir.
- Otoklav ile sterilize edin: folyo kaplı bir beherde (sterilizasyon süresi = 1 saat, yerçekimi döngüsü), kapaklı bir şişede ddH 2 O (sterilizasyon süresi =20dk, sıvı döngüsü) ve folyo kaplı bir beherde toparlama (sterilizasyon süresi = 20 dk, yerçekimi döngüsü) yarım boyutlara (~1/2 inç parçalar) bölünen otoklavlanabilir sıçan chow.
NOT: Sıçan çorbası kabını fazla doldurmayın. Peletler otoklavda şişecek. - Bir "doğumhane" tankı kurun.
NOT: Bu tank stok tankları (karton tüpler, süngerli su yemekleri, köpek maması, odun yatağı; bkz. Şekil 1)ile aynı malzemeleri içerir ve oothecae koleksiyonu için aktarılmadığı sürece hamamböceği boş olmalıdır (bkz. bölüm 2). - Aşırı doymamış sodyum klorür (NaCl) çözeltisi dolu bir beher hazırlayarak bir inkübatöre nemlendirin. 100 mL ddH2O başına 37 g NaCl ekleyerek ve çözünene kadar karıştırarak bu çözeltiyi hazırlayın.
NOT: Tipik olarak, 500 mL doymuş tuz çözeltisi tipik olarak oda boyutları 51 cm x 46 cm x 46 cm (H x W x D) olan bir inkübatöre daha fazla su eklenmeden önce yaklaşık bir ay boyunca nemlendirilir.
2. Oothecae Koleksiyonu
- Gravid dişileri içeren karton tüpleri taşımak için forseps kullanarak stok tanktan "doğumhaneye" oothecae (Şekil 2) taşıyan kadınları (planlanan deneyler için uygun olan herhangi bir sayıda) aktarın.
- Bir karton tüp gravid dişiye ek olarak birden fazla böcek içeriyorsa, önce tüpü petrol jölesi ile halkalanmış ek bir plastik kaba sallayın ve ardından hedef böceği tek başına karton tüpe geri tırmanmaya teşvik edin.
- Dişileri oothecae'lerini düşürdükten sonra stok tankına geri transfer edin. Oothecae'yi tanktaki çöpten kümespsleriyle alın.
NOT: Oothecae genellikle transfer edilen dişinin 24 saat içinde düşürülır.
3. Oothecae'nin temizlenmesi
- 3 mL sodyum dodecyl sülfat (SDS) içeren 5 mL santrifüj tüpüne oothecae ekleyin. 10 sn için girdap. Taze SDS içeren bir santrifüj tüpü ile ikinci bir yıkama adımı için tekrarlayın.
NOT: 3 mL SDS başına en fazla beş oothecae kullanılabilir. - Hassas bir görev mendili kullanarak, herhangi bir döküntüyü gidermek için her ootheca'nın yüzeyini hafifçe ovalayın. Kapsamlı temizliğe yardımcı olmak için daha fazla SDS eklenebilir. Temizlenmiş oothecae'yi sterilizasyona hazır olana kadar bir tartım teknesine yerleştirin.
NOT: Protokol burada duraklatılabilir, ancak oothecae'yi düşük nem ortamlarında uzun süre (günler ila haftalar) bırakmak, susuz kalmalarına ve canlılıklarını kaybetmelerine neden olacaktır.
4. Oothecae'nin sterilizasyonu ve inkübasyonu
- Sterilizasyon sonrası durulama için aliquot steril su. Sterilize edilecek her ootheca için, iki adet 1,5 mL santrifüj tüpünü 1 mL steril su ile doldurun.
- 10 μL konsantre ekleyin (%32) sterilizasyon için% 0.1 çözelti oluşturmak için 5 mL santrifüj tüpünde3.2mL ddH 2 O'ya perasetik asit stok çözeltisi. Karıştırmak için birkaç kez kaplayın ve ters çevirin.
DİkKAT: Perasetik asit cilt veya akciğerlerle temas halinde zararlıdır. Duman kaputunda seyreltin.
NOT: Bu sterilizasyonla aynı gün yapılmalıdır. Önceden seyreltilirse, çözelti hızla ayrışır ve bu nedenle düzgün bir şekilde sterilize etmez. Beş kadar temizlenmiş oothecae, 3,2 mL seyreltilmiş asitte sterilize edilebilir. - 5 dakika boyunca % 0.1 perasetik asit çözeltisine (beş adede kadar) temizlenmiş oothecae yerleştirin. Tüpü her 60 s'de birkaç kez ters çevirin.
- Laminer akış davlumbazında, her ootheca'yı aliquoted steril durulama suyu ile kendi santrifüj tüpüne aktarmak için steril tokmaklar kullanın (adım 4.1). Karıştırmak için birkaç kez ters çevirin. İkinci bir durulama için tekrarlayın, ardından her durulanmış ootheca'yı steril forseps kullanarak kendi BHI eğimine aktarın.
- Eğimleri sterilize edilmiş ikincil kaba yerleştirin. Kabı, yumurtadan çıkana kadar 4−5 hafta boyunca 30 °C'de nemlendirilmiş inkübatöre taşıyın.
