Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Undersöka Flagella-driven motilitet i Escherichia coli genom att tillämpa tre etablerade tekniker i en serie

Published: May 10, 2020 doi: 10.3791/61364
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin

Summary

Många bakterier använder flagelladriven motilitet för att navigera i sin miljö och kolonisera gynnsamma omgivningar både individuellt och som kollektiv. Demonstrerat här är användningen av tre etablerade metoder som utnyttjar motilitet som ett urvalsverktyg för att identifiera komponenter / vägar som bidrar till simning och svärmande motilitet.

Abstract

Motilitet är avgörande för överlevnaden och framgången för många bakteriearter. Många metoder finns för att utnyttja motilitet för att förstå signalvägar, för att klargöra funktionen och monteringen av flagellära delar och för att undersöka och förstå rörelsemönster. Här demonstrerar vi en kombination av tre av dessa metoder. Motility i mjuk agar är den äldsta, erbjuder ett starkt urval för isolerande förstärkning av funktion suppressor mutationer i motility-nedsatt stammar, där motility återställs genom en andra mutation. Celltjudringstekniken, som först användes för att demonstrera den roterande karaktären hos flagellarmotorn, kan användas för att bedöma signaleffektorernas inverkan på motorvarvtalet och dess förmåga att växla rotationsriktning. Den "gränsövergångs"-analysen är nyare, där simbakterier kan primes för att övergå till att röra sig kollektivt som en svärm. I kombination representerar dessa protokoll ett systematiskt och kraftfullt tillvägagångssätt för att identifiera komponenter i motilitetsmaskineriet och för att karakterisera deras roll i olika aspekter av simning och svärmning. De kan enkelt anpassas för att studera motilitet hos andra bakteriearter.

Introduction

Bakterier använder många bilagor för rörelse och spridning i sina ekologiska nischer1. Flagella-driven motilitet är den snabbaste av dessa, främjar koloniseringen av gynnsamma språk som svar på miljösignaler och bidrar avsevärt till patogen förmåga hos vissa arter2,3. Flagellerade bakterier kan simma individuellt i bulkvätska, eller svärma som ett kollektiv över en halvfast yta4. Extracellulär flagella fäster vid och drivs av roterande motorer inbäddade i membranet, som utnyttjar jongradienternas kraft för att generera vridmoment som orsakar rotation1,2,4,5,6,7,8. I E. coli, vars motorer körs med konstantvridmoment 9,kan motoreffekten kategoriseras i termer av rotationshastighet och omkoppling av rotorn mellan moturs (CCW) och medurs (CW) riktningar. CCW-rotation främjar bildandet av ett sammanhängande flagellarpaket som driver cellen framåt (kör), medan en övergående omkopplare i rotationsriktning (CW) gör att bunten demonteras antingen delvis ellerhelt 10, och cellen för att omorientera sin simriktning (tumla). E. coli kör vanligtvis en sekund och tumlar i en tiondels sekund. Omkopplingsfrekvensen för rotorn eller "tumlande förspänning" styrs av signalsystemet för kemotaxis, där transmembrankemoreceptorer detekterar externa kemiska signaler och överför dem via fosforskikt till flagellarmotorn för att förlänga körningarna som svar på tilldragande medel eller undertrycka dem som svar på giftiga kemikalier11,12. Simning motility analyseras i 0,3% mjuk agar.

Under svärmning navigerar bakterier på en halvfast yta som ett tätt kollektiv, där förpackningar med bakterier strömmar i en kontinuerlig virvlande rörelse2,13,14,15. E. coli svärmar uppvisar förändrad kemosensori fysiologi (lägre tumla bias), högre hastigheter och högre tolerans mot antimikrobiella medel över celler som simmar ibulkvätska 16,17. Swarmers varierar i sin utplacering av en mängd strategier som hjälper rörelse, inklusive tensidproduktion, hyperflagellation och cellförlängning2. Swarming erbjuder bakterier en konkurrensfördel i både ekologiska och kliniskamiljöer 18,19,20. Det finns två kategorier av svärmande bakterier: tempererade swarmers, som endast kan svärma på media stelnade med 0,5-0,8% agar och robusta swarmers, som kan navigera över högre agarkoncentrationer21.

Det finns en mängd olika analyser för att förhöra simningsmotilitet och dess reglering. När nedsatt av mutationer eller miljöförhållanden, motility själv erbjuder ett starkt urval för att identifiera förstärkning av funktion suppressor mutationer. Dessa suppressorer kan vara äkta revertants av den ursprungliga mutationen, eller pseudo-revertants, där en andra mutation återställer funktionalitet. Sådana mutanter kan identifieras genom hel genomsekvensering (WGS). Ett alternativ till opartiskt urval av suppressorer är en partisk riktad mutagenesstrategi (t.ex. PCR-mutagenes). Dessa metoder belyser ofta funktionen eller miljöregleringen av motilitetsapparaten. Om målet är att studera motorisk funktion, kan återställandet av vild typ motilitet mätt i mjuk agar inte nödvändigtvis indikera restaurering av vild typ motorisk effekt. Cell-tjudringsanalysen, där celler fästs på en glasyta av en enda flagellum och rotation av cellkroppen därefter övervakas, kan vara den första analysen av valet för bedömning av motoriskt beteende. Även om mer sofistikerade metoder nu finns tillgängliga för att övervaka motoregenskaper, begränsar den nödvändiga höghastighetskamerauppsättningen och tillämpningen av programvarupaket för rörelseanalys deras utbreddaanvändning 22,23,24,25. Cell-tjudringsanalysen kräver endast att flagellan klipps, vilket gör det möjligt att fästa de korta filamenten på en glasbild, följt av videofilmning av cellkroppens rotation. Även om de registrerade motorhastigheterna är låga i denna analys på grund av den höga belastning som cellkroppen utövar på flagellum, har denna analys ändå bidragit till värdefulla insikter om kemotaktiskasvar 26,27,28,29, och förblir ett giltigt utredningsverktyg som diskuteras nedan.

