Summary
此方法演示了利用北方杂交技术从总RNA提取物中检测miRNA。
Abstract
MicroRNA （miRNA） 是一类内源性表达的非编码，±21 nt 小型RNA参与植物和动物基因表达的调控。大多数miRNA充当针对关键基因的基因表达的负开关。在植物中，原发性miRNA（原始miRNA）转录本由RNA聚合酶II生成，它们形成不同长度的稳定茎环结构，称为前miRNA。内核糖酶，像迪瑟一样1，将预米RNA处理成miRNA-miRNA*双工。从miRNA-miRNA* 双面的一股被选择并加载到Argonaute 1蛋白或其同源体上，以调解目标mRNA的裂解。虽然miRNA是关键信号分子，但它们的检测通常采用不太理想的基于PCR的方法，而不是敏感的北方印迹分析。我们描述了一种简单、可靠和极其敏感的北方方法，它非常适合从任何植物组织中对具有极高灵敏度的 miRNA 水平进行定量。此外，此方法可用于确认米RNA及其前体的尺寸、稳定性和丰度。
Introduction
最近发现的小型调控RNA，微RNA，已经领导了研究，了解它们及其在植物和动物中的作用1。miRNA的长前体由HYL1和特定的骰子样蛋白质2，3加工成21至24nt成熟的3miRNA。22 nt miRNA 可以通过生成二级 siRNA4启动级联沉默。研究表明，miRNA和二级siRNA在发育、细胞命运和压力反应5，6,中的作用。
北方杂交是一种常规用于检测特定RNA分子的实验方法。此方法自定义其在检测大约 19 -24 nt 长的小 RNA 从总 RNA7 的池中的使用。在此演示中，我们演示了该技术用于检测和定量 miRNA。该方法使用放射性同位素对探头进行标签标记;因此，可以提高灵敏度检测样品中的miRNA水平。与基于 PCR 的方法不同，此方法可确保表达式的量化以及 miRNA 的大小确定。在该协议中，我们展示改善miRNA检测的关键步骤。我们修改了印迹和杂交步骤，以获得 miRNA 的高分辨率信号检测。此技术还可用于检测其他内生小RNA，如 siRNA、tasi-辅助RNA 和 snoRNA。
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Protocol
1. 制备15%变性聚丙烯酰胺凝胶
- 称重并加入4.8克尿素，加入3.75 mL的40%丙烯酰胺：双丙烯酰胺（19：1）溶液和1 mL的10x TBE pH 8.2放入无菌50 mL管中。
- 使用 60°C 的水浴将尿素溶解成清晰的溶液。
- 使用新鲜自功能开的无菌水将体积放大至 10 mL，将凝胶混合物冷却至室温。
- 准备新鲜的 10%（w/v）铵硫酸盐溶液。
2. 玻璃板和电泳装置的组装
- 用洗涤剂清洗凝胶电泳和电印所需的所有设备。用软海绵轻轻擦洗它们，去除残留的缓冲液和丙烯酰胺，用水冲洗，让它们干燥。
- 将两个玻璃板组装在一起，并牢固地放在海绵上。使用 1 毫米厚的板进行此设置。确保板处于同一水平，以避免泄漏。
- 在 10 mL 凝胶混合物中，加入 8 μL 的 TEMED 和 80 μL 新鲜制备的 10%（w/v）硫酸铵溶液。
- 毫不拖延地，轻轻混合并倒入组装的玻璃板之间。小心地放置梳子。在此步骤中避免产生气泡。
- 让凝胶聚合约 45 分钟。
- 在将聚合凝胶置于凝胶运行装置内之前，用无菌水清洗聚合凝胶。
- 组装运行盒内的板，轻轻拆下梳子。
- 将新鲜准备好的无菌 1x TBE、pH 8.2 倒入罐中。
- 通过移液液洗孔以去除盐晶体。此步骤可帮助 RNA 样品均匀地穿过凝胶。
- 在 80 V 下执行预运行 30 分钟。
3. 装载染料和样品的准备
- 对于10 mL的凝胶加载染料，重量5毫克的布罗莫酚蓝色，5毫克的二甲醇，加入10 mL的去化甲酰胺仔细混合。
- 将总RNA10μg放入无菌1.5 mL管中，并使用速度真空将样品干燥。不要过度干燥样品。
- 将RNA样品重新在8μL的负荷中。
- 在 98 °C 加热样品 2 分钟，在 RT 冷却 1 分钟，涡流和旋转样品 3 次。此步骤对于适当的再暂停至关重要，这反过来又有助于对样品进行相等的加载。
4. 凝胶电泳
- 在样品装载之前停止预运行并清洗油井。
- 在 98 °C 下加热样品 1 分钟，并使用毛细管尖端将样品加热到井中。将尖端插入井底，使样品在井中占据一层薄层。
- 完成所有样品的加载。包括加载RNA十年标记。
- 在 80 V 下运行凝胶，直到布罗莫酚蓝色染料几乎完全运行。溴酚蓝色运行在15%变性丙烯酰胺凝胶10个基点。
5. 电印准备
- 将 N+尼龙膜切割到玻璃板的尺寸，用 HB 铅笔将膜的右上角标记。
- 轻轻地将膜放在无菌水的表面，朝向有标记的一侧，朝向水面。预浸泡膜15分钟。
- 切割4件印迹纸I到纤维垫的尺寸。
- 准备凝胶三明治，将盒式磁带的灰色面放在干净的托盘中。
- 预湿纤维垫，并放在盒式磁带上。清除气泡。
- 在 1x TBE 中预湿一张印迹纸，并放在纤维垫上。通过将塑料移液器滚动到纸张上，去除气泡。再放一块预湿印迹纸并清除气泡。
- 小心地从运行盒中取下凝胶，并将其放在三明治设置上，使第一个加载的 RNA 样品朝向右侧。
- 轻轻地将预浸膜浸入 1x TBE 中，并放在凝胶上，朝向贴有标签的一侧朝下。推出以清除气泡。
- 浸一张印迹纸，放在膜上，去除气泡。再浸一张印迹纸，放在三明治上，去除气泡。
- 将预湿纤维垫放在设置上并牢固地关闭盒式磁带，完成三明治。
- 将转盘盒放在模块中，并填充 1x TBE，pH 8.2 至印迹标记。
- 在 10 V 下传输，在 4 °C 下过夜。
- 转移后，将湿膜放在纸片上，并立即用 254-nm 紫外线照射将 RNA 与膜交叉连接（120，000 μjoules/cm2）。交连印迹可能储存在4°C，用于进一步杂交。
6. 准备放射性标记探头