NOT: Çekikler küçük bir test tüpü rafı veya orta/küçük bir beher tarafından dik tutulabilir. - Eğimleri düzenli olarak kontrol edin (haftada 1−2x). Agar üzerinde mantar veya bakteri kolonisi büyümesi görülürse, kontamine eğimi çıkarın. Dört haftalık zaman noktası yaklaştığında, her gün eğimleri kontrol edin.
NOT: Yumurtadan çıktıktan sonra, nimfler sadece BHI'de birkaç haftaya kadar hayatta kalabilir, ancak en iyi şekilde büyümez.
5. Gnotobiyotik nimflerin bakımı
- Laminer akış davlumbazında, sterilize edilmiş bir fare çorbası peletini steril tokmaklarla hazırlanmış bir BHI şişesine (adım 1.3.3'ten itibaren) aseptik olarak aktarın. Sterilite kontrolü olarak, şişeyi ikincil kaba 24 saat boyunca 30 °C inkübatöre yerleştirin ve büyüme görülürse kullanmayın.
- BHI şişesine steril gıda pelet ile nimfler ekleyin. Onları BHI eğimlerinden sallayın ve laminer akış başlığındaki şişeye düşmelerine izin verin.
NOT: Perilerin test tüpünün cam duvarlarında çekiş gücü yok. Onları eğimden çıkarmak için tüpü sallamak ve daha sonra camdan şişeye kaymalarını sağlamak için tüpü devirmek etkilidir. Nimfler kümesler kullanılarak transfer edilebilirken, ölümcül yaralanma riski yüksektir. - Haftada bir kez laminer akış davlumbazında 300 μL steril su ile su nimfleri doğrudan şişenin BHI zeminine pipetle.
- Nimf dışkı bhi zeminini kaplamaya başladığında, yeni bir BHI şişesine aktarın, sterilize edilmiş sıçan chow'u 24 saat önceden (steriliteyi doğrulamak için) adım 5.1'de olduğu gibi ekleyin.
6. Sterilitenin kalite kontrolü
- Kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi (RFLP) yoluyla gnotobiyotik durumun kültürden bağımsız kalite kontrol kontrolü için bhi şişesinden bir nimf çıkarın. Bunu yapmak için, periyi steril bir santrifüj tüpüne dökün (adım 5.1'den nymphal transferine benzer) veya şişeye steril bir ahşap aplikatör yerleştirin ve bir perisinin tırmanmaya başlamasını bekleyin, ardından santrifüj tüpüne aktarın.
- Santrifüj tüpündeki nimflere 0,5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve tüm büyük parçalar parçalanana kadar steril bir mikropestle homojenize edin. Girdap iyi.
- Aşağıdaki gibi bakteriyel bir DNA ekstraksiyon kiti ( Malzeme Tablosu) kullanarak nimfhomojenatındanDNA çıkarın.
- Homojenize nimfleri 5.000 x g'da 10 dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Bir termal çalkalayıcıyı önceden 37 °C'ye ısıtın.
- Peletin tamamen yeniden canlansın diye 100 μL 1x Tris-EDTA ve girdap ekleyin. Önceden ısıtılmış 37 °C termal çalkalayıcıya 10 μL lysozyme ekleyin ve karıştırın, ardından 30 dk (sallama yok) inkübasyon.
- Örneklere 25 mg cam boncuk ve 5 dakika boyunca maksimum hızda girdap ekleyin. Termal çalkalayıcıyı önceden 55 °C'ye ısıtın.
- Süpernatantı 100 μL proteinaz K tamponu ve 20 μL proteinaz K. Vortex ile yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarmadan önce boncukların yerleşmesine izin verin.
- 600 rpm'de sallanarak, 60 dakika boyunca 55 °C termal çalkalayıcıda kuluçkaya yaslanın. 2 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj ve süpernatantı yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. Termal çalkalayıcıyı önceden 65 °C'ye ısıtın. Elution tamponunu 65 °C hibridizasyon fırınında önceden ısıtmaya başlayın.
- %100 etanol 220 μL ekleyin. 20 sn için maksimum hızda girdap. 10x yukarı ve aşağı pipetleme ile görünür çökeltme parçala.
- 2 mL toplama tüpüne bir DNA sütunu yerleştirin ve örneği oluşmuş olabilecek çökeltmeler de dahil olmak üzere sütuna aktarın. 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj, toplama tüpünden filtrat atın ve toplama tüpünü değiştirin.
- Sütuna 500 μL bağlama arabelleği ekleyin ve 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj ekleyin. Toplama tüpünden filtrat atın ve toplama tüpünü değiştirin.
- Sütuna 700 μL DNA yıkama tamponu ekleyin ve 1 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj ekleyin. Toplama tüpünden filtrat atın ve toplama tüpünü değiştirin. İkinci bir yıkama adımı için tekrarlayın.