Svärmande motilitet innebär en annan uppsättning utmaningar för forskare. Urval av funktionsbehämmande suppressorer fungerar endast i swarmers som producerar kopiösa tensider och svärmar lätt13. Tensidant icke-producenter som E. coli är kräsna när det gäller valet av agar, mediakomposition och fuktighet i miljön2,13,14,21. När svärmningsförhållandena har fastställts är gränsövergångsanalysen17 en användbar metodik för att förhöra en svärms förmåga att navigera i nya/hårda förhållanden. Även om de protokoll som presenteras nedan avser E. coli, kan de lätt anpassas för tillämpning hos andra arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Isolering av suppressormutanter i motilitetsbristande stammar

OBS: Använd denna metod som en bred "catch-all" för att identifiera den allmänna karaktären hos motilitetsdefekten.

  1. Beredning av mjuk agarplatta
    OBS: Soft-agar, även kallad motility- eller swim-agar, är en låg procent agar (~ 0,2-0,35% w / v), länge används för att analysera chemotaxis31,32.
    1. Tillsätt 3 g bacto-agar (0,3 % w/v) och 20 g LB till en 2 L rund bottenkolv. Tillsätt 1 L ddH2O (dubbeldestillerat vatten) i kolven och blanda suspensionen jämnt med en omrörningsstång och magnetisk omrörningsplatta.
    2. Autoklav i 20 min vid 121 °C.
    3. Låt svalna med skonsam omrörning med stången/plattan enligt ovan. När temperaturen når ca 50 °C, häll 25 ml i sterila petriskålar (100 mm x 15 mm) och låt den smälta agaren ställa in med lock på plats i minst 1 timme, för användning inom 16 timmar.
  2. Odlingspreparat, vaccination och isolering av suppressormutanter
    OBS: E. coli inokulerad i mitten av näringsrika medier stelnade med mjuk agar konsumerar näringsämnen lokalt, vilket skapar en näringsgradient som de följer. När de rör sig utåt visas definierade "ringar" (figur 1A), som är relaterade till specifika kemoattraktiva ämnen som bakterierna reagerar på. Defekter i antingen kemotaxissystemet eller strukturella komponenter i flagellamotorn kan äventyra prestandan i denna analys. Ofta uppstår mutanter med en motilitetsfördel under screeningen och kan ses komma från enstaka eller från flera punkter längs ringens periferi, varifrån de "blossar" ut (Figur 1C). Man kommer att märka att den yttersta kanten av badfronten kontrasterar lätt mot den ofärgade jungfruliga mjuka agaren.
    1. Odla över natten kulturer av önskad motilitet-bristfällig stam i 5 ml Lennox buljong (LB; 10 g/L tryptone, 5 g/L jästextrakt och 5 g/L NaCl, Materialförteckning)vid 30 °C med horisontell skakning (220 r.p.m.). Följande dag, subkultur (1:100 utspädning) i färsk LB, växer under samma förhållanden till exponentiell fas (OD600 av 0,6).
    2. Inokulera 6 μL av kulturen i mitten av en mjuk agarplatta (1.1) med en pipett och tryck in den laddade sterila spetsen i agaren för att försiktigt utvisa innehållet. Överföring till 30 °C och inkubera(figur 1B),tills motilitets "facklor" är uppenbara, som härrör från vaccinationspunkten eller motilitetsringarnas periferi, vanligtvis i 24-36 h (figur 1C).
      OBS: I motilitetsanalyser, inokulera en vild typ stam tillsammans med mutanta isolat för jämförelse. Denna stam av vild typ visar de karakteristiska koncentriska kemotakiska ringarna (figur 1A) och fyller plattan inom 8-10 timmar.
    3. Använd en steril trådslinga för att lyfta cellerna från "överstrålning" -regionen och strimla för att rena enstaka kolonier på en LB hård agarplatta (LB beredd enligt ovan, stelnad med 15 g/L bacto-agar).
    4. Välj enstaka kolonier från streckplattan med hjälp av en steril trådslinga och re rena genom att strecka för enstaka kolonier för att säkerställa isolering av ett "rent" koloniisolat.
  3. Bekräftelse och karakterisering av suppressormutanter
    1. Bekräfta att de isolerade suppressormutanterna har återställt motiliteten. Förbered mjukgarplattor (1.1) och kulturer för stammar av intresse (som i 1.2.1), inklusive vildtyp och den startstammen "motilitetsbrist" för jämförelse.
    2. Inokulera plattorna (som i 1.2.2) och inkubera vid 30 °C i 8-10 timmar.
    3. Registrera diametern på den yttersta ringen (cirkelns kant) och jämför med att fastställa vilken av isolaten som har återställt motiliteten avsevärt.
      OBS: Det rekommenderas att skyltar fotograferas under hela experimentet. För bästa resultat, använd en "hink med ljus"enhet 30, där en digitalkamera är monterad ovanför en ljuskälla för bättre belysning för att mäta diametern på simkolonin och skilja den från ofärgad agar.
    4. Ämnet verifierade isolat till WGS efter behov, vilket möjliggör tillräcklig "sekvens täckning" för att positivt identifiera mutationer som återställde vilda-typ funktion.

