Summary
在DNA损伤之后，人类细胞激活必要的修复途径，以恢复其基因组的完整性。在这里，我们描述了间接免疫荧光的方法，作为检测DNA修复蛋白，分析其空间和时间招募，并帮助查询DNA损伤点蛋白质-蛋白质相互作用的方法。
Abstract
哺乳动物细胞经常暴露在化学物质、辐射和自然产生的代谢产物中，这些产物会造成特定类型的DNA侮辱。基因毒性剂可以破坏DNA骨干，破坏它，或修改单个碱基的化学性质。在DNA侮辱之后，DNA损伤反应（DDR）途径被激活，参与修复的蛋白质被招募。在感知损坏类型和激活适当的维修响应时，涉及大量因素。未能正确激活和招募 DDR 因子可能导致基因组不稳定，这是包括癌症在内的许多人类疾病的基础。DDR蛋白的研究可以提供对基因毒性药物反应和细胞耐药性机制的见解。
体内蛋白质可视化有两 种主要方法：直接观察，通过用荧光蛋白标记感兴趣的蛋白质，然后通过活体成像或固定样品上的间接免疫荧光跟踪。虽然荧光标记蛋白质的可视化允许随着时间的推移进行精确监测，但 N-或 C-术语中的直接标记可能会干扰蛋白质的定位或功能。观察蛋白质的未修改，内源版本是首选。当DNA修复蛋白被招募到DNA侮辱中时，它们的浓度会局部增加，它们形成组，或"foci"，这些组可以通过使用特异性抗体的间接免疫荧光来可视化。
虽然蛋白质叶酸的检测不能提供直接相互作用的明确证据，但细胞中蛋白质的共同定位表明它们重新组合到损伤发生地，并可以告知复杂形成所需的事件序列。仔细分析表达野生类型或蛋白质突变版本的细胞的 foci 空间重叠，可以为对 DNA 修复功能重要的功能域提供宝贵的线索。最后，蛋白质的共同定位表明可能的直接相互作用，可以通过细胞中的共免疫沉淀或使用纯化蛋白质直接下拉来验证。
Introduction
人类细胞不断暴露在各种来源的DNA破坏剂中。外源主要包括接触辐射、化学品（包括化疗剂和某些抗生素）和病毒，而主要的内源包括DNA复制和氧化应激方面的错误。基因毒性暴露的直接影响范围从改良的碱基到潜在的致命DNA双链断裂（DSB），这取决于压力和暴露剂量。最终，未修复或修复不当的DNA损伤可导致突变的积累、基因组重组、基因组不稳定，并最终导致致癌1。哺乳动物细胞已经进化出复杂的途径来识别特定类型的DNA损伤2,2，3，并及时修复它们，与细胞周期进展同步。
电离辐射（IR）损害DNA双螺旋，并造成双链断裂（DSB），这是最有害的DNA损伤形式之一。MRN （MRE11， RAD50， NBS1） 复合功能作为 DNA 末端的传感器，并激活蛋白激酶 ataxia telangiectasia 突变 （ATM）4，5。在DNA端对ATM的初始激活后，ATM在断点触发一系列DDR事件，启动一个关键事件，即组蛋白变种H2AX6的磷酸化。在残留物S139上的H2AX磷酸化激活它到+H2AX，跨越区域，高达围绕DNA病变6，7，8，97,8的巨型碱。6这一事件增加了DNA的可访问性，导致其他DNA修复蛋白的招募和积累7。由于 +H2AX 是丰富和具体诱导周围的 DSB，它可以很容易地可视化使用特定的抗体，并通常用作 DSB 在 DNA 修复领域的代理标记。一旦中断被发出信号，细胞激活其DNA修复途径并处理DNA损伤。蛋白质MDC1（DNA损伤检查点蛋白1的中介）直接结合+H2AX10，与ATM11和NBS1 12，13,相互作用。它有助于提高 MRN 复合物在 DSB 的浓度，并启动正 ATM 反馈回路。•一旦修复断裂，快速清除H2AX，从而允许监控DSB间隙。其次是显微镜，随着时间的推移，μH2AX 的减少提供了残余断裂和 DNA 修复效率的间接测量。