- Boşaltmak için boş sütunu 2 dakika boyunca santrifüjlayın, sütunu daha sonra yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 50 μL önceden ısıtılmış elution tamponunu doğrudan DNA sütun matrisine ekleyin ve 5 dakika boyunca 65 °C'de kuluçkaya yatırın.
- Santrifüj 10.000 x g'da 1 dakika boyunca elüte edin. Filtrattaki çıkarılan DNA'nın spektrofotometri veya florometri ile ölçülmesini.
- Tüm 16S genlerini güçlendirin ve sindirin. Jel elektroforez kullanarak parçaları görselleştirin.
- Toplam reaksiyon hacmi için 12,5 μL 2x ana karışım, 0,5 μL her astar 1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT) ve 27F (5'-AGAGTTTGATCCCCTGGCTCAG), 5 ng DNA ve moleküler dereceli su kullanın.
- Aşağıdaki termosikler programını çalıştırın: 60 s için 94 °C; ardından 30 s için 94 °C 35 döngü, 45 s için 50 °C, 90 s için 68 °C; ardından 5 dakika boyunca 68 °C.
- Dna saflaştırma kiti(Malzeme Masası)kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ürününü saflaştırın.
- KARıŞTıRMAk için PCR ürününe ve girdabına 120 μL arındırıcı tampon ekleyin. Kapağın içindeki damlacıkları toplamak için kısaca santrifüj. 2 mL toplama tüpüne bir DNA sütunu yerleştirin, sıvıyı hazırlanan sütuna aktarın ve 1 dakika boyunca 13.000 x g ≥ santrifüj.
- Filtrat atın ve toplama tüpünü değiştirin. 1 dakika boyunca 13.000 x g ≥ 700 μL DNA yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. Filtrat atın ve toplama tüpünü değiştirin. İkinci bir yıkama adımı için tekrarlayın.
- Boş sütunu kurutmak için 2 dakika santrifüjlayın ve sütunu yeni bir 1,5 mL santrifüj tüpüne aktarın. 50 μL önceden ısıtılmış elution tamponunu doğrudan DNA sütun matrisine ekleyin ve oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
- Santrifüj 10.000 x g'da 1 dakika boyunca elüte edin. Çıkarılan DNA'nın filtrattaki spektrofotometri veya florometri ile ölçülmesini.
- Toplam 50 μL reaksiyon hacmi için 5 μL sindirim tamponu, 10 birim RsaI ve moleküler dereceli suya 1 μg saflaştırılmış PCR ürünü ekleyin.
- Sindirilen ürünü% 2 agarose jel üzerinde 20 μL sindirilmiş DNA çalıştırarak jel elektroforezi ile ayırın. Gnotobiyotik durumu doğrulamak için jeli görselleştirin.
NOT: Gnotobiyotik böcekler sadece 402 bp, 201 bp'de bantlar ve endosimbiyot Blattabacterium'un16S rDNA dizisine dayanarak 163 ila 148 bp arasında bir smear ile sonuçlanmalıdır. Jelde görülen ekstra bantlar mikrobiyal türlerin kontamine olduğunu gösterir.
7. Nimf büyümesinin aseptik takibi
- Böcekleri şişenin yarı saydam BHI zemininden ölçerek nemsel büyümeyi izlemek için vücut uzunluğunu kaydedin.
NOT: Nimfler, hareketlerini yavaşlatmak için 15 dakika boyunca 4 °C'ye yerlenebilir, böylece ölçülmeleri daha kolay hale getirilebilir.
Representative Results
Stok tankları Şekil 1'degösterildiği gibi ayarlanmıştır. "Hamile" dişiler, Şekil 2'debelirtildiği gibi, arka karına bağlı ootheca tarafından tanımlanır. BHI agar üzerinde oothecae inkübasyonu, tahribatsız bir şekilde gnotobiyotik kalite kontrolü sağlar. Bazı durumlarda, sterilizasyon başarısız olur ve Şekil 3B'deolduğu gibi oothecae etrafında büyüme görülür. Bu oothecae çıkarılmalı ve atılmalıdır. Elimizde sterilizasyon için ortalama %10 başarısızlık oranı gözlendi (n = 51). Oothecae, Şekil 3A'da görüldüğü gibi, ortamda büyümeden sterilizasyondan ortalama 34gün sonra yumurtadan çıkar. Sterilize edilmiş, kirlenmemiş oothecae için% 41 (n = 46) tipik kapak oranları gözlemledik ve ootheca başına ortalama 11 nimf. Daha büyük nimfler, Şekil 4'teolduğu gibi folyo ile kaplı BHI şişelerine aktarılır. Folyo kirlenmeyi önler ve nimflerin büyümesi için yer vardır. Homojenize bir nimften 16S rDNA'nın RFLP'si gnotobiyotik durumu doğrulamak için kullanılır. Gnotobiyotik nimflerin, Şekil 5'tetemsil edildiği gibi steril olmayan meslektaşlarından daha yavaş bir hızda büyüdüğü gözlenmiştir. Şekil 6, başarılı bir şekilde gnotobiyotik böceklerin yanı sıra standart (nonsterile) nimflerden elde edilen sonuçları görüntüler.