2. Kvantifiera flagellamotoriskt beteende via celltjudring

OBS: Använd den här metoden när normalt körningsbeteende (chemotaxis) verkar vara komprometterat.

  1. Kulturberedning och flagellasjuvning
    1. Förbered en exponentiell faskultur av intressestammen enligt beskrivningen i steg 1.2.1.
    2. Pellet 10 ml celler genom centrifugering vid 2 000 x g i 3 min innan de återanvänds i 10 ml filtersteriliserad motilitetsbuffert (MB; 10 mM kaliumfosfatbuffert [0,0935 M K2HPO4,0,0065 M KH2PO4,pH 7,0], 0,1 mM EDTA [pH 7,0], 10 mM NaCl, 75 mM KCl).
      OBS: MB stöder motilitet, men stöder inte bakterietillväxt
    3. Upprepa steg 2.1.2 ytterligare två gånger innan du återanvänder den slutliga pelleten i 1 ml MB.
    4. Överför cellfjädringen till en 1 ml spruta och fäst en 23G-nål i änden. Montera en identisk sprut-/nålapparat och fäst de två tillsammans via 6 tum polyetenrör (innerdiameter på 0,58 mm) tätt mantlade över varje nålspets.
    5. Skjuv flagella (de är bräckliga och bryts lätt) genom att försiktigt skicka cellupphängningen fram och tillbaka från en spruta till den andra 50x, med 1 min paus mellan varje 10 passningar.
    6. Centrifugera de skjuvda cellerna vid 2 000 x g i 3 min och återanvänd i en slutlig volym på 500 μL MB.
  2. Bildförberedelse och celltjudring
    1. Förbered en cellfixeringskammare genom att stapla ett 18 mm x 18 mm täckglas över en 3 tum x 1 tum x 1 mm glasmikroskopbild, separerad med dubbelsidig tejp (Figur S1).
    2. Spola kammaren med 0,01% (w/v) polylylyinlösning genom att applicera på toppen av kammaren. Luta nederkanten (täckglaset med mikroskopet glider) på en aktivitetstorkare (mjukpapper) för att hjälpa till att dra lösningen genom kammaren (figur S1). Inkubera sedan i rumstemperatur i 10 min.
    3. Tvätta kammaren tre gånger med 40 μL MB med hjälp av enligt beskrivningen i steg 2.2.2
    4. Tillsätt 40 μL av den skjuvda cellupphängningen (beredd ovan) på toppen av kammaren och inkubera vid rumstemperatur i 10 minuter så att cellerna kan fästas på täckglaset.
    5. Spola försiktigt kammaren med 40 μL MB som i 2.2.3 för att ta bort obundna celler.
  3. Registrering och kvantifiering av cellrotation
    1. Överför mikroskopbilden laddad med tjudrade celler till mikroskopstadiet.
    2. Använd faskontrastmikroskopi och ett 100x-mål, skanna populationen efter celler som är fixerade på plats och rotera på en enda axel,dvs.
    3. Använd ett kommersiellt mikroskop och tillhörande kamera. Öppna den tillhörande programvaran, se till att celler av intresse är i fokus och klicka på videoförvärv för att spela in cellrotationen i en minut (med 10 bilder per sekund eller högre).
    4. Från videouppspelning kvantifierar du antalet fullständiga rotationer per minut och antalet gånger cellen ändrar riktning (kopplingsfrekvens).
      OBS: Rotationshastigheter och kopplingsfrekvens kan vara för snabba att mäta med ögat så det rekommenderas att använda videoprogramvara som erbjuder långsam / fin uppspelning, eller antar ett automatiserat mjukvarusystem för att kvantifiera rotationsmönster33. Ett alternativ skulle vara att öka MB:s viskositet med metylcellulosa (eller liknande medel) för att hjälpa till att bromsa och lösa rotationen av snabbare bakterier eller kompensera när kameror med låga framerates används.
    5. Upprepa steg 2.3.2 med biologiska replikat för att sammanställa en representation av populationen av intresse.

3. Förberedelse av svärmar i en gränsövergångsanalys

OBS: Använd denna metod för att bedöma effekten av en mutation eller ett tillstånd på gruppmotilitet. Swarm-agar hänvisar till agar där procentandelen vanligtvis är högre än för mjuk agar. I mjuk agar (0,3 %), simmar cellerna individuellt inuti agar. I svärm agar (0,5% och högre) rör sig celler som en grupp på ytan. Medan svärmplattor måste användas som beskrivs här, har badplattor en längre hållbarhetstid och kan användas i flera dagar. Vår personliga preferens är att använda på 1-2 dagar.