- 设计一个完全与要检测的小RNA互补的探针。
- 使用32ATP（ƳP从 BRIT 获得）在其 5' 端将组件组合在一起，根据表 1 中提供的配方，将探头标记为 32ATP（从 BRIT 获取）。
- 在37°C下孵育上述反应混合物30分钟。
- 根据制造商的协议，ƳP使用 Sephadex G-25 列将未标记的32ATP 从探头中分离。
7. 污点的混合
- 将交叉链接的印迹，RNA 侧朝顶部在杂交瓶内。
- 大力混合超敏感杂交缓冲液，加入10 mL，并在保持在35°C的杂交炉内孵化印迹，旋转。
- 执行预杂交 20 分钟。
- 将瓶子从烤箱中取出，并轻轻地将贴标探针添加到杂交缓冲液中。
- 在35°C下混合印迹，旋转12小时。
- 杂交后，小心地将杂交溶液转移到15 mL管中。此溶液可储存在 4 °C，直到重新使用。
- 通过添加 2x SSC 缓冲液加 0.5% SDS，快速清洗印迹 2 分钟，以消除多余的杂交解决方案。丢弃解决方案。
- 用 2x SSC 缓冲液加上 0.5% SDS 孵育 35 °C 的印迹，旋转 30 分钟。
- 再次用 0.5 倍 SSC 缓冲液加上 35°C 的 0.5% SDS 洗涤污点，旋转 30 分钟。
- 将印迹放在杂交盖内，拆下多余的缓冲液并密封。
- 在盒式磁带内隔夜将其暴露在无辐射荧光成像器屏幕上。
- 使用生物分子成像器检测杂交信号，使用合适的软件分析结果。
- 在 80 °C 下孵育污点，旋转 30 分钟，0.5 X SSC 缓冲液加 0.1% SDS 和 0.1 X SSC 缓冲器加 0.1% SDS 30 分钟。
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Representative Results
在本次演示中，我们检测并量化了miR397在稻谷白粉不同组织中的表现（图1）。 varmiR397 是一个 22 nt miRNA 和保存的 miRNA。可以在所有测试的样品中检测到miR397的表达。根据下一代测序数据，样本 1（幼苗组织）具有 miR397，每百万（rpm）读取 5 次。我们舒适地检测到其信号，表明该方法非常敏感，可用于检测甚至非常低的丰富的miRNA。在此实验中，我们使用 miR168 和U6 作为加载控件。
在此印迹（图1）中，信号强度使用 ImageJ 进行量化。miR397的表达在植物叶护套中最高。
图1：在水稻样品的不同组织中检测和定量miR397表达。请单击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲和解决方案 | 食谱 | 评论 |
| 10 X TBE | 0.89M 三轮车缓冲器 | 使用醋酸应设置为 8.2 |
| 0.89M 博酸 | ||
| 30mM EDTA | ||
| 凝胶混合 | 15% 丙烯酰胺-双丙烯酰胺溶胶，19：1 | 凝胶混合物不应含有尿素晶体 |
| 8M 尿素 | ||
| 1x TBE | ||
| 凝胶加载染料 | 0.05 %（w/v） 布罗莫酚蓝色 | 处理去化甲酰胺时应小心 |
| 0.05 %（带/v） 二甲苯二醇 | ||
| 100 % 去化 - 甲酰胺 | ||
| 探头标签 | PNK 缓冲器 （10X，2 μL） | 这种混合物含有放射性分子，这一步必须由放射性实验室内训练有素的人员执行。 |
| PNK酶 （1 μL） | ||
| 寡头 （100 μM， 0.1 μL） | ||
| ƳP32 ATP （4 μL） | ||
| 洗涤缓冲液 - I | 2X SSC | |
| 0.5% （带/v） SDS | ||
| 洗涤缓冲液 - II | 0.5 倍 SSC | |
| 0.5% （带/v） SDS | ||
| 剥离缓冲区 - I | 0.5 倍 SSC | |
| 0.1% （带/v） SDS | ||
| 剥离缓冲器 - II | 0.1X SSC | |
| 0.1% （带/v） SDS |
表1：食谱表。
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Discussion
该方法可广泛用于检测和定量小RNA，包括不太丰富的miRNA。该协议主要描述了在加载缓冲液中变性总RNA的步骤，通过凝胶电泳进行大小分离，将RNA转移到膜上，将RNA交叉链接到膜，并使用所需的放射性标记寡聚探针进行杂交。
任何印迹实验的关键步骤是使用优质RNA进行样品制备。在装载凝胶之前，必须确保样品自由流动，不要粘在装料尖端。装载样品时必须小心，尖端应插入井底的上方，使样品在井中占据一层薄层。杂交炉的温度必须保持在35°C，以检测非常不丰富的miRNA。对于印迹的重复杂交，将膜存放在 4°C 下，将其保持 2 倍 SSC 的潮湿。
此方法可用于检测富含多糖和多酚8的组织中的小RNA。在该协议中，与其他较旧的方法相比，使用真空干燥来浓缩RNA样品，可提供更好的稳定性和更少的样品损失。该方法中的其他修改包括，在电传输过程中浸入1x TBE之前将膜在水中扩散。这提高了RNA传输的效率，提供了更好的污点分辨率。
该方法的一个主要局限性是放射性同位素的使用，它需要训练有素的人员和放射性同位素实验室来进行杂交实验。此方法在这里提供有关RNA印迹分析中涉及的所有步骤的详细信息，用于检测miRNA。该协议还确保小RNA的大小，除了其信号检测10。该技术为分子生物学家提供了一个强大的工具，用于估计各种小型RNA的丰度，如miRNA、二级siRNA和snoRNA。
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Disclosures
未声明利益冲突。
Acknowledgments