真核细胞可以通过多种途径修复DSB，两个主要途径是非同源端连接（NHEJ）和同源重组（HR）（图1）。NHEJ基本上连接DNA双链结束不使用扩展同源和在整个细胞周期14，15运行。14,HR在S和G2阶段成为占主导地位，否则被压抑，因为它需要一个姐妹色度作为一个同源模板修复14，16。14,NHEJ和HR之间的路径选择不仅取决于姐妹色度的物理接近性，还取决于DNA端切除17的延伸，它抑制了NHEJ。
同源性依赖的DSB修复启动核解降解的5'链从断裂端产生3'单链DNA（ssDNA）尾部，这个过程被称为5'-3'切除。MRN复合物启动DNA端切除术，并结合BLM/EXO1（布洛姆综合征蛋白/外核酶1）或BLM/DNA2（DNA复制ATP依赖性直升机酸酶,/核酸酶）18、19、20、21、22,19,20进行进一,步切除。21CtIP（CtBP相互作用蛋白）通过与 MRN 复合物23的直接相互作用和 BRCA1（乳腺癌 1 型易感性蛋白）24，25的招募来增强 DNA 末切。复制蛋白A（RPA）迅速结合到暴露的ssDNA，然后被重组酶蛋白RAD51取代，形成核蛋白丝，催化同源搜索和链入侵26，27，28。26,27,28
切除的启动是修复路径选择的关键步骤。一旦切除开始，DNA末端成为由Ku70/Ku80异质剂（NHEJ通路的组成部分）结合的不良基质，细胞被承诺到HR 17，29，30。17,29,30Ku70/Ku80异质剂结合到DSB末端，招募DNA-PKcs和p53结合蛋白,1（53BP1）29，2930。53BP1在G1中起到切除屏障的作用，从而在推广NHEJ31、32,32的同时阻断HR，但在S相中以BRCA1依赖的方式去除，从而允许切除发生33，34,34。因此，53BP1 和 BRCA1 在 DSB 维修中扮演相反的角色，53BP1 是 NHEJ 促进者，而 BRCA1 则通过 HR 进行中断修复。
在实验室中，DSB形成可由电离辐射（IR）引起。虽然本示例利用高剂量的 4 Gy、1 Gy 和 2 Gy 也创建大量的 DSB，适合通过丰富的蛋白质分析叶层形成。需要注意的是，使用的辐射类型和剂量可导致DNA和细胞中不同的病变：虽然IR诱导DSB，它也可能导致单股断裂或碱基修饰（见35，36，,36关于辐照线性能量转移（LET）和DNA损伤类型的参考）。为了确定电离辐射诱导的源（IRIF）形成的动力学及其间隙，表明修复激活的DDR8、9、37、38,9,37,的损伤和反转，在电离辐射后的不同时间点可以监测源层。所有主要DNA损伤蛋白的激活和清除时间已知为39种，许多被调查为关键事件的代理标记。例如，对 ssDNA 具有高亲和力的 pRPA 用作断分切除的代理，MRN 蛋白（MRE11、RAD50、NBS1）和外核酶也可用于评估切除效率。虽然RAD51、BRCA1、BRCA2（乳腺癌2型易感性蛋白）和PALB2（BRCA2的合作伙伴和本地化者）可以监测，以评估人力资源效率，而Ku蛋白或53BP1的存在则用作NHEJ的标记（图1）。
当DNA修复机械的蛋白质相互招募到超级复合物中分离和组装时，DNA蛋白和蛋白质-蛋白质的相互作用可以通过跟踪它们各自的定位并分析蛋白质的共同定位来推断，如细胞40、41、42,41,42中的重叠信号。在细胞系中，通过基因组编辑或对质粒突变体过度表达，在特定DNA修复基因中引入点突变或删除，允许调查特定残留物及其在识别DNA损伤（例如，与+H2AX）或复杂组装（与其他蛋白质或几种蛋白质共同定位）中可能发挥的作用，以及它们对DNA修复的影响。