Bu test henüz pozitif bir kültür sonucunun yokluğunda kontaminasyon tespit etmese de, bu adım, kirletici oksijene duyarlı veya titiz mikropların varlığını dışlamak için kritik deneyler sırasında rutin olarak gerçekleştirilmiştir. Gnotobiyotik hamamböceklerinde standart / nonsteril böceklerle karşılaştırıldığında daha yavaş büyüme gözlenmiştir.
Şekil 1: Hamamböceği stok kültürü kurulumu.
Karton tüpler tankın en ucunda istiflenmiş olarak görülebilir. Yiyecek ve su tankın ön tarafına yakındır. Görünürlük için pamuklu bez kapak ve elastik bant çıkarılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: "Hamile" bir Amerikan hamamböceği.
Ok ootheca'yı gösteriyor. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: BHI eğimlerinde başarılı bir şekilde gnotobiyotik nimflerin yumurtadan çıktığı ve başarısız bir şekilde sterilize edildiği oothecae görüntüleri.
Oothecae bu protokolde açıklandığı gibi sterilize edildi ve kuluçkaya kaldırıldı. (A) BHI eğiminde mikrobiyal büyüme olmaması, böceklerin kült organizmalardan arındığını gösterir. (B) Koloni oluşumuna neden olan çekiklerdeki Oothecae kontamine olarak atılmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Gnotobiyotik yetiştirme aparatı.
Böcekler, kirlenmeyi önlemek için folyo kapakla kaplı steril şişelerde tutulur. İkincil kap (yeşil kapak) % 2 çamaşır suyu ve ardından% 70 etanol ile sterilize edilir. İkincil kapta hava akışı kısıtlanmamış. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Gnotobiyotik ve nonsteril nimflerin vücut uzunluklarını karşılaştıran temsili büyüme hızı verileri. Her iki böcek grubu da otoklavlı kemirgen diyeti ile beslendi. Gnotobiyotik böcekler (burada: n = 105) açıklandığı gibi BHI'de tutulur. Nonsteril böcekler (burada: n = 50) su için küçük yemekler ile otoklavlı woodchip yatakları ile şişelerde yaşar. Nonsteril nimfler ortalama 0.059 mm/gün, gnotobiyotik nimfler ise 0.028 mm/gün (p < 0.0001) büyür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kalite kontrolü için RFLP sonuçlarının temsili jel görüntüsü.
Tüm-16S gen amplikonları RsaI ile sindirildi. PCR DNA'sı 1x PBS'de homojenize edilmiş nimflerden çıkarıldı. "G nimf" şeritleri gnotobiyotik nimflere, "konv perisi" şeritler ise geleneksel, nonsterile muadillerine karşılık gelir. Sanal kısıtlama özetine dayanarak, endosymbiont(Blattabacterium) 402 bp, 206 bp ve 163 bp boyutlarında bantlara sahip olması ve 163 bp ile 148 bp arasında bir bant lekesi olması bekmektedir. Bir gnotobiyotik böcek sadece Blattabacterium bantlama desenini göstermelidir. Karışık bir bakteri topluluğunun, burada "diğer bakteriyel 16S parçaları" olarak etiketlenmiş, farklı boyutlarda bantlara sahip olması bekmektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Gnotobiyotik hamamböceği neslini tanımlayan diğer yöntemler ya oothecae koleksiyonunu tanımlamadı ya da oothecae'nin anneden ne zaman çıkarılabileceğini belirtmek için diğer hamamböceği türlerine özgü kriterler kullandı23,25,26. Başlangıçta, oothecae stok tanklarındaki odun yatağı yataklarından toplandı ve bu da çok düşük kapak oranlarına (~% 10) neden oldu. sterilize edilmemiş oothecae ile karşılaştırıldığında (%47)29. Bunun nedeni muhtemelen, unhatched oothecae'nin stok kafesinde zaman içinde birikmesi ve ootheca yaşını veya yaşayabilirliğini doğrulamanın bir yolu olmamasıdır. "Doğumhane" yaklaşımının uygulanması, bilinen yaşta yeni yatırılmış oothecae'nin toplanmasına izin verir. Bu, deneysel planlamayı daha da kolaylaştırır, çünkü araştırmacı bireysel oothecae için olası kuluçka sürelerini tahmin edebilir. İlk ve yayınlanan protokollerden bir başka değişiklik, aşırı doymamış bir sodyum klorür çözeltisi içeren yarı kapalı odalarda oothecae ve nimflerin inkübasyonunu içerir. Çözeltinin varlığı yaklaşık% 7530bağıl nem korur. Oothecae rutin olarak 30 ° C'de inkübe edilir, bu da inkübasyon için gereken gün sayısını en aza indirirken embriyoların canlılığını ve ootheca başına üretilen nimf sayısını en üst düzeye çıkardığı gösterilmiştir31. Kuluçkadan çıktıktan sonra, gnotobiyotik nimfler laboratuvar odası sıcaklığında ve ortam koşullarında tezgahta rutin olarak kültürlenir, ancak nem kontrollü odalar yine kritik deneyler için kullanılır. Ootheca toplama ve inkübasyonda bu değişikliklerin kurulmasından sonra, kontaminasyon nedeniyle çıkarılan oothecae dahil olmayan kapak oranları yaklaşık% 41'e (n = 51) yükseldi. Tarama oranlarının daha da optimizasyonu için potansiyel bir rota, ootheca toplama ve sterilizasyon arasındaki süreyi uzatmayı içerebilir. Yumurta kasasının manikül ilk salınımında tam olarak bronzlaşmayabilir32ve bu nedenle düşürüldükten sonraki 24 saat içinde sterilizasyon sırasında kullanılan çözeltilere geçirgen olabilir.