  1. Förberedelse av svärm agar
    1. Tillsätt 5 g Eiken agar (0,5 % w/v) och 20 g LB till en 2 L rund bottenkolv. Tillsätt 1 L ddH2O till kolven och blanda fjädringen jämnt med en omrörningsstång och magnetisk omrörningsplatta.
    2. Autoklav i 20 min vid 121 °C.
    3. Låt svalna med skonsam omrörning för att undvika luftbubblor med stången/plattan enligt ovan. Tillsätt filtersteriliserad glukos för en slutlig koncentration på 0,5 % vid ca 50 °C.
    4. Häll 25 ml i sterila petriskålar (100 mm x 15 mm) och låt ställas in vid rumstemperatur i minst 14 timmar och högst 20 timmar. Förvara inte för framtida användning.
  2. Inokulering och inkubation av svärmplattor
    1. Inokulera 6 μL av en medel exponentiell kultur (beredd som i 1.2) genom att upptäcka ovanpå agaren.
    2. Låt locket vara avstängt i 5-10 min och byt ut det när inokulat har torkat i agarytan.
    3. Inkubera vid 30 °C i 8 timmar. Undvik frestelsen att inspektera svärmens framsteg genom att ta bort locket, eftersom detta kommer att bidra till torkning av agar och försämra svärmning.
      OBS: Inkubationstiden kan variera beroende på stammen fenotyp. Vissa isolerade mutationer kan hämma svärmning förmåga och kommer att kräva en minskad andel agar eller en mer långvarig period av inkubation.
  3. Utarbetande av gränsövergångsskyltar
    OBS: Denna analys använder en modifierad Petri-skål, där en plastklyfta (kant) skapar två kammare, snarare än en (figur 2A). Varje kammare kan förberedas oberoende av den andra och erbjuda olika förhållanden för svärmning, innan de "ansluter" de två. Beroende på experimentell design kan den första kammaren (utsedd vänster) beredas med antingen simgar (0,3% w/v) eller svärma agar (0,5% w/v) varifrån bakterierna kan migrera över gränsen till den högra kammaren som innehåller svärm agar +/- något nödvändigt tillägg eller utmaning (t.ex. antibiotika). Migration på endera agaren mäts/jämförs vanligtvis genom registrering av den bredaste diametern av bakteriell kolonisering (kant till kant) från den ursprungliga inokuleringspunkten.
    1. Förbered badagar enligt beskrivningen i 1.1 om det behövs.
    2. Förbered svärm agar som beskrivs i 3.1.
    3. Häll ~30 ml svärmagar (med önskad tillskott vid behov) i den högra kammaren i en petriskål med dubbla fack (100 mm x 15 mm), till den punkt där den är jämn med plastavdelaren mellan kamrarna, men inte överfyllda i vänster (figur 2B).
    4. När agaren har härdat, fyll den vänstra kammaren med ~ 30 ml simma eller svärma agar, igen till kontaktpunkten med plastklyftan (Figur 2C). Innan den sätter, använd en steril pipettspets för att försiktigt dra agaren över kantlinjen för att ansluta de två sidorna med en ~ 1 mm hög agarbro som sträcker sig över hela längden på klyftan (Figur 2D).
    5. Låt plattan torka i rumstemperatur (3.1).
      OBS: En alternativ metod för att skapa bro gör det möjligt för vänster kammar agar att torka och sedan långsamt pipett ~ 100 μL smält svärm agar längs plastavdelaren för att överbrygga de två kamrarna (3.4). Inokulera plattorna på den vänstra kammaren enligt ovan för simning (1.2.2) eller svärm (3.2) agar, innan du inkuberar vid 30 °C i 12-16 h, eller tills svärmar har gjort tillräckliga framsteg över den högra kammaren för att möjliggöra jämförelser mellan stammar av intresse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Isoleringen av pseudo-revertants i en E. coli stam vars motility är nedsatt av höga nivåer av signalmolekylen c-di-GMP, var detaljerad i senaste arbete från vårt labb34. Denna stam (JP1442) hyste två mutationer: ΔyhjHH och ΔycgR. YhjH är den mest aktiva fosfodiesteras som försämrar c-di-GMP i E. coli. Avsaknad av YhjH leder till förhöjda c-di-GMP nivåer och hämning av motility. YcgR är en c-di-GMP-effektor. I komplext med c-di-GMP binder YcgR till flagellarrotorn för att först inducera CCW-motorrotation och därefter minska motorhastigheten. Cell tjudring och pärla analyser visade att motoriskt beteende återvände till det normala i dubbel mutant, men motility i mjuk agar gjorde inte34. Så vi satte in steg 1 av protokollet för att isolera pseudo-revertant flares i dubbelmutanten (Figur 1C). Majoriteten av mutationerna mappas av WGS (HiSeq 4000 plattform, PE 2 x 150 setup34) till rssB, som kodar för en respons regulator / adapter protein som normalt leder ClpXP protease att rikta σS för nedbrytning34. En av dessa revertanter, som uppvisade motilitet nära vildtyp (AW405, jämför figur 1A,D),användes för att generera representativa resultat för steg 2 och 3 i protokollavsnittet, med användning av både sin dubbla mutanta förälder (figur 1B) och isogen vild typ stam (figur 1A).

För steg 2 i protokollavsnittet analyserades videoinspelningar för att beräkna rotationer per minut (varje 360° fullständig rotation) och CWBias (bråkdelen av tidsmotorerna roterar i en CW-riktning eller tumlande partiskhet). ΔyhjH visade färre rotationer per minut och en lägre CW-förspänning jämfört med vildtypen, som förväntat (figur 3). Både ΔyhjH ΔycgR dubbelmutation och dess suppressor visade motoriskt beteende som liknar vildtyp, observationer som stöds av en tidigare analys med hjälp av den högre upplösningen "pärla" analys som beskrivs i introduktionen ovan i tidigare arbete34.