在这里，我们使用间接免疫荧光作为一种均值，通过跟踪 +2AX foci 来研究 DSB 的形成和分辨率。我们还提出了一个示例，由 DSB 修复的主要参与者进行 foci 形成和共同定位分析：p53 结合蛋白 1 （53BP1）32。如前所述，53BP1 被认为是 DNA 修复路径选择的核心。在 53BP1 积累及其与 +2AX 的共定位后，提供了有关细胞周期相、DNA损伤积累和用于修复 DSB 的路径的宝贵信息。间接免疫定位的目的是评估细胞系DNA损伤修复的效率，如本研究中的IR之后，或在接触细胞中的各种应力后，从DNA交联到复制分叉的阻塞（表1提供了DNA损伤剂列表）。
图1：DNA双链断裂（DSB）修复途径。
DSB 修复涉及两个主要途径：同源重组（HR、左）和非同源端连接（NHEJ，右）。断裂后，蛋白质被激活以标记断裂（+2AX），参与最终切除（MRN），涂上被切除的ssDNA（pRPA），促进重组（BRCA1，PALB2，BRCA2，RAD51）或限制切除，促进NHEJ（53BP1）。其他蛋白质参与损伤修复，但列出的蛋白质通常遵循间接免疫荧光。 请单击此处查看此图的较大版本。
| DNA损伤剂 | 行动机制 | 推荐剂量 |
| • 射线/X 射线 | 辐射 形成双链断裂与一些不受控制的细胞效应 |
1-4 Gy |
| 36Ar 离子 | 辐射 双链断裂的形成 |
270千瓦/μm |
| • 粒子 | 辐射 双链断裂的形成 |
116 keV/μm |
| 博莱 霉 素 | DNA合成的抑制剂 | 0.4-2 μg/mL |
| 喜 树 碱 | 托托莫默酶 I 的抑制剂 | 10-200 nM |
| 顺 铂 | 阿尔基拉特剂 （诱导海峡内部交联） |
0.25-2 μM |
| 阿 霉 素 | 中间代理 托托莫默酶II.的抑制剂 |
10-200 nM |
| 埃托波赛德 | 托托莫默酶II.的抑制剂 | 10 μM |
| 羟基尤雷亚 | DNA合成的抑制剂 （由核糖核酸还原酶） |
10-200 μM |
| 甲基甲烷硫化甲酸酯 | 阿尔基拉特剂 | 0.25-2 mM |
| 米托米霉素 C | 阿尔基拉特剂 | 0.25-2 μM |
| 紫外线（UV）光 | 甲状腺素二丁的形成 （产生DNA链失真） |
50-100 mJ/厘米2 |
表1：基因毒性剂.DNA损伤剂的例子，其作用机制和根据建议的工作浓度引起的损伤。
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Protocol
1. 希拉细胞培养
- 在 50°C 下预处理带 1 M HCl 的圆形玻璃盖玻片，使用 16-18 小时。用 ddH2O 冲洗，并储存在 100% Etoh 中。
- 准备细胞培养基：向DMEM培养基添加10%（v/v）FBS。
- 在无菌 12 井板中生长 4.0 x10 4 细胞/井，在加湿培养箱中用 18 mm 圆形玻璃盖玻片和 5%CO2。 将细胞生长到80%的汇合（约24小时）。
2. 放射治疗的细胞治疗
- 为了诱导双链断裂的形成，使细胞暴露在4Gy+-辐照（控制：无辐照，t=0）。在伽玛细胞 -40 中，这对应于 4.54 分钟，即 0.815 Gy/分钟。
- 在37°C和5%CO2 下孵育细胞，在适当时间长度的加湿培养箱中（此处选择的时间点t=1、2、4、16h）。
3. 核提取和细胞固定
- 准备库存解决方案： 0.2 M PIPES （pH 6.8）， 5 M NaCl， 2 M 蔗糖， 1 M MgCl2， 0.1 M EGTA （pH 8.0）.