%0,1 perasetik asit kullanan sterilizasyon protokolü Doll ve ark.25'tenuyarlanmıştır. Diğer çalışmalar oothecae23,26sterilizasyon için alternatif teknikleri belgelemıştır. Kontaminasyon oranları, oothecae'yi BHI eğimine inkübe etmenin tahribatsız yöntemine dayanmaktadır. Bu yaklaşım, kontamine oothecae'nin hızlı tanımlanmasına ve giderilmesine izin verdiği için son derece avantajlıdır. Önceki protokollerin çoğu bakteriyolojik ortamda dışkı veya nimf homojeneti kaplayarak ve büyüme 22 , 23, 25,27,28,33kontrolederekkültlenebilir organizmalar için test eder. En az bir durumda, gnotobiyotik durumu test etme yöntemi tam olarak tanımlanmamıştır26. Yetiştirme şişelerine küçük bir sterilite test ortamı ekleyen Clayton hariç24, önceki yöntemler22,23, 23 barındırılan gnotobiyotik böcek bakteriyolojik ortamda sadece sterilizasyon protokolünü değerlendirmek için kısa süreler için.
Elde edilen nimflerin BHI ortamında yerleşik bir kalite kontrol önlemi olarak sürekli olarak muhafaza edilmesi, gnotobiyotik durumlarının yarı gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar - önceki yöntemlerin çoğunda görülmeyen bir teknik22,23. Bu, özellikle gnotobiyotik nimflere erişilmesini gerektiren uzun süreli deneyler için yararlıdır. Nimflerin altındaki BHI zemini bakteriyel veya mantar büyümesi ile kontamine olmuş görünüyorsa, şişe atılmalıdır. Bu tür kirlenme tipik olarak şişeleri su perilerine ortaya çıkarırken ortaya çıkar, ancak yetersiz sterilize edilmiş oothecae veya yiyecek durumunda dışkıdan da kaynaklanabilir. Sulama yaparken laminer akış davlumbazının kullanılması, şişelerin ortaya çıkarılmasından kaynaklanan kirlenme oranını artırır.
Tüm kirletici organizmalar BHI ortamında aerobically büyüyebileceğinden, kültürden bağımsız ek bir sterilite testi yöntemi gereklidir. Potansiyel yaklaşımlardan biri mikroskopi27, ancak bu yaklaşım emek yoğun olabilir. Diğer protokoller, kültür14,23 , 27,28'denkaçabilecek organizmaları tespit etmek için sıra tabanlı teknikler kullanır. Bununla birlikte, bu tür yaklaşımlar genellikle pahalıdır ve yorumlaması zordur, çünkü yüksek verimli sıralama yaklaşımlarının sonuçları, reaktiflerin düşük düzeyde kirlenmesi34 ve barkod atlama35 .'denkolayca etkilenebilir. Bunun yerine, hem endosymbiont hem de kontamine bağırsak simbiontlarını görselleştirmek için kısıtlama parça uzunluğu polimorfizmi ile birlikte 16S rRNA geninin PCR amplifikasyonunu kullanan yeni bir yaklaşım geliştirilmiştir. Bu teknik bir iç PCR kontrolü içerir, çünkü Blattabacterium'un16S geni sıralanmıştır ve bantlama deseni hem gnotobiyotik hem de nonsterile böceklerde bulunmalıdır. Endosymbiont'un kısıtlama deseni genom dizisi36'dantahmin edilebileceğinden, herhangi bir kirleticinin tanımlanması istenmediği sürece ampliconları veya kısıtlama parçalarını sıralamaya gerek yoktur. Bu protokolün geçerli sürümü PCR / RFLP için bir nimf feda edilmesi gerektiğini gerektirir, ancak bu teknik dışkı üzerinde tahribatsız bir önlem olarak da kullanılabilir. Bununla birlikte, dışkı çok fazla Blattabacteriumiçermemesi gerektiğinden, yerleşik bir kontrol içermeyecektir.