För steg 3 i protokollavsnittet användes gränsövergångsanalysen (figur 2) för att jämföra förmågorna hos vildtypen och suppressorisolatet, först för att svärma, och sedan för att röra sig över gränsen och svärma på agar kompletterad med kanamycin. Resultaten visar att båda stammarna nådde gränsen vid en liknande tidpunkt (data som inte visas) vilket indikerar liknande nivåer av svärmning från en identisk vaccinationspunkt. Överkorsningen av svärmen till höger (antibiotisk) kammare var dock marginellt, men genomgående större för den vilda typen än suppressorn vid 20 μg/ml kanamycin (figur 4). Skillnaden mellan de två stammarna var mer uttalad vid 40 μg/mL kanamycin. Tillsammans tyder dessa data på att mutationerna i rssB som återställde motilitet på mjuka agarplattor (figur 1D), negativt påverkar antibiotiska resistensen hos suppressorstammen under svärmning (Figur 4).

Figure 1
Figur 1: Mjuka motilitetsanalyser och uppkomsten av suppressorbloss.
Plattorna innehåller LB stelnad med 0,3 % w/v agar. E. coli stammar inokulerades i mitten av varje platta och inkuberades vid 30 °C för 8 h, med undantag för C, som inkuberades i 16 h. (A) Wild-typ E. coli (AW405). (B) Motilitetsbrist variant av ∆yhjH ∆ycgR (JP1442). C)Som i B, utom längre inkubationstider. Pilar pekar på snabbare rörliga "facklor" som dyker upp vid den expanderande simkolonins perifera ring. (D) En suppressor isolerad från en fackla i C. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Schematiskt för att sätta upp en gränsövergångsplatta.
(A) Häll ~30 ml svärmagar (med önskat antibiotikum) i rätt kammare på en delad petriskål tills den är jämn med plastavdelaren och låt sätta med locket stängt. (B) Fyll den vänstra kammaren med ~30 ml bad eller svärm agar till kontaktpunkten med toppen av plastavdelaren. (C) Använd en steril pipettspets för att försiktigt dra den smälta svärmagarn över gränsen och anslut därmed de två sidorna med en ~1 mm hög agarbro och låt den ställas in med locket stängt. (D) Låt plattan torka ytterligare vid rumstemperatur över natten innan du vaccinerar den vänstra kammaren med önskad stam och inkuberar vid 30 °C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Motoriska egenskaper hos olika stammar mätt med celltjudringstekniken.
Wild-type (AW405), ∆yhjH (VN133), ∆ycgR ∆yhjH (JP1442) och dess suppressor (JP1836) odlades i LB vid 30 °C till mitten av exponentiell fas före tjudring. (A) Rotationer per minut (slutförda 360° varv) och (B)CW-förspänning (bråkdel av tidsmotorerna roterar i CW-riktning). Standardavvikelse för medelvärdet (±). 20 tjudrade celler observerades i 60 sekunder i varje stam. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Analyser över gränsövergång.
Mid-exponential fas kulturer av vilda typ E. coli (AW405) och suppressor mutant (JP1836) var inokuleras vid det angivna läget (*) i det vänstra utrymmet på den delade plattan som innehåller svärm media, och inkuberade vid 30 °C. De nådde gränsen vid jämförbara tidpunkter. Plattorna inkuberades i ytterligare 6 h, under vilken svärmen korsade över till rätt kammare, där mediet kompletterades med kanamycin (Kan; siffror indikerar μg/ mL). Plattor är representativa för tre biologiska replikat som var och en utförs i tre exemplar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Kompletterande figur 1: Förberedelse av en kammarbild för celltjudring. a)Lägg ner två bitar dubbelsidig tejp före(B) med ettrakblad för att trimma bort överskottet. (C) Skala bort det övre skiktet för att exponera limmetinnan ( D) anbringa ett täckskydd och tryck försiktigt på det på plats (indikerat av [ ), så att all luft trycks ut ur gränssnittet mellan täckglaset och tejpen nedan. E)Lastprov (visas här med DNA-belastningsfärg [30% v/v glycerol, 0,25% w/v bromophenol blå och 0,25% w/v xylencyanol] läggs till för att underlätta visualisering) i toppen av den skapade kanalen (pil) medan (F) mete på ren, vävnad uppgift torka för att hjälpa till att dra lösningen genom kammaren som vävnaden absorberar vätskan (pilen) i kanalen och drar den igenom. Klicka här för att ladda ner den här siffran.

Video 1: Rotation av tjudrade E. coli-celler. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Video 2: En aktiv E. coli-svärm filmad under 60x förstoring, vilket visar dess karakteristiska virvlande rörelse bakom kanten av den rörliga fronten. Klicka här för att ladda ner den här videon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Isolering och karakterisering av suppressormutationer har framgångsrikt bidragit till att identifiera viktiga komponenter i kemotaxissystemet35,36,37, liksom själva motormaskineriet38,39,40. När du använder protokoll 1 är det viktigt att inkludera flera oberoende replikat för att säkerställa isoleringen av ett stort spektrum av möjliga mutationer som kan kompensera för förlusten av motilitet. Att öka antalet bakterier genom att strimma kulturen i en linje snarare än en plats kan förbättra oddsen för att generera suppressorer41. Isolering av samma mutation (som bestäms av DNA-sekvensering) flera gånger ökar förtroendet för dess äkthet. WGS kommer alltid att avslöja förekomsten av andra mutationer i genomet. Det är därför viktigt att verifiera resultaten genom att om möjligt omvandla den identifierade mutationen tillbaka till den ursprungliga motilitet-bristfälliga bakgrunden. Suppressor mutant metoden är rotad i att återställa funktionen genom en sekundär mutation, så en begränsning av denna metod är att om en kritisk strukturell gen raderas, dvs. en som ligger till grund för hela vägen eller strukturen, det kan inte finnas något utrymme för ersättning. Trots att det är en gammal metod visar vårt senastearbete 34 sin fortsatta nytta med att belysa nya vägar som bidrar till bakteriell motilitet.