- 准备核萃取缓冲液（NEB）：溶解10 mM管道（pH 6.8），100 mM NaCl，300 mM蔗糖，3 mM MgCl2，1mM EGTA （pH 8.0）和0.5%（v/v） Triton X-100在ddH2O.混合，直到完全溶解。
- 准备 4% （v/v） 对甲醛 （PFA）： 在 30 mL PBS 中溶解 10 mL 的 16% PFA 水溶液。混合直到完全溶解。
- 在适当的时间点（t=0，1，2，4，16小时），用1 mL的PBS清洗细胞两次。完全取出 PBS。
- 将200μL的NEB添加到每一个井中，用于细胞核提取（细胞质退化，仅保留核）（图2）。在室温下孵育2分钟，完全取出。
注：不要超过2分钟。
图2：核提取。
核提取前（左）和后（右）核提取前细胞的代表性图像。细胞质应消化，但核结构在提取后应保持完好无损（右）。（A） 20倍放大率;比例线 = 20 μm 和 （B） 40 倍放大倍率;比例线 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
- 用 1 mL PBS 清洗细胞。完全取出 PBS。仔细添加 PBS，这一步细胞非常脆弱。
- 将 200 μL 的 4% （v/v） PFA 添加到每个井中，用于细胞固定。在4°C下孵育10分钟。 完全删除 PFA。
- 添加 1 mL 的 PBS。
注：细胞可储存在4°C的PBS中。
4. 免疫荧光染色
- 准备阻塞解决方案：在 PBS 中溶解 5% BSA （w/v），并添加 0.3%（v/v） Triton X-100。混合，直到完全溶解。
- 准备稀释缓冲液：在PBS中溶解1%BSA（w/v），并加入0.3%（v/v）Triton X-100。混合，直到完全溶解。
- 对于阻塞，向每个井添加 200 μL 的阻塞溶液。在室温下孵育2小时，或在4°C下孵育16-18小时。
注：如果使用山羊抗体，加入5%的山羊血清到阻断溶液。 - 稀释稀释缓冲液中的原抗体（1：500;参见 表2 的抗体列表）和涡流，直到混合良好。
注：如果使用山羊抗体，将1%的山羊血清加入稀释缓冲液。 - 在湿度/孵化盒中，粘附一片副膜。加入10μL的原抗体（一滴）。将盖玻片的一条边缘与掉落物对齐，然后慢慢下部到准膜上，使液体扩散到整个区域（如果可能避免气泡）。在室温下孵育2小时。
- 在 PBS 中清洗盖玻片三次 1 分钟。
- 稀释稀释缓冲液中的二次抗体（最终浓度：2 μg/mL）和涡流，直到混合良好。
- 应用10μL的二级抗体，如所述的初级抗体。在室温下孵育2小时。
注：防止光线。
| 抗体 | 公司 | 参考 | 源 |
| 53BP1 | 细胞信号 | 4937 | 兔 |
| 防鼠 IgG H&L （亚历克萨氟 647） | 阿卡姆 | ab150103 | 驴 |
| 抗磷-西酮H2A。X （Ser139），克隆 JBW301 | 米利波尔 | 05-636 | 鼠标 |
| 防兔 IgG H&L （亚历克萨氟尔 488） | 阿卡姆 | ab150081 | 山羊 |
表2：使用的抗体。本研究中使用的抗体列表。
- 在 PBS 中清洗盖玻片三次 1 分钟。
- 用 H 2 O清洗盖玻片 1 分钟。
- 使用 DAPI 对抗 DNA：应用 10 μL 的 300 nM DAPI（如抗体所述），在室温下孵育 30 分钟，然后用甘油安装介质安装到玻璃幻灯片上。或者，在幻灯片上添加一滴 （10 μL） 含有 DAPI 的商业防淡安装介质，然后应用盖玻片。轻轻按压盖玻片，用纸巾去除盖玻片周围的多余的液体。
- 用透明指甲油密封盖玻片，让其干燥20分钟。
- 将幻灯片存放在 4 °C。
5. 图像采集
- 将一滴浸入油放在 60 倍的客观透镜上。使用 DAPI 通过眼片定位核。
- 对于XYZ图像采集，开放采集软件和选择参数：扫描仪类型：加尔瓦诺;扫描仪模式：往返;图像大小： 512×512;PMT 模式：VBF;PMT 平均值：帧（4 次）;PMT 顺序扫描：行。
- 选择染料和探测器：
通道 （CH1）， 染料 （DAPI）， 探测器 （SD1）
通道 （CH2）， 染料 （亚历克萨荧光 488）， 探测器 （HSD3）
通道 （CH3）， 染料 （亚历克萨荧光 647）， 探测器 （HSD4） - 在 "Z" 中选择"打开"。
- 调整实时图像。按" 实时" 窗口中的 "实时" 按钮。
- 在"PMT"工具窗口上调整对焦并设置激光强度（%）、灵敏度（HV）、增益和偏移。
- 调整激光强度（%）：用于亮度和漂白。激光强度越高，信号越强，但试样会光漂白。
- 调整灵敏度 （HV）：噪声级别。高压越高，信号越强，但如果图像过高，图像会非常嘈杂。
注：始终保持电压恒定。 - 调整偏移量：背景级别。
- 对于 Z 堆栈， 请选择"开始/结束"（15 个切片）。
- 在"PMT"工具窗口上调整对焦并设置激光强度（%）、灵敏度（HV）、增益和偏移。
- 开始收购。
- 选择要保存图像的文件夹。按 LSM 开始 按钮开始获取图像。按" 完成系列 "按钮完成图像采集。
6. 数据分析
- 对于图像分析，打开分析软件。
- 按" 批 处理"工具窗口，选择要分析的图像并选择输出文件夹。
- 按" 分析 "工具窗口并选择"投影"（将显示 15 个切片的最大强度投影）。
- 在 "输入/输出"设置下，选择创建的批处理。
- 按 要 处理的图像的"处理过程"。
- 将图像导出为 .tiff 文件。
- 对于核病体定量，打开细胞保护器。
- 打开 +H2AX 和 53BP1 点定量管道（参见 补充信息）。
- 使用表软件绘制数据。
- 对于共同本地化分析，请打开 CellProfiler。
- 打开同化管道（请参阅 补充信息）。将在首选位置创建电子表格文件并保存。但是，图形本身不会自动保存。建议拍摄窗口的快照以记录结果。
- 使用表软件绘制数据。
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Representative Results
第2天，或24小时后种子细胞在盖玻片上，细胞经历了一个分裂，是80%的汇合。DNA修复蛋白中特定的击倒或突变可以增加加倍的时间，或使细胞对基因毒性治疗敏感，种子密度以及治疗剂量应相应调整。为了确定最佳工作条件，随着时间的推移，西方的αH2AX的印迹可以确定DNA损伤反应的时间，并且可以通过菌落形成测定来确定对辐照的敏感性。
未经过辐照处理的细胞（如果有）很少（如果有任何）[6H2AXfoci》（图3A）。然而，在培养条件下，各种压力可以触发培养细胞：酸性培养基中左汇的细胞，FBS中基因毒性内毒素的存在，用于培养的氧气浓度，仅举几例。
图3：无压力的核扩散。
在没有外部应力源的情况下，很少观察到任何 +2AX 源 （A）。在缺乏必需的DNA修复蛋白的情况下，αH2AX积累可以观察到，因为内源造成的断裂没有修复（B）。未修复的断裂的积累可能导致细胞成为凋亡前，其特点是"固体"+2AX核染色（C）。比例线 = 5 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
此外，在耗尽的关键DNA损伤蛋白的细胞中， 如BRCA1 或 BRCA2 突变细胞，由于内源性应力而导致的DNA断裂不会像野生型细胞那样修复并积累。因此，即使在正常生长条件下，也可以在人力资源缺陷细胞中观察到升高的+H2AX（图3B）。细胞子组可以表现出"固体"核染色与+H2AX（图3C）。泛核污渍可能表明细胞因无法修复而损坏，并且/或是凋亡前。这种细胞通常以扩大的核和细胞质真空的存在为特征。此外，+2AX 可由 S 相中的复制应力和停滞的复制分叉触发，或由 G2/M 逮捕触发。如果需要，可以通过染色DNA含量或与特定标记共同染色来识别细胞周期相。进行DNA损伤修复分析时，可独立于个性化 foci 进行量化泛核。
辐照后，核表现出大量的双链断裂，而 +H2AX 的局部化速度非常快（图 4）。在最佳条件下，在没有辐照的情况下，很少观察到任何 +H2AX 源。辐照后，+H2AX源的形成急剧增加。如果处理和修复中断，每个核的 foci 计数将减少，以及 foci 的细胞数为正数。foci 的强度和数量因使用的细胞系和照射剂量而异。在低通道 HeLa 细胞中，生长在无内毒素血清中，我们经常观察到 30 分钟和 1 小时照射后 foci 的急剧增加，在 1 至 2 小时之间达到峰值，然后逐渐减少至 16 小时。因此，此处提供了 0、1、2、4 和 16 h 后辐照的代表性时间点。在细胞系之间以及基因耗尽或突变时，中断信号、修复和生存对辐照的行为可能差异很大。因此，最合适的时间点将是实验和细胞依赖。在实验中，在16小时+H2AX残留叶酸已达到与非辐照细胞相同的基底水平。如果使用缓慢划分的单元格线，建议监视残余点以包括以后的时间点。
图4：压力（时间过程）后核来源和定量。
•H2AX foci 形成在 t=0 （无辐照） 和在辐照后指示的时间点 （4 Gy， t=1， 2， 4， 16 h）。（A） 显示代表性图像。DAPI 表示核。比例线 = 5 μm。（B） 暴露+-辐照后α2AX的核源通过自动定量（细胞Profiler）对每个时间点在+100核中评分。根据所提出的生物问题和获得的数据类型，可以有不同的选择来提供原始数据，以便利比较和批判性理解。（i） 云图显示均值 = SD. 符号 （*） 表示相对于控制的统计显著性，使用学生的两尾 t 检验：***p = 0.0001，（ii） 感应曲线显示均值 = SEM，（iii） 每个原子核超过 10 个 foci。 请单击此处查看此图的较大版本。
相反，在缺乏DNA损伤修复功能的细胞中，+H2AX foci在没有辐照（t=0h）的情况下积累，即使在辐照后长时间点（t=16 h，t=24 h）时，修复也会延迟或缺失。野生细胞与突变细胞的直接比较，可以提供有关基因突变DNA修复功能的宝贵信息，并提示修复的类型。虽然 NHEJ 的不足可能迫使 HR 在 S 阶段修复中断，但已修复且必须由 HR 修复且必须由 HR 修复的 DSB 不会由 NHEJ 修复。因此，S 相后损伤的累积可能表示 HR 不足，高 +2AX 后分部提示 NHEJ 缺陷。
当在同一细胞中研究几种蛋白质时，可以通过不同动物物种中提出的多路复用初级抗体进行联合定位研究，并用标有不同荧光团的二级抗体来揭示这些蛋白质（图5）。共同定位表明（i）是否被招募到休息（二）被及时招募，（iii） 组装在DNA修复复合物中。在查找共同本地化时，一个普遍接受的定性方法是将结果呈现为不同通道（即绿色和红色）的简单叠加。绿色和红色的叠加将产生黄色热点，其中感兴趣的两种蛋白质存在于相同的像素中（图5A）。但是，此方法有局限性，因为它依赖于两个通道中收集的相对信号强度，并且两个氟化物在信号强度上可能有差异。因此，叠加方法有助于生成共同定位事件的可视化估计，但不适合定量目的。基于对象的方法（图5B （i-iii） 或执行强度相关系数 （ICCB） 分析的统计方法（图5B （iv）））可以实现共定位的定量分析。提供几种用于共同本地化分析的工具，包括JACoP（只是另一个联合定位插件;https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/jacop.html）和此处使用的"共化"管道（CellProfiler），这些工具可用作ICCB工具，以评估荧光强度之间的关系。这主要通过计算测量两个变量之间线性关系强度的相关系数（Pearson 系数）来完成。荧光共定位可以在散射图中以图形方式表示，其中一个荧光色（绿色）的强度与每个像素的第二个荧光色（红色）的强度相左。完全共定位的结果是围绕一条直线聚集的点，其斜率反映了两种颜色的荧光比。相反，缺乏共定位会导致点分布成两个单独的组（沿轴分布），每个组显示一种颜色的不同信号级别，而来自另一种颜色的信号很少或没有信号。Pearson 的系数值范围从 1 到 -1，1 代表完全正相关，负相关为 -1，零表示无相关性。或者，可以使用 Pclc 方法。此方法已应用于各种辐射（详情和免费可用方法见36）。
图5：联合本地化分析。
通过使用针对不同物种（此处，抗小鼠+2AX（红色）和抗兔53BP1（绿色））提出的几种抗体，可以研究几种蛋白质。（A） 显示代表性图像。DAPI 表示核。共同定位按颜色和面积重叠进行可视化（此处为红色 + 绿色 = 黄色）。比例线 = 5 μm。（B） 可以使用几种软件之一（此处，CellProfiler，请参阅主文本中的其他选项）和绘图，单独量化个人和共同本地化 foci。（i-iii）基于对象的方法，用于确定共同定位 （iv） 使用基于像素的方法（ICCB 分析）为共同定位获得的相关性结果。 请单击此处查看此图的较大版本。
补充信息。请点击这里下载此文件。
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Discussion
通过显微镜分析DNA损伤修复的时机和效率，已证明对了解DNA修复机械在正常细胞和人类疾病（如癌症）中如何工作至关重要。
特异性抗体的培养，允许检测活性蛋白在其磷酸化版本（如+H2AX，pRPA，pRAD50和其他10，23，39，43）,39,43在更好地了解DNA修复时间的事件及其与细胞周期的同步。10,53BP1磷酸化残留物分析通过质谱和免疫定位（见32审查）来说明这一成功，这有助于理解这种严重改性蛋白质的功能。随着SM暴等高分辨率微观技术的提升和小抗体（纳米抗体）使用的增加，细胞中的直接蛋白质相互作用变得越来越容易接近和准确。然而，间接免疫荧光，如这里所述，仍然是一个基本的实验，在研究一个新的潜在的DNA修复蛋白，并寻找行动时间和蛋白质伙伴。
间接免疫荧光的成功完全取决于两个标准：（一） 试剂的质量，特别是用于检测活性DNA修复蛋白磷残留的抗体，以及（ii） 实验的时机。应鼓励使用已发布的协议和抗体（如果可用）。当使用新型抗体或研究新型蛋白质时，应验证抗体，并且应通过降低细胞中的目标蛋白（信号应丢失）或蛋白质耗尽（使用纯化蛋白在孵化前耗尽特异性抗体，如 RAD51AP1中的 44 所示）确定特异性。
应建立最佳的阻尼条件和抗体稀释，以尽量减少伪影和非特异性染色。缓冲液将准备新鲜，如果进行核提取，它必须定时，以避免损害核。在研究人体细胞的修复效率时，应进行核叶酸的定量化，核提取有助于排除细胞质蛋白。然而，不执行核提取步骤是有益的，例如，研究疑似与其细胞伴侣相互作用的突变蛋白在DNA损伤时是否未能向细胞核转运。
此外，成像质量对于确保数据能够正确获取、分析和精确绘制数据至关重要。要控制的参数很多，包括：初级抗体的特异性，选择的荧光团（二级抗体）的激发光谱，保护样品免受光漂白，选择支持种子细胞，良好的采样（至少30至300个核，取决于问题），在某些情况下，后处理，如去卷电或光谱非光谱混合。如果可能，建议对全盖玻片进行自动成像，从而可以成像数千个单元格。在建立实验之前，应考虑让成像专家（如核心设施）参与，因为这将大大提高结果的质量。
最后，根据使用的细胞系、所做治疗和所调查的蛋白质，叶酸基底水平可能差异很大，使结果难以解释。因此，必须以读者能够理解的光来总结、处理、分析和以有效格式呈现原始数据;促进比较，揭示数据中的趋势和关系。在 图4B中，同点数的相同定量被绘制在三个单独的版本中：（一） 辐照引起的DSB（ii）在一段时间诱导的时分-动力学-（iii）正细胞（>10 foci/核）之后，foci（云图）总数。
尽可能首选云图（图4B （i），因为它们毫无歧视地显示所有数据点，从而提供最全面的实验概述。然而，绘制更具选择性和相关性的信息，如任意背景切断以上的正细胞数（大多数细胞系中为 5 个 foci）、foci 共位化数量、foci 诱导量，或 foci 的质量测量（如像素大小或强度），在某些情况下可能更合适，并且是作者的责任。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了圣安东尼奥地区基金会的赠款的支持。Mays 癌症中心由 NCI 癌症中心支持核心赠款 P30 CA054174 提供支持。我们要感谢斯蒂芬·霍洛韦帮助采购试剂，感谢宋实验室提供空间和显微镜容量。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 16% (v/v) paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Microscopy quality of the PFA ensures best images. If using "home-made PFA", filter prior to use. |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059 | Heat-shock fraction is recommended, to avoid precipitation/background. |
| Coverglass #1, 18 mm round (coverslips) | Neuvitro | NC0308920 | Coverslips need to be cleaned and sterilized prior using, with HCl or ethanol. |
| DMEM, High Glucose [(+) 4.5 g/L D-Glucose, (+) L-Glutamine, (-) Sodium Pyruvate] | Gibco | 11965118 | Adjust the growing media to the needs of cell line used. |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | PBS for tissue culture. |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Research Products International | E57060 | Nuclear extraction buffer. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 104370028 | The quality of FBS can be assessed by testing gH2AX foci formation. If traces of genotoxic endotoxin are present in the batch, gH2AX will be positive in the absence of stress. |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Research Products International | M24000 | Nuclear extraction buffer. |
| Piperazine-N,N′-bis(2-ethanesulfonic acid) (PIPES) | Research Products International | P40150 | Nuclear extraction buffer. |
| SlowFade Diamond Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen | S36973 | 300 nM DAPI with VECTASHIELD Antifade Mounting Medium can be used instead. |
| Sodium chloride (NaCl) | Research Products International | S23020 | Nuclear extraction buffer. |
| Sucrose | Research Products International | S24060 | Nuclear extraction buffer. |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | Polysine Slides can be used instead. |
| TC-Treated Multiple Well Plates, size 12 wells | Costar | 3513 | Seeding on coverslips is done in 12-wells plate. |
| Triton X-100 | AmericanBio | AB02025 | Nuclear extraction buffer. |
| TrypLE Express Enzyme (1X), No Phenol Red | Gibco | 12604021 | Trypsin-EDTA can be used instead. |
| Trypsin-EDTA (0.5%), No Phenol Red | Gibco | 15400054 | TrypLE can be used instead. |
References
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