Yetiştirme gnotobiyotik hayvanların ek olarak kolayca değiştirilebilir ancak kritik bir bileşeni diyettir. BHI agar böcekler için geçici bir besin kaynağı olarak hizmet edebilirken, uzun süre tek besin kaynağı olarak kullanıldığında nimfler arasında önemli büyüme açıklarına neden olduğu bulunmuştur. Çeşitli diyetler denenmiş olsa da, gnotobiyotik böceklerin bakımı için rutin bir diyet olarak otoklavlanabilir sıçan yemeği önerilir. Sterilizasyon için özel olarak formüle edilmemiş diyetlerin tamamen steril hale getirilmesi genellikle zordu ve birçok steril veya otoklavlanabilir laboratuvar hayvan diyetinin steril olmayan koşullar altında hızlı mantar büyümesi sergilediği bulunmuştur. Nonsteril koşullar altında bozulma eğilimi, onları doğrudan gnotobiyotik ve nongnotobiyotik böcekleri karşılaştıran deneylerde kullanım için uygun hale getirdi. Önerilen diyet, gnotobiyotik ve standart nimfler arasında tutarlı bir diyet kullanılmasına izin verir ve iki grup arasında büyüme oranları gibi özelliklerin karşılaştırılmasını kolaylaştırır.
Diğerleri27gözlemlediği gibi, gnotobiyotik nimfler nonsterile meslektaşlarından daha yavaş büyür. Aynı beslenen gnotobiyotik (n = 105) ve nonsteril nimflerin (n = 50) vücut uzunlukları arasında bir karşılaştırma, otoklavlı kemirgen diyeti ve oda sıcaklığında tutulan nonsteril nimflerin ortalama 0.059 mm / gün büyüdüğünü, gnotobiyotik nimflerin ise 0.028 mm / gün büyüdüğünü ortaya koymaktadır (p < 0.0001) (Şekil 5). P. americana'da bağırsak mikrobiyotasının varlığının böceklerin metabolik hızını değiştirdiği gösterilmiştir37ve genel olarak bağırsak topluluklarının besin emilimini etkilediği düşünülmektedir38,39. Bu nedenler, gnotobiyotik ve nonsteril nimflerin büyüme hızında gözlenen farklılıkları desteklemez.
Bu tekniğin olası bir sınırlaması, gnotobiyotik nimflerin cinsel olgunluğa ulaşamayabileceğidir, çünkü en eski steril kohortlar 10 aydan daha eskidir ve vücutuzunluğunagöre yaklaşık olarak sadece yedinci instara (10; 11 yetişkinlikten) ulaşmıştır. Bu en eski kohortlar otoklavlı sıçan diyetinde değil, bunun yerine aşırı küf büyümesi olmadan nonsterile kohortlara beslenemeyecek kadar fazla nem içeren ışınlanmış sıçan yemeği yiyorlar. Sterilize edilmemiş köpek maması diyetindeki nonsteril nimflerin laboratuvar koşullarında (oda sıcaklığı ve nem) 9−10 ay sonra yetişkinliğe ulaştığı bulunmuştur. Paylaşılan, otoklavlı sıçan chow üzerindeki gnotobiyotik ve nonsteril nimf kohortları şu anda 7 aydan daha eskidir, nonsteril böceklerin yedinci instar (ortalama: 16,7 mm) olduğu tahmin edilirken, steril böceklerin beşinci instar (ortalama: 11,2 mm) olduğu tahmin edilmektedir. Sonuç olarak, henüz gnotobiyotik hamamböceklerimizin başarılı bir şekilde üreyip üreyemeyeceğini doğrulayamayız. Bununla birlikte, bu yaklaşım kullanılarak yeni gnotobiyotik kohortların kurulabileceği kolaylık göz önüne alındığında, bu yöntem gnotobiyotik böceklerin kanıtlanmış üremesinin yokluğunda bile büyük umut vaat eder.
Sonuç olarak, bu protokol mikrobiyom araştırmacılarının ortak laboratuvar materyallerini kullanarak kendi düşük maliyetli gnotobiyotik "tesisini" çalıştırmalarını sağlayan çok yönlü bir araç sağlar. Bu yaklaşım, mikrobiyotanın konak davranışını, bağışıklığını, gelişimini ve stres yanıtlarını şekillendirmedeki rolünü inceleyen deneyler için gnotobiyotik hamamböceği oluşturmak için kullanılabilir21,26,27. Bu gnotobiyotik böcekler ayrıca sentetik veya ksenobiyotik topluluklarla aşılanabilir ve daha sonra bağırsak mikrobiyom çalışmaları için denek olarak kullanılabilir23,28. Ayrıca, bakteriyolojik ortam kaplı inkübasyon odalarının yerleşik sterilite kontrolü olarak kullanılması da dahil olmak üzere bu yaklaşımın unsurları, diğer model sistemler için genelleştirilebilir ve daha küçük ölçekli tesislerde gnotobiyotik hayvanların rutin bakımını kolaylaştırabilir.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu yayın, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından R35GM133789 ödül numarası altında desteklendi. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitülerinin resmi görüşünü temsil etmek zorunda değildir. Yazarlar Josey Dyer'i sterilizasyon oranlarını, kuluçka oranlarını ve gnotobiyotik hamamböceğinin büyüme oranlarını takip etmesi için kabul etmek istiyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2X master mix | New England BioLabs | M0482 | OneTaq MasterMix |
| Autoclavable rat chow | Zeigler | NIH-31 Modified Auto | |
| Bacterial DNA extraction kit | Omega Bio-Tek | D-3350 | E.Z.N.A. Bacterial DNA kit; includes lysozyme, glass beads, proteinase K, buffers (proteinase K, binding, wash, elution), DNA columns, 2-mL collection tube |
| binding buffer | Omega Bio-Tek | PD099 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("HBC" buffer) |
| brain-heart infusion (BHI) broth | Research Products International | B11000 | |
| Delicate task wipes | KimWipe | JS-KCC-34155-PK | KimWipes |
| DNA purification kit | Omega Bio-Tek | D6492 | E.Z.N.A. Cycle Pure kit; D6493 may also be used; includes buffers (purifying ,wash, elution) |
| elution buffer | Omega Bio-Tek | PDR048 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| glass beads | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| Hybridization oven | UVP | 95-0330-01 | we use a hybridization oven for preheating elution buffer, but a water bath could probably also be used |
| Laminar flow biological safety cabinet | NuAire, Inc. | NU-425-400 | Protocol refers to this as "laminar flow hood" for brevity |
| lysozyme | Omega Bio-Tek | n/a | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit |
| peracetic acid stock solution (32%) | Sigma-Aldrich | 269336 | |
| Petroleum jelly | Vaseline | n/a | |
| proteinase K buffer | Omega Bio-Tek | PD061 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("TL buffer") |
| purifying buffer | Omega Bio-Tek | PDR042 | included in Omega Biotek's CyclePure kit ("CP" buffer) |
| RsaI | New England BioLabs | R0167 | Includes CutSmart (digestion) buffer |
| Secondary container | n/a | n/a | a plastic container with a lid (such as a Kritter Keeper) works well for this (25cm long x 15cm wide x 22cm high); it should be large enough to fit BHI slants and test tubes |
| spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000 | Catalog info is for NanoDrop2000 |
| thermal shaker | Eppendorf | EP5386000028 | Thermomixer R |
| Tris-EDTA | Fisher | BP1338-1 | 10 nm Tris, 1 mM EDTA, pH 8 |
| wash buffer | Omega Bio-Tek | PDR044 | included in Omega Biotek's bacterial DNA extraction kit ("DNA wash" buffer) |
| Woodchip bedding | P.J. Murphy Forest Products | Sani-Chips |
References
- Yi, P., Li, L. The germfree murine animal: An important animal model for research on the relationship between gut microbiota and the host. Veterinary Microbiology. 157 (1-2), 1-7 (2012).
- Nature Biotechnology. Laying better plans for mice. Nature Biotechnology. 31 (4), 263-263 (2013).
- Nicklas, W., Keubler, L., Bleich, A. Maintaining and Monitoring the Defined Microbiota Status of Gnotobiotic Rodents. ILAR Journal. 56 (2), 241-249 (2015).
- Faith, J. J., Ahern, P. P., Ridaura, V. K., Cheng, J., Gordon, J. I. Identifying Gut Microbe-Host Phenotype Relationships Using Combinatorial Communities in Gnotobiotic Mice. Science Translational Medicine. 6 (220), 11 (2014).
- Moon, C., et al. Vertically transmitted faecal IgA levels determine extra-chromosomal phenotypic variation. Nature. 521 (7550), 90-93 (2015).
- Eun, C. S., et al. Induction of Bacterial Antigen-Specific Colitis by a Simplified Human Microbiota Consortium in Gnotobiotic Interleukin-10-/- Mice. Infection and Immunity. 82 (6), 2239-2246 (2014).
- Cherbuy, C., et al. Microbiota matures colonic epithelium through a coordinated induction of cell cycle-related proteins in gnotobiotic rat. American Journal of Physiology: Gastrointestinal and Liver Physiology. 299 (2), 348-357 (2010).
- Van Den Abbeele, P., et al. Arabinoxylans and inulin differentially modulate the mucosal and luminal gut microbiota and mucin-degradation in humanized rats. Environmental Microbiology. 13 (10), 2667-2680 (2011).
- Stecher, B., Berry, D., Loy, A. Colonization resistance and microbial ecophysiology: using gnotobiotic mouse models and single-cell technology to explore the intestinal jungle. FEMS Microbiology Reviews. 37 (5), 793-829 (2013).
- Sugahara, H., et al. Probiotic Bifidobacterium longum alters gut luminal metabolism through modification of the gut microbial community. Scientific Reports. 5 (1), 13548 (2015).
- Martín, R., Bermúdez-Humarán, L. G., Langella, P. Gnotobiotic Rodents: An In Vivo Model for the Study of Microbe-Microbe Interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 409 (2016).
- Mallapaty, S. Gnotobiotics: getting a grip on the microbiome boom. Lab Animal. 46 (10), 373-377 (2017).
- Nguyen, T. L. A., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. How informative is the mouse for human gut microbiota research. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).
- Correa, M. A., Matusovsky, B., Brackney, D. E., Steven, B. Generation of axenic Aedes aegypti demonstrate live bacteria are not required for mosquito development. Nature Communications. 9 (1), 4464 (2018).
- Trinder, M., Daisley, B. A., Dube, J. S., Reid, G. Drosophila melanogaster as a High-Throughput Model for Host–Microbiota Interactions. Frontiers in Microbiology. 8, 751 (2017).
- Zheng, H., Steele, M. I., Leonard, S. P., Motta, E. V. S., Moran, N. A. Honey bees as models for gut microbiota research. Lab animal. 47 (11), 317-325 (2018).
- Engel, P., Moran, N. A. The gut microbiota of insects - diversity in structure and function. FeMS Microbiology Reviews. 37 (5), 699-735 (2013).
- Tinker, K. A., Ottesen, E. A. The Core Gut Microbiome of the American Cockroach, Periplaneta americana, Is Stable and Resilient to Dietary Shifts. Applied and Environmental Microbiology. 82 (22), 6603-6610 (2016).
- Zurek, L., Keddie, B. A. Contribution of the colon and colonic bacterial flora to metabolism and development of the american cockroach Periplaneta americana L. Journal of Insect Physiology. 42 (8), 743-748 (1996).
- Cruden, D. L., Markovetz, A. J. Microbial aspects of the cockroach hindgut. Archives of Microbiology. 138, 131-139 (1984).
- Pietri, J. E., Tiffany, C., Liang, D. Disruption of the microbiota affects physiological and evolutionary aspects of insecticide resistance in the German cockroach, an important urban pest. PLoS ONE. 13 (12), 0207985 (2018).
- Benschoter, C., Wrenn, R. Germfree techniques for establishment and maintenance of a colony of aseptic German cockroaches. Annals of the Entomological Society of America. 65 (3), 641-644 (1972).
- Tegtmeier, D., Thompson, C. L., Schauer, C., Brune, A. Oxygen Affects Gut Bacterial Colonization and Metabolic Activities in a Gnotobiotic Cockroach Model. Applied and Environmental Microbiology. 82 (4), 1080-1089 (2016).
- Clayton, R. A simplified method for the culture of Blattella germanica under aseptic conditions. Nature. 184 (4693), 1166-1167 (1959).
- Doll, J. P., Trexler, P. C., Reynolds, L. I., Bernard, G. R. The Use of Peracetic Acid to Obtain Germfree Invertebrate Eggs for Gnotobiotic Studies. American Midland Naturalist. 69 (1), 231 (1963).
- Wada-Katsumata, A., et al. Gut bacteria mediate aggregation in the German cockroach. Proceedings of the National Academy of Science. 112, 15678-15683 (2015).
- Jahnes, B. C., Herrmann, M., Sabree, Z. L. Conspecific coprophagy stimulates normal development in a germ-free model invertebrate. PeerJ. 7, 6914 (2019).
- Mikaelyan, A., Thompson, C. L., Hofer, M. J., Brune, A. Deterministic Assembly of Complex Bacterial Communities in Guts of Germ-Free Cockroaches. Applied Environmental Microbiology. 82 (4), 1256-1263 (2016).
- Katoh, K., et al. Group-housed females promote production of asexual ootheca in American cockroaches. Zoological Letters. 3, 3 (2017).
- Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81 (1), 89-96 (1976).
- Bressan-Nascimento, S., Oliveira, D. M. P., Fox, E. G. P. Thermal requirements for the embryonic development of Periplaneta americana (L.) (Dictyoptera: Blattidae) with potential application in mass-rearing of egg parasitoids. Biological Control. 47 (3), 268-272 (2008).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry, Second Edition. , Taylor & Francis. Philadelphia, PA. (2008).
- House, H. L. Nutritional studies with Blattella germanica (L.) reared under aseptic conditions I. Equipment and technique. The Canadian Entomologist. 81 (5), 94-100 (1949).
- Stinson, L. F., Keelan, J. A., Payne, M. S. Identification and removal of contaminating microbial DNA from PCR reagents: impact on low-biomass microbiome analyses. Letters in Applied Microbiology. 68 (1), 2-8 (2018).
- Kircher, M., Sawyer, S., Meyer, M. Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research. 40, 3 (2011).
- Sabree, Z. L., Kambhampati, S., Moran, N. A. Nitrogen recycling and nutritional provisioning by Blattabacterium, the cockroach endosymbiont. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 106 (46), 19521-19526 (2009).
- Ayayee, P. A., Ondrejech, A., Keeney, G., Muñoz-Garcia, A. The role of gut microbiota in the regulation of standard metabolic rate in female Periplaneta americana. PeerJ. 6, 4717 (2018).
- Krajmalnik-Brown, R., Ilhan, Z. E., Kang, D. W., DiBaise, J. K. Effects of gut microbes on nutrient absorption and energy regulation. Nutrition in clinical practice : official publication of the American Society for Parenteral and Enteral Nutrition. 27 (2), 201-214 (2012).
- Rowland, I., et al. Gut microbiota functions: metabolism of nutrients and other food components. European Journal of Nutrition. 57 (1), 1-24 (2018).
- Gier, H. T. Growth rate in the cockroach Periplaneta americana (Linn). Annals of the Entomological Society of America. 40, 303-317 (1947).