För kvantifiering av motorutgången förblir celltjudringsmetoden ett universellt tillgängligt verktyg som endast kräver ett mikroskop med ett kamerafäste. Cell tjudring har redan använts i ett varierat antal bakteriearter inklusive Salmonella42, Pseudomonas43, Streptococcus44, och Rhodobacter33. Protokollets framgång är till stor del beroende av korrekt savning och fastsättning av celler. Att skeva för aggressivt eller utelämna pausen mellan saxar (2.1.5) tenderar att främja inkonsekvent eller ofullständig saxning av filament, vilket resulterar i icke-motila celler eller celler som är fastspräpade på en skev axel. Den bestående relevansen av detta protokoll kvarstår, trots antagandet av den högre upplösningen pärlanalys av många forskargrupper (inklusive vår). Den primära begränsningen av pärlanalysen kommer från behovet av att pärlan följer glödtråden hos bakterierna av intresse. Denna teknik har i hög grad gynnats av studier i E. coli som identifierade en "klibbig" flagellin allel, vilket underlättar vidhäftning45. Den klibbiga varianten är också överlägsen i cell-tjudrande analysen. En sådan variant är ännu inte tillgänglig för de flesta flagellerade bakterier. Situationen kompliceras ytterligare med vissa organismer som har flera flagellinproteiner46, och när det gäller Vibrio sp., som också har en membranös mantja47. Cell-tjudring kan också utföras med hjälp av en artspecifik anti-flagellin antikropp eller en antikropp till en konstruerad epitop tagg.