作者承认宿主研究所和英国为放射性同位素提供的辐射实验室。PVS实验室由国家生物科学中心、塔塔基础研究所和赠款支持（BT/PR12394/AGIII/103/891/2014;BT/IN/瑞士/47/JGK/2018-19;BT/PR25767/GET/119/151/2017） 来自印度政府生物技术部。MP 承认印度政府 DBT 研究助理。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 40% Acrylamide-bisacrylamide solution | Sigma | A9926 | |
| Ammonium persulphate (APS) | BioRad | 1610700 | |
| Blotting paper | whatmann blotting paper I | 1001-125 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B5525-5G | |
| Capillary loading tips | BioRad | 2239915 | |
| Deionized formamide | Ambion | AM9342 | |
| Heating block | Eppendorff | 5350 | |
| Hybond N+nylon membrane | GE | RPN203B | |
| Hybridization bottle | Sigma | Z374792-1EA | |
| Hybridization Oven | Thermo Scientific | 1211V79 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma | T7024-25ml | |
| PhosphorImager | GE- Typhoon scanner | 29187194 | |
| PhosphorImager screen and cassette | GE healthcare | GE28-9564-75 | |
| Pipettes | Gilson, models: P20 and P10 | FA10002M, FA10003M | |
| Plastic pipette | Falcon | 357550 | |
| Polyacrylamide gel apparatus | BioRad | 1658003EDU | |
| Sephadex G-25 column | GE healthcare | 27532501 | |
| Speed Vac Concentrator | Thermo Scientific | 20-548-130 | |
| Spinwin | Tarsons | 1010 | |
| T4 Polynucleotide Kinase (PNK) | NEB | M0201S | |
| Transblot apparatus | BioRad | 1703946 | |
| ULTRAHyb hybridization buffer | Ambion | AM8670 | |
| Urea | Fischer Scientific | 15985 | |
| UV-crosslinker | UVP | CL-1000L | |
| Vortex | Tarsons | 3020 | |
| Water bath | NEOLAB | D-8810 | |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126-10G |
References
- Baulcombe, D.
- Anushree, N., Shivaprasad, P. V.
- Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. , (2020).
- Chen, H. M., et al. 22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).
- Shivaprasad, P. V., et al. A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs. Plant Cell. 24, 859-874 (2012).
- Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs. The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).
- Akbergenov, R., et al. Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species. Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).
- Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes. Journal of Experimental Botany. , (2019).
- Li, C., Zamore, P. D. Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization. Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).
- Swetha, C., et al. Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing. The Plant Cell. , (2018).