Medan bakterier kan simma omedelbart vid introduktionen till ett flytande medium, gäller detta inte för svärmning, där celler först måste primemas i ett svärmande tillstånd. Ytkontakt utlöser en fysiologisk förändring som krävs för att celler ska initierasvärmning 48,49,50,51, vilket resulterar i en fördröjningsfas och en uppbyggnad av hög celltäthet. Fysiologiska förändringar inkluderar ombyggnad av kemotaxissystemet i E. coli16, och anpassningar som cellförlängning och/eller hyperflagellation för andra bakterier13,14,21. Med tanke på de fysiologiska förändringar som krävs för att initiera svärmning, slår vi en varning om studier som har försökt efterlikna utvalda aspekter av svärmning - såsom hög densitet eller ökad celllängd - helt enkelt genom att koncentrera planktoniska cellkulturer för att öka densiteten och / eller inducera cellförlängning genom användning av antibiotika som hämmar celldelning52,53. Om man använder cellförlängning som markör varnar vi också för att jämfört med planktoniska celler finns det bara en marginell ökning av den genomsnittliga längden på svärmceller i Salmonella eller E. coli54. Svärmanalyser är svårare att fastställa än simanalyser. Variabler inkluderar den kommersiella källan till agar som används för att stelna media (den speciella Eiken agar är viktig för svärmning i E. coli, medan den mer standard Difco agar stöder svärmning för alla andra bakterier), användning av rika kontra minimala medier(E. coli och Salmonella kräver glukostillskott) och mest kritiskt omgivande fuktighet2,13,14,21. Av dessa kan det vara mest frustrerande att upprätthålla optimal fuktighet. [En utmärkt, metodisk optimering för svärmning i en organism av val (Pseudomonas aeruginosa) har visats av Morales-Soto och medarbetare55.] Svärmmedier måste vara tillräckligt fuktiga för att främja svärmning men inte så fuktiga att passiv spridning/glidning, som lätt kan misstas för aktivsvärmning 56. Det är därför viktigt att svärmar kontrolleras under ett mikroskop för att bekräfta de distinkta rörelsemönstren i samband med denna kollektiva rörlighet (Video 2). Temperatur är också en viktig faktor för att optimera den svärmande analysen. Högre temperaturer, till exempel 37 °C, torkar ut plattorna tidigare än vid 30 °C. Att använda en inkubator med fuktkontroll (~ 70-80%) kan hjälpa till att mildra dessa problem, inklusive säsongsförändringar som kan påverka inre byggnadstemperaturer och fuktighet. När protokoll 3 väl har upprättats ger det ett kraftfullt sätt att undersöka en av de mest intressanta aspekterna av svärmande bakterier, förhöjd resistens mot antibiotika17. Alla protokoll som beskrivs här kan tillämpas på nya organismer för att identifiera vägar som specificerar och kontrollerar flagella medierad motilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grant GM118085 och delvis av Robert Welch Foundation (grant F-1811 to R.M.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Bacto Dehydrated Agar Fisher Scientific DF0140-15-4
EDTA Disodium Salt, Dihydrate Fisher Scientific 02-002-786
Eiken agar Eiken Chemical Co. Japan E-MJ00 Essential for E. coli swarming
Glucose D (+) Fisher Scientific 410955000
LB (Lennox) Broth Fisher Scientific BP1427-500
Poly-L-lysine Solution (0.1%) Sigma-Aldrich P8920
Potassium chloride (KCl) Fisher Scientific 18-605-496
Potassium Phosphate monobasic (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
Potassium Phosphate dibasic (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
Sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S271-500
Materials and Equipment
CellSense microscope imaging software (V. 1.6) Olympus Or equivalent software for microscope used
Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape Fisher 50-285-28
Frosted microscope slides 3x1x1mm Fisher 12-550-343
Olympus BX53 microscope Olympus BX53 Any upright or inverted phase microscope can be used
Petri dishes (100 mm diameter) Fisher Scientific FB0875712 For soft-agar assays
Polyethylene Nebulizer Capillary Tubing (0.58mm x 99mm 3.0m) Perkin Elmer 9908265
Round Petri Dish with 2 Compartments VWR 89200-944 For border-crossing assays
Safety Hypodermic Needles (23G) Fisher Scientific 14-826A
Sterile Syringe - 1 mL Fisher scientific 14-955-450
Task/Tissue wipes Fisher scientific 06-666 Or equivalent single use tissue wipes
VWR micro cover-glass 18x18mm VWR 48366205
XM10 camera Olympus XM10 Or equivalent microscope camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jarrell, K. F., McBride, M. J. The surprisingly diverse ways that prokaryotes move. Nature Reviews in Microbiology. 6 (6), 466-476 (2008).
  2. Harshey, R. M. Bacterial motility on a surface: many ways to a common goal. Annual Reviews Microbiology. 57, 249-273 (2003).
  3. Duan, Q., Zhou, M., Zhu, L., Zhu, G. Flagella and bacterial pathogenicity. Journal of Basic Microbiology. 53 (1), 1-8 (2013).
  4. Nakamura, S., Minamino, T. Flagella-Driven Motility of Bacteria. Biomolecules. 9 (7), (2019).
  5. Haiko, J., Westerlund-Wikstrom, B. The role of the bacterial flagellum in adhesion and virulence. Biology (Basel). 2 (4), 1242-1267 (2013).
  6. Berg, H. C. E. coli in Motion. 1 edn. , Springer-Verlag. New York. (2004).
  7. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annual Review of Biochemistry. 72, 19-54 (2003).
  8. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  9. Chen, X., Berg, H. C. Torque-speed relationship of the flagellar rotary motor of Escherichia coli. Biophysics Journal. 78 (2), 1036-1041 (2000).
  10. Turner, L., Ryu, W. S., Berg, H. C. Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. Journal of Bacteriology. 182 (10), 2793-2801 (2000).
  11. Brown, M. T., Delalez, N. J., Armitage, J. P. Protein dynamics and mechanisms controlling the rotational behaviour of the bacterial flagellar motor. Current Opinion in Microbiology. 14 (6), 734-740 (2011).
  12. Parkinson, J. S., Hazelbauer, G. L., Falke, J. J. Signaling and sensory adaptation in Escherichia coli chemoreceptors: 2015 update. Trends in Microbiology. 23 (5), 257-266 (2015).
  13. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 634-644 (2010).
  14. Harshey, R. M., Partridge, J. D. Shelter in a Swarm. Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3683-3694 (2015).
  15. Ariel, G., et al. Swarming bacteria migrate by Levy Walk. Nature Communications. 6, 8396 (2015).
  16. Partridge, J. D., Nhu, N. T. Q., Dufour, Y. S., Harshey, R. M. Escherichia coli Remodels the Chemotaxis Pathway for Swarming. mBio. 10 (2), (2019).
  17. Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (8), 3776-3781 (2010).
  18. Mobley, H. L., Belas, R. Swarming and pathogenicity of Proteus mirabilis in the urinary tract. Trends in Microbiology. 3 (7), 280-284 (1995).
  19. Burall, L. S., et al. Proteus mirabilis genes that contribute to pathogenesis of urinary tract infection: identification of 25 signature-tagged mutants attenuated at least 100-fold. Infections and Immunity. 72 (5), 2922-2938 (2004).
  20. Mazzantini, D., et al. FlhF Is Required for Swarming Motility and Full Pathogenicity of Bacillus cereus. Frontiers in Microbiology. 7, 1644 (2016).
  21. Partridge, J. D., Harshey, R. M. Swarming: flexible roaming plans. Journal of Bacteriology. 195 (5), 909-918 (2013).
  22. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  23. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. Journal of Molecular Biology. 390 (3), 394-400 (2009).
  24. Terasawa, S., et al. Coordinated reversal of flagellar motors on a single Escherichia coli cell. Biophysics Journal. 100 (9), 2193-2200 (2011).
  25. Nord, A. L., Sowa, Y., Steel, B. C., Lo, C. J., Berry, R. M. Speed of the bacterial flagellar motor near zero load depends on the number of stator units. Proceedings of the National Academy of Science. 114 (44), 11603-11608 (2017).
  26. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation kinetics in bacterial chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  27. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  28. Wolfe, A. J., Conley, M. P., Kramer, T. J., Berg, H. C. Reconstitution of signaling in bacterial chemotaxis. Journal of Bacteriology. 169 (5), 1878-1885 (1987).
  29. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  30. Parkinson, J. S. A "bucket of light" for viewing bacterial colonies in soft agar. Methods Enzymol. 423, 432-435 (2007).
  31. Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153 (3737), 708-716 (1966).
  32. Wolfe, A. J., Berg, H. C. Migration of bacteria in semisolid agar. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 86 (18), 6973-6977 (1989).
  33. Kojadinovic, M., Sirinelli, A., Wadhams, G. H., Armitage, J. P. New motion analysis system for characterization of the chemosensory response kinetics of Rhodobacter sphaeroides under different growth conditions. Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4082-4088 (2011).
  34. Nieto, V., et al. Under Elevated c-di-GMP in Escherichia coli, YcgR Alters Flagellar Motor Bias and Speed Sequentially, with Additional Negative Control of the Flagellar Regulon via the Adaptor Protein RssB. Journal of Bacteriology. 202 (1), (2019).
  35. Parkinson, J. S., Parker, S. R., Talbert, P. B., Houts, S. E. Interactions between chemotaxis genes and flagellar genes in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 155 (1), 265-274 (1983).
  36. Roman, S. J., Meyers, M., Volz, K., Matsumura, P. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. Journal of Bacteriology. 174 (19), 6247-6255 (1992).
  37. Sanna, M. G., Simon, M. I. Isolation and in vitro characterization of CheZ suppressors for the Escherichia coli chemotactic response regulator mutant CheYN23D. Journal of Biological Chemistry. 271 (13), 7357-7361 (1996).
  38. Sockett, H., Yamaguchi, S., Kihara, M., Irikura, V. M., Macnab, R. M. Molecular analysis of the flagellar switch protein FliM of Salmonella typhimurium. Journal of Bacteriology. 174 (3), 793-806 (1992).
  39. Irikura, V. M., Kihara, M., Yamaguchi, S., Sockett, H., Macnab, R. M. Salmonella typhimurium fliG and fliN mutations causing defects in assembly, rotation, and switching of the flagellar motor. Journal of Bacteriology. 175 (3), 802-810 (1993).
  40. Ishida, T., et al. Sodium-powered stators of the bacterial flagellar motor can generate torque in the presence of phenamil with mutations near the peptidoglycan-binding region. Molecular Microbiology. 111 (6), 1689-1699 (2019).
  41. Barker, C. S., Meshcheryakova, I. V., Kostyukova, A. S., Samatey, F. A. FliO regulation of FliP in the formation of the Salmonella enterica flagellum. PLoS Genetics. 6 (9), 1001143 (2010).
  42. Paul, K., Nieto, V., Carlquist, W. C., Blair, D. F., Harshey, R. M. The c-di-GMP binding protein YcgR controls flagellar motor direction and speed to affect chemotaxis by a "backstop brake" mechanism. Molecular Cell. 38 (1), 128-139 (2010).
  43. Qian, C., Wong, C. C., Swarup, S., Chiam, K. H. Bacterial tethering analysis reveals a "run-reverse-turn" mechanism for Pseudomonas species motility. Applied and Environmental Microbiology. 79 (15), 4734-4743 (2013).
  44. Manson, M. D., Tedesco, P. M., Berg, H. C. Energetics of flagellar rotation in bacteria. Journal of Molecular Biology. 138 (3), 541-561 (1980).
  45. Kuwajima, G. Construction of a minimum-size functional flagellin of Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 170 (7), 3305-3309 (1988).
  46. Kuhn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
  47. Hranitzky, K. W., Mulholland, A., Larson, A. D., Eubanks, E. R., Hart, L. T. Characterization of a flagellar sheath protein of Vibrio cholerae. Infections and Immun. 27 (2), 597-603 (1980).
  48. Wang, Q., Frye, J. G., McClelland, M., Harshey, R. M. Gene expression patterns during swarming in Salmonella typhimurium: genes specific to surface growth and putative new motility and pathogenicity genes. Molecular Microbiology. 52 (1), 169-187 (2004).
  49. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Molecular Microbiology. 79 (1), 240-263 (2011).
  50. McCarter, L., Silverman, M. Surface-induced swarmer cell differentiation of Vibrio parahaemolyticus. Molecular Microbiology. 4 (7), 1057-1062 (1990).
  51. Pearson, M. M., Rasko, D. A., Smith, S. N., Mobley, H. L. Transcriptome of swarming Proteus mirabilis. Infections and Immunity. 78 (6), 2834-2845 (2010).
  52. Swiecicki, J. M., Sliusarenko, O., Weibel, D. B. From swimming to swarming: Escherichia coli cell motility in two-dimensions. Integrative Biology (Cambridge). 5 (12), 1490-1494 (2013).
  53. Colin, R., Drescher, K., Sourjik, V. Chemotactic behaviour of Escherichia coli at high cell density. Nature Communication. 10 (1), 5329 (2019).
  54. Partridge, J. D., Harshey, R. M. More than motility: Salmonella flagella contribute to overriding friction and facilitating colony hydration during swarming. Journal Bacteriology. 195 (5), 919-929 (2013).
  55. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. Journal Visualized Experiment. (98), e52338 (2015).
  56. Chawla, R., Ford, K. M., Lele, P. P. Torque, but not FliL, regulates mechanosensitive flagellar motor-function. Science Reports. 7 (1), 5565 (2017).

Tags

Biologi Nummer 159 bakterier kemotaxis Escherichia coli,flagella roterande motor motilitet simning svärmning ytavkänning ytmotilitet
Undersöka Flagella-driven motilitet i <em>Escherichia coli genom</em> att tillämpa tre etablerade tekniker i en serie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Partridge, J. D., Harshey, R. M.… More

Partridge, J. D., Harshey, R. M. Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series. J. Vis. Exp. (159), e61364, doi:10.3791/61364 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter