Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

10.9K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61449

⸱

9 Eylül 2020

 ,  , 
1Cancer Genomics and BioComputing of Complex Diseases laboratory, The Azrieli Faculty of Medicine, Bar-Ilan University, 2The Data Science Institute, Bar-Ilan University, 3The Dangoor Centre For Personalized Medicine, Bar-Ilan University

Bu makalede

Özet

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Özet

Kanser hastalarının tümörlerindeki mutasyonların belirlenmesi hastalık yönetiminde çok önemli bir adımdır. Bu mutasyonlar tümör tanısının yanı sıra kanser hastalarında tedavi seçimi ve yanıtı için biyobelirteç görevi görür. Tümör mutasyonlarını tespit etmek için mevcut altın standart yöntem, tümör biyopsileri yoluyla tümör DNA'sının genetik testini içerir. Ancak bu invaziv yöntemin tümör mutasyon repertuarının takip testi olarak tekrar tekrar yapılması zordur. Sıvı biyopsisi, tümör mutasyonlarını kullanımı kolay ve invaziv olmayan bir biyopsi yaklaşımı olarak tespit etmek için yeni ve gelişmekte olan bir tekniktir.

Kanser hücreleri hızla çoğalır. Buna paralel olarak, çok sayıda kanser hücresine apoptoz geçiriliyor. Bu hücrelerden elde edilen döküntüler, tümör DNA mutasyonları taşıyan hücresiz DNA (cfDNA) parçaları adı verilen ince parçalanmış DNA parçalarıyla birlikte hastanın dolaşım sistemine salınır. Bu nedenle, sıvı biyopsi tekniği kullanılarak CFDNA bazlı biyobelirteçlerin tanımlanması için kanser hastalarından kan örnekleri toplanır, ardından plazma ve buffy coat ayrılması yapılır. Daha sonra, plazma cfDNA'nın izolasyonu için işlenir ve ilgili buffy kat hastanın genomik DNA'sının izolasyonu için işlenir. Her iki nükleik asit örneği de daha sonra miktarları ve kaliteleri için kontrol edilir; ve yeni nesil dizileme (NGS) teknikleri kullanılarak mutasyonlar için analiz edildi.

Bu yazıda, sıvı biyopsisi için kan alma, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Giriş

Teknolojik gelişmeler yüzlerce kanser genomunun ve transkriptomlarının dizilimine yol açmıştır1. Bu, farklı kanser türleri 2'deki moleküler değişikliklerin manzaralarının anlaşılmasına katkıdabulunmuştur. Bu manzaralar üzerinde yapılan diğer çalışmalar, apoptoz yollarını seri olarak bozarak kanser veya tümör ilerlemesinde rol oynayan sıralı somatik değişiklikler ve gen-gen füzyonları3'ün karakterize olmasına yardımcı oldu4. Bu nedenle, somatik mutasyonlar ve gen-gen füzyonları, belirli bir tümör tip5için tek tek hastalarda biyobelirteç görevi görerek tümörler hakkında bilgi sağlayabilir , mevcut primer tümörlerin prognozunu6olarak tanımlayabilir, ikincil tümörleri moleküler değişikliklere göre kategorizeedebilir 7ve ilaçlanabilir tümör hedeflerini tanımlayabilir8. Bu tür bilgiler kanser hastaları için kişiselleştirilmiş tedavinin seçilmesinde ve olumlu ve olumsuz tedavi yanıtlarının belirlenmesinde kolaylaştırabilir9. Bununla birlikte, tümör dokusunun genomik profillenmesini tanımlamak için tümör materyali elde etmek invaziv bir prosedürdür10. Ayrıca, bir tümör biyopsisi heterojen tümörün sadece küçük bir kısmını içerir; ve bu nedenle, tüm tümörün moleküler profili için temsili olmayabilir11. Seri izleme ve tümör genotipleme, tümör biyopsi prosedürünün invazivliği ve bu prosedürlerden kaynaklanan güvenlik sorunları nedeniyle genellikle mümkün olmayan tümör dokularının tekrar tekrar toplanmasını gerektirir12.

Sıvı biyopsi tekniği ise son on yılda hassas onkolojide büyük ilgi gördü13,14. Esas olarak bu tekniğin invaziv olmamasından ve birden fazla zaman noktasında tekrarlanma olasılığından kaynaklanır, böylece hastalık kursları için kullanımı kolay ve güvenli bir izleme tekniği sağlar15,16. Sıvı biyopsisi, tümör hücrelerinin hızla çoğaldığı ve aynı anda birçoğunun apoptoz ve nekroz geçirdiği bir fenomene dayanmaktadır. Bu, apoptotik hücre kalıntılarının hastaların kanına salınmasına yol açar, apoptoz sırasında kesin boyutlarda kesilen DNA parçaları ile birlikte17. Kanserli olmayan hücrelerin apoptozları da hücresel kalıntılarının kana salınmasına yol açar, ancak bu hücrelerdeki apoptoz oranı tümör hücrelerinden nispeten daha düşüktür18. Sıvı biyopsi tekniğinin mantığı, kanda sürekli dolaşan DNA, RNA, proteinler ve tümör hücreleri14,19 gibi tümörle ilişkili molekülleri yakalamaktır. Bu moleküllerin analizi için Yeni Nesil Dizileme (NGS), dijital damlacık polimeraz zincir reaksiyonu (ddPCR), gerçek zamanlı PCR ve enzime bağlı immünosorbent test (ELISA) dahil olmak üzere çeşitli teknikler20 kullanılabilir. Sıvı biyopsi tekniği, tümör hücrelerinin özellikleri olan biyobelirteçlerin tanımlanmasını sağlar. Bu biyobelirteç molekülleri sadece bir tümörün belirli bölgelerinden değil, tümörün tüm bölümlerinden salınır21. Bu nedenle, sıvı biyopsisinde tanımlanan belirteçler, vücuttaki diğer tümörlere ek olarak, tüm heterojen tümörün moleküler profillemini temsil eder, böylece doku biyopsisi tabanlı tekniğe göre avantajlara sahiptir22.

CfDNA'nın dolaşımdaki kanda birkaç dakika ile 1-2 saat arasında değişen kısa bir yarı ömür süresivardır 23. Ancak cfDNA'nın kısa yarı ömrü, tedavi yanıtı ve dinamik tümör değerlendirmelerini değerlendirerek gerçek zamanlı analizleri kolaylaştırır. Tümörden türetilmiş cfDNA düzeyleri, cfDNA düzeyleri ile sağkalım sonuçları arasında bir ilişki olduğunu gösteren çeşitli çalışmalarla kanıtlanan tümör evresinin / boyutunun prognostikasyonunu göstermektedir24. Ayrıca, çalışmalar cfDNA'nın mevcut tümör belirteçlerinden daha iyi bir tahmin kapasitesine sahip olduğunu kanıtlamıştır25. CfDNA'nın prognostikasyonu kanser tedavisinden sonra daha da belirgindir, tedaviden sonra daha yüksek cfDNA seviyeleri, daha düşük bir sağkalım oranı ve tedaviye direnç ile iyi ilişkilidir. Tedaviyi takiben cfDNA'nın daha düşük seviyeleri genellikle pozitif tedavi yanıtına karşılık gelir. Ek olarak, cfDNA geleneksel algılama yöntemlerine göre tedavi yanıtının erken tespitini kolaylaştırır.

CfDNA, kanserle ilişkili mutasyonların erken teşhis olasılığını arttırır: erken evre hastalık15, semptomların başlangıcı26 ve kanser tanısından önce 2 yıla kadar27. CfDNA birden fazla tümör bölgesinden veya odaklardan salındığı için, analizi temsil ettiği tümör genomunun kapsamlı bir görünümünü sağlar28. Bu nedenle, cfDNA doku örneklerinde kaçırılmış olabilecek somatik mutasyonları tespit etmeyi sağlar29. Tümör içi heterojenlik ve subklonal mutasyonlar binlerce baza yayılan genomik bölgelerin derin dizilimi ile tespit edilebildiğinden, cfDNA'nın analizi farklı genomik imzalara sahip spesifik moleküler alt tiplerin ortaya çıkarılmasına olanak sağlar13. Doku örneği ile benzer düzeyde bilgi elde etmek için birçok katı biyopsiye ihtiyaç duyulacaktı.

Ayrıca, cerrahi tedavi ve/veya kemoterapi sonrası kolon, yumurtalık ve akciğer kanseri gibi lokalize bir hastalığı olan hastalarda cfDNA düzeylerinin kanser nüks ve tedavi sonuçları için güçlü bir prognostik belirteç olduğu gösterilmiştir20. Ayrıca, kolon, meme ve akciğer kanseri olan hastalarda, kandan cfDNA analizleri tümöre özgü değişiklikleri başarıyla tespit edebilir, bu da birkaç ay önceden nüksün kesin tahminine yol açtı13. Ayrıca, anti-EGFR tedavisi alan CRC'li hastalarda KRAS mutasyonları gibi tedavi direnci belirteçleri30; Çeşitli tedaviler ile tedavi sonrası meme kanseri olan hastalarda PIK3CA, MED1 veya EGFR gibi genler için VAF'lar31; ve EGFR hedefli TKIs32 ile tedavi edilen akciğer kanseri hastalarında EGFR T790M direnç mutasyonu cfDNA analizi ile de tanımlanabilir.

Özetle, cfDNA analizi onkoloji alanında hassas biyobelirteçleri tanımlamak için kullanılabilir13,33. Bu protokolde 3 glioma hastasının kan örnekleri ve 3 sağlıklı kontrolle WBC'lerden genomik DNA ve plazmadan CFDNA elde edildi. Glioma kanserinde, IDH, TERT, ATRX, EGFR ve TP53'teki mutasyonlar, glioma tümörlerinin erken tanısında yardımcı olabilecek, farklı glioma tümörlerini sınıflandırabilecek, bireysel hasta için doğru tedaviye rehberlik eden ve tedavi yanıtını anlayan prognostik belirteçler olarak hizmet vermektedir34,35. Bu genlerin mutasyon durumu kan türevi cfDNA kullanılarak tanımlanabilir. Bu yazıda, glioma kanserindeki mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılan plazma türevi cfDNA'nın ayrıntılı bir protokolünü sunuyoruz12. Bu makalede açıklanan cfDNA tabanlı sıvı biyopsi protokolü, diğer birçok kanser türünde mutasyonel değişiklikleri incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, yeni bir çalışma cfDNA bazlı sıvı biyopsinin 50 farklı kanser türünü tespit36.

Kan örneği toplama, depolama ve sevkiyat bu protokolde çok önemli adımlardır, çünkü bu adımlar sırasında kontrolsüz sıcaklık WBC'lerin lizizine neden olur, WBC'den plazmaya genomik DNA salınması ve prosedürün geri kalanını etkileyen cfDNA örneğinin kirlenmesine neden olur37. Kontrolsüz sıcaklığa bağlı hemoliz, PCR adımları38gibi cfDNA'nın aşağı akış numune hazırlama süreçlerini bozabilir. Serum plazma yerine yüksek oranda germline cfDNA içerir, ancak tümörle ilişkili cfDNA39için büyük bir arka plan gürültüsü sunar. Bu nedenle, tümörle ilişkili cfDNA'yı izole etmek için plazma uygun bir örnektir39. Kan alma tüpü içeren bir pıhtılaştırıcıya çekilen kan, plazmayı ayırmak ve CFDNA kontaminasyonünü önlemek için derhal veya iki saate kadar santrifüjlenmelidir. Bu protokolde, kan alma tüpleri içeren antikoagülanlara alternatif olan özel ticari cfDNA koruma kan alma tüpleri kullanılmaktadır (bkz. Malzeme Tablosu). Bu özel kan alma tüpleri cfDNA ve cfRNA'yı korur ve WBC'lerin lizizini ortam sıcaklığında 30 güne kadar ve 37 °C'de 8 güne kadar önler. Bu, bir kan örneği sevkiyatı sırasında ve plazma ve WBC ayrılana kadar uygun sıcaklığın korunmasını kolaylaştırır40.

Şu anda üç tür cfDNA ekstraksiyon metodolojisi vardır: faz izolasyonu, silikon-membran bazlı spin sütunu ve manyetik boncuk bazlı izolasyon41. Silikon-membran bazlı spin sütun yöntemi, diğer cfDNA ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla yüksek bütünlüğe sahip yüksek miktarda cfDNA verdi42.

DNA'nın nicel değerlendirilmesi sıvı biyopsisinde temel bir gerekliliktir, kolay uygulanması ve geniş kullanımı için basit, uygun fiyatlı ve standartlaştırılmış bir prosedür geliştirmeye ihtiyaç vardır. CfDNA nicelemesi için yaygın olarak kullanılan üç yöntem spektrofotometrik, florometrik ve qPCR'dir. Florometrik yöntem doğruluk, maliyet ve iletim kolaylığı ile ilgili diğer yöntemlere göre daha iyi kanıtlanmıştır43.

CfDNA'nın bütünlüğü ve saflığı agarose elektroforez veya kılcal elektroforez ile tahmin edilebilir. Agarose elektroforez ne düşük cfDNA konsantrasyonunda hassasiyet gösterir ne de cfDNA'nın hassas parça boyutunu göstermek için yüksek çözünürlüğe sahiptir. Öte yandan, kılcal elektroforez, ilişkili zorlukların üstesinden gelmekle agarose elektroforez üzerinde bir avantaja sahiptir ve bu nedenle araştırmacılar tarafından cfDNA parça boyutu analizi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolde, izole edilmiş cfDNA'nın parça boyutu dağılımı otomatik kılcal elektroforez cihazı kullanılarak tahmin edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Kan alamadan önce, araştırmaya katılan deneklerden bilgilendirilmiş onay alınması ve alınması gerekir. Bu yazıda açıklanan araştırma Rabin Tıp Merkezi, İsrail etik komitesi (etik kod: 0039-17-RMC) ve Tıp Fakültesi Der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel, Almanya etik komitesine (etik kod: D 405/14) uygun ve uygun olarak gerçeklenmiştir.

1. CfDNA veya cfRNA koruyucu tüplerde kan örneği toplama ve depolama

  1. Koruma tüplerini uygun şekilde etiketle
  2. Aşağıda açıklandığı gibi venipuncture için standart kurumsal protokole göre bir kan toplama seti ve bir tutucu kullanarak cf-DNA koruma tüpüne ~8 mL kan toplayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Kan alma setinin kullanılması, kanın tüpten olası geri akışını önleyebilir.
    1. Hastayı kolu aşağı doğru hizalayın.
    2. Tüp içeriğinin kapak veya iğne ucuna temas etmesini sağlarken, kapağı yukarı dönük olarak tüpü dik tutun.
    3. Tüpe kan akmaya başladığında turnikeyi yavaşça serbest bırakın.
  3. Tüp kanla doldurulduktan hemen sonra (maksimum kapasite: 8,4 mL tam kan), numuneyi stabilize etmek için tüpü hafifçe ters çevirin (tüpü tutan kolun bileğini 180 ° aşağı ve geri çevirin).
    NOT: Inversion, koruyucunun numuneyle eşit şekilde karıştırılmasını sağlar. Ancak, plazma hazırlamadan önce bile içeriği tekrar sallamayın. Koruyucuların kan örneği ile yetersiz karıştırılması, içeriğin dengesinin bozulmasına ve mikro pıhtı veya hemoliz oluşumuna yol açar. Bu aşamada, plazma ayrımı için protokole hemen devam edilebilir veya kan dolu tüpler ortam sıcaklığında (15-25 ° C) 30 güne kadar ve 37 ° C'de 8 güne kadar bekleyebilir.

2. Plazma ve buffy ceket ayırma ve depolama

  1. Plazmayı ayırmak için kan dolu koruma tüpünü oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 425 x g'da santrifüjlayın.
    NOT: Adım 2.2 ve 2.3 bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.
  2. Üst plazma tabakasını, alt katmanları bozmadan, 1 mL aliquots içinde taze bir tüpe dikkatlice pipetleyin.
  3. Alt katmandaki RBC'lerden kaçınırken, bir sonraki buffy katını taze bir tüpe (katman RBC peletlerinin üzerinde bir halka olarak görünür) dikkatlice aktarın.
  4. Plazma ile 3. adıma ve buffy coat ile 4. Gerekirse ayrılmış içeriği -80 °C'de saklayın.

3. Dolaşımdaki cfDNA'nın 1 mL plazmadan arındırılması

NOT: Bu adım ticari bir kit ile gerçekleştirilir (bkz. Malzeme Tablosu). Tüm tamponlar kit ile birlikte verilir.

  1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması
    DİkKAT: Numune hazırlama atıklarına doğrudan asidik çözeltiler veya çamaşır suyu eklemeyin. Çamaşır suyu veya asitlerle birleştirildiğinde Liziz tamponu, Bağlama tamponu ve Yıkama Tamponu-1'de bulunan guanidin tuzları oldukça reaktif bileşikler üretebilir.
    1. Bağlama tamponu: 500 mL çalışma Bağlama tamponu yapmak için 300 mL Bağlama tampon konsantresini 200 mL0 izopropanol ile karıştırın. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Bağlayıcı tampon, dolaşımdaki nükleik asitlerin silika zara en uygun şekilde bağlanmasını sağlar. Bağlama tamponunun 500 mL'si sırasıyla 276, 138, 92, 69 veya 55 numune 1, 2, 3, 4 veya 5 mL plazmanın işlenmesi için yeterlidir ve oda sıcaklığında 1 yıl boyunca stabildir.
















  11. figure-protocol-1




Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Plazma Ayırma
CfDNA veya cfRNA koruyucu tüplerde toplanan 8,5-9 mL kan, hacim olarak yaklaşık 4 mL plazma verir. EDTA tüplerinde toplanan kandan ayrılan plazma hacmi sıcaklığa bağlı olarak değişebilir. Kan içeren EDTA tüplerinin 37 °C'den yüksek bir sıcaklıkta maruz kalması plazma hacmi veriminin düşmesine yol açar44.

Florometre Tahlil Sonuçları
glioma hastalarının her birinin 1 mL plazmasında cfDNA konsantrasyonu #1 sırasıyla 137...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir hastanın kanının bir tüpte toplanması, sevkıyat ve depolanmasının sıvı biyopsisinde ilk adımlar çok önemli olduğunu. Yanlış kullanım plazmanın kalitesini bozabilir ve bu nedenle sıvı biyopsi sonuçlarına müdahale edebilir47. Bir EDTA kan tüpünde kan örneği toplanırsa, WBC'lerin lizizini önlemek ve genomik DNA'sının plazma48'esalınmasını önlemek için plazmanın kan toplandıktan sonraki iki saat içinde ayrılması gerekir. WBC'ler daha uzun süre tutulursa bir EDTA tüpünde de ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, Kanser Genomik ve Karmaşık Hastalıkların Biyo-Bilgisayar Laboratuvarı üyelerine, keskin gözlemsel girdileri ve bu projenin farklı aşamalarında birden fazla tartışmaya katılımları için teşekkür eder. Finansman desteği, İsrail Kanser Derneği 'ni (M.F-M 2017-2019 için ICA hibesi) ve İsrail İnovasyon Otoritesi'nin Kamin hibesini (M.F-M. için) içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2100 Biyoanalizör CihazıAgilent Technologies, Inc.G2939BA2100 Biyoanalizör sistemi, biyomoleküllerin numune kalite kontrolü için kurulmuş bir otomatik elektroforez aracıdır.
Doldurma İstasyonu için Ayarlanabilir KlipsAgilent Technologies, Inc.5042-1398Talaş astarlama için tanımlanmış basıncı uygulamak için şırınga ile birlikte kullanılır.
Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent Teknolojileri, Inc.5067-4626Yüksek Hassasiyetli DNA tahlilleri genellikle yeni nesil dizileme kitaplıkları
cf-DNA/cf-RNA Koruyucu TüplerNorgen Biotek Corp.63950Norgen'in cf-DNA/cf-RNA Koruyucu Tüpleri, depolama ve nakliye sırasında insan tam kan örneklerinde cf-DNA, dolaşımdaki tümör DNA'sı, cf-RNA ve dolaşımdaki tümör hücrelerinin toplanması ve korunması için kapalı, boşaltılmış plastik tüplerdir
Çip Hazırlama İstasyonuAgilent Technologies, Inc.5065-4401Her bir tahlil kitiyle birlikte verilen bir şırınga ile jel matrisini bir çipe yüklemek için kullanılır ve RNA, DNA ve protein tahlilleri için kullanılır. Doldurma istasyonu, kronometre ve 1 şırınga klipsi
içerir Elektrot Temizleyici KitiAgilent Technologies, Inc.5065-9951Çapraz kontaminasyonu önler. Elektrotlardan bakteri veya protein kirleticilerini giderir.
Jel MatrisAgilent Technologies, Inc.185-5990DNA boya konsantresi ve DNA jel matrisinin uygun şekilde karıştırılması için kullanılır
IKA Basic Chip VortexIKA-Werke GmbH & Co. KGMS-3-S36DNA merdiveni ve DNA örneğinin Biyoanalizör tahlil çipleri üzerinde uygun şekilde karıştırılması için kullanılır
NucleoSpin Doku kitiMACHEREY-NAGEL740952.5NucleoSpin Doku kiti ile doku, hücreler
genomik DNA hazırlanabilir (örn. bakteri) ve diğer birçok kaynak.
QIAamp dolaşımdaki nükleik asit kitiQiagen55114QIAamp Dolaşımdaki Nükleik Asit Kiti, bu dolaşımdaki nükleik asitlerin insan plazmasından veya serumundan ve diğer hücresiz vücut sıvılarından verimli bir şekilde saflaştırılmasını sağlar.
QIAvac 24 Plus vakum manifolduQiagen19413QIAvac 24 Plus vakum manifoldu, QIAGEN kolonlarının paralel olarak vakumla işlenmesi için tasarlanmıştır.
QIAvac Bağlantı SistemiQiagen19419QIAvac Bağlantı Sistemi ile birlikte, QIAvac 24 Plus vakum manifoldu bir akış sistemi olarak kullanılabilir. Muhtemelen bulaşıcı materyal içeren numune akışı, ayrı bir atık şişesinde toplanır.
Qubit 2.0 florometreInvitrogenQ32866Qubit 2.0 Florometre, DNA, RNA ve protein kantitasyonu için Qubit tahlilleriyle çalışmak üzere tasarlanmış, kullanımı kolay, analitik bir araçtır.
Kübit tahlil tüpleriThermo Fisher ScientificQ32856Kübit tahlil tüpleri 500 & L Qubit Florometre ile kullanım için ince duvarlı polipropilen tüpler.
Qubit dsDNA HS Test KitiThermo Fisher ScientificQ32851Qubit dsDNA HS (Yüksek Hassasiyet) Test Kiti, Qubit Florometre ile kullanılmak üzere özel olarak tasarlanmıştır. Test, RNA'ya göre çift sarmallı DNA (dsDNA) için oldukça seçicidir ve 10 pg/&mikro'dan itibaren ilk numune konsantrasyonları için doğru olacak şekilde tasarlanmıştır; L ila 100 ng/&mikro;L.
Vakum PompasıQIAGEN84010QIAGEN sütunlarının
Çeşitli< / güçlü>
50 ml santrifüj tüpleri
Kırılmış buz
Etanol (96– % 100)
56 &° C'de ısıtma bloğu veya benzeri; C (2 ml toplama tüpü tutabilir)
İzopropanol (%100)
Mikrosantrifüj
Fosfat tamponlu salin (PBS)
Pipetler (ayarlanabilir)
Steril pipet uçları (çapraz kontaminasyonu önlemeye yardımcı olmak için aerosol bariyerli pipet uçları önerilir)
60 ° C'de 50 mL santrifüj tüplerini tutabilen su banyosu veya ısıtma bloğu; Ç
için numune kalite kontrolü için kullanılır. için Filtreler, vakumla işlenmesi için kullanılır, ,

Kaynaklar

  1. Campbell, P. J., et al. Pan-cancer analysis of whole genomes. Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).
  2. Liotta, L., Petricoin, E. Molecular profiling of human cancer. Nature Reviews Genetics. 1 (1), 48-56 (2000).
  3. Balamurali, D., et al. ChiTaRS 5.0: the comprehensive database of chimeric transcripts matched with druggable fusions and 3D chromatin maps. Nucleic Acids Research. 48 (1), 825-834 (2019).
  4. Trédan, O., et al. Molecular screening program to select molecular-based recommended therapies for metastatic cancer patients: Analysis from the ProfiLER trial. Annals of Oncology. 30 (5), 757-765 (2019).
  5. Oliveira, K. C. S., et al. Current perspectives on circulating tumor DNA, precision medicine, and personalized clinical management of cancer. Molecular Cancer Research. 18 (4), 517-528 (2020).
  6. Siegal, T. Clinical impact of molecular biomarkers in gliomas. Journal of Clinical Neuroscience. 22 (3), 437-444 (2015).
  7. Komori, T. The 2016 WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System: The Major Points of Revision. Neurologia medico-chirurgica. 57 (7), 301-311 (2017).
  8. Duffy, M. J., O'Donovan, N., Crown, J. Use of molecular markers for predicting therapy response in cancer patients. Cancer Treatment Reviews. 37 (2), 151-159 (2011).
  9. Saenz-Antoñanzas, A., et al. Liquid Biopsy in Glioblastoma: Opportunities, Applications and Challenges. Cancers. 11 (7), 950(2019).
  10. Marrugo-Ramírez, J., Mir, M., Samitier, J. Blood-Based Cancer Biomarkers in Liquid Biopsy: A Promising Non-Invasive Alternative to Tissue Biopsy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2877(2018).
  11. Pantel, K., Alix-Panabières, C. Liquid biopsy in 2016: Circulating tumour cells and cell-free DNA in gastrointestinal cancer. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 73-74 (2017).
  12. Bronkhorst, A. J., et al. The emerging role of cell-free DNA as a molecular marker for cancer management. Biomolecular Detection and Quantification. 17, 100087(2019).
  13. Cescon, D. W., Bratman, S. V., Chan, S. M., Siu, L. L. Circulating tumor DNA and liquid biopsy in oncology. Nature Cancer. 1 (3), 276-290 (2020).
  14. Palmirotta, R., et al. Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, 175883591879463(2018).
  15. Cohen, J. D. J., et al. Detection and localization of surgically resectable cancers with a multi-analyte blood test. Science. 359 (6378), New York, N.Y. 926-930 (2018).
  16. Wan, J. C. M., et al. Liquid biopsies come of age: towards implementation of circulating tumour DNA. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 223-238 (2017).
  17. Heitzer, E., Haque, I. S., Roberts, C. E. S., Speicher, M. R. Current and future perspectives of liquid biopsies in genomics-driven oncology. Nature Reviews Genetics. 20 (2), 71-88 (2018).
  18. Thierry, A. R., et al. Origins, structures, and functions of circulating DNA in oncology. Cancer and Metastasis Reviews. 35 (3), 347-376 (2016).
  19. Buscail, E., et al. High Clinical Value of Liquid Biopsy to Detect Circulating Tumor Cells and Tumor Exosomes in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients Eligible for Up-Front Surgery. Cancers. 11 (11), 1656(2019).
  20. Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating Tumor DNA as a Liquid Biopsy for Cancer. Clinical Chemistry. 61 (1), 112-123 (2015).
  21. Kustanovich, A., Schwartz, R., Peretz, T., Grinshpun, A. Life and death of circulating cell-free DNA. Cancer Biology and Therapy. 20 (8), 1057-1067 (2019).
  22. Crowley, E., Di Nicolantonio, F., Loupakis, F., Bardelli, A. Liquid biopsy: monitoring cancer-genetics in the blood. Nature Reviews Clinical Oncology. 10 (8), 472-484 (2013).
  23. Celec, P., et al. Cell-free DNA: the role in pathophysiology and as a biomarker in kidney diseases. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, (2018).
  24. Gautschi, O., et al. Origin and prognostic value of circulating KRAS mutations in lung cancer patients. Cancer Letters. 254 (2), 265-273 (2007).
  25. Bidard, F., et al. Detection rate and prognostic value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA in metastatic uveal melanoma. International Journal of Cancer. 134 (5), 1207-1213 (2013).
  26. Chan, K. C. A., et al. Analysis of Plasma Epstein–Barr Virus DNA to Screen for Nasopharyngeal Cancer. New England Journal of Medicine. 377 (6), 513-522 (2017).
  27. Mao, L., et al. Detection of Oncogene Mutations in Sputum Precedes Diagnosis of Lung Cancer. Cancer Research. 54 (7), 1634-1637 (1994).
  28. De Mattos-Arruda, L., et al. Cerebrospinal fluid-derived circulating tumour DNA better represents the genomic alterations of brain tumours than plasma. Nature communications. 6 (1), 8839(2015).
  29. Khier, S., Lohan, L. Kinetics of circulating cell-free DNA for biomedical applications: critical appraisal of the literature. Future science OA. 4 (4), 295(2018).
  30. Misale, S., et al. Resistance to Anti-EGFR therapy in colorectal cancer: From heterogeneity to convergent evolution. Cancer Discovery. 4 (11), 1269-1280 (2014).
  31. Beddowes, E., Sammut, S. J., Gao, M., Caldas, C. Predicting treatment resistance and relapse through circulating DNA. Breast. 34, 31-35 (2017).
  32. Sacher, A. G., et al. Prospective Validation of Rapid Plasma Genotyping for the Detection of EGFR and KRAS Mutations in Advanced Lung Cancer. JAMA oncology. 2 (8), 1014-1022 (2016).
  33. Vaidyanathan, R., et al. Cancer diagnosis: from tumor to liquid biopsy and beyond. Lab on a Chip. 19 (1), 11-34 (2019).
  34. Kelly, P. Gliomas: Survival, origin and early detection. Surgical Neurology International. 1 (1), 96(2010).
  35. Faria, G., Silva, E., Da Fonseca, C., Quirico-Santos, T. Circulating Cell-Free DNA as a Prognostic and Molecular Marker for Patients with Brain Tumors under Perillyl Alcohol-Based Therapy. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1610(2018).
  36. Liu, M. C., et al. Sensitive and specific multi-cancer detection and localization using methylation signatures in cell-free DNA. Annals of Oncology. 31 (6), 745-759 (2020).
  37. Enko, D., Halwachs-Baumann, G., Kriegshäuser, G. Plasma free DNA: Evaluation of temperature-associated storage effects observed for roche cell-free DNA collection tubes. Biochemia Medica. 29 (1), 153-156 (2019).
  38. Streleckiene, G., et al. Effects of Quantification Methods Isolation Kits, Plasma Biobanking, and Hemolysis on Cell-Free DNA Analysis in Plasma. Biopreservation and Biobanking. 17 (6), 553-561 (2019).
  39. Thress, K. S., et al. Acquired EGFR C797S mutation mediates resistance to AZD9291 in non-small cell lung cancer harboring EGFR T790M. Nature Medicine. 21 (6), 560-562 (2015).
  40. Ward Gahlawat, A., et al. Evaluation of Storage Tubes for Combined Analysis of Circulating Nucleic Acids in Liquid Biopsies. International Journal of Molecular Sciences. 20 (3), 704(2019).
  41. Lu, J. L., Liang, Z. Y. Circulating free DNA in the era of precision oncology: Pre- and post-analytical concerns. Chronic Diseases and Translational Medicine. 2 (4), 223-230 (2016).
  42. Iyapparaj, P., et al. Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus sp. MSU3IR against shrimp bacterial pathogens. Aquatic Biosystems. 9 (1), 12(2013).
  43. Ponti, G., et al. The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients. Clinica Chimica Acta. 479, 14-19 (2018).
  44. Medina Diaz, I., et al. Performance of Streck cfDNA blood collection tubes for liquid biopsy testing. PLoS One. 11 (11), 0166354(2016).
  45. Perkins, G., et al. Multi-Purpose Utility of Circulating Plasma DNA Testing in Patients with Advanced Cancers. PLoS One. 7 (11), 47020(2012).
  46. Mouliere, F., et al. Multi-marker analysis of circulating cell-free DNA toward personalized medicine for colorectal cancer. Molecular Oncology. 8 (5), 927-941 (2014).
  47. Trigg, R. M., Martinson, L. J., Parpart-Li, S., Shaw, J. A. Factors that influence quality and yield of circulating-free DNA: A systematic review of the methodology literature. Heliyon. 4 (7), 00699(2018).
  48. Risberg, B., et al. Effects of Collection and Processing Procedures on Plasma Circulating Cell-Free DNA from Cancer Patients. Journal of Molecular Diagnostics. 20 (6), 883-892 (2018).
  49. Markus, H., et al. Evaluation of pre-analytical factors affecting plasma DNA analysis. Scientific Reports. 8 (1), 7375(2018).
  50. Chen, Z., et al. Comprehensive Evaluation of the Factors Affecting Plasma Circulating Cell-Free DNA Levels and Their Application in Diagnosing Nonsmall Cell Lung Cancer. Genetic Testing and Molecular Biomarkers. 23 (4), 270-276 (2019).
  51. Schwarzenbach, H., Hoon, D. S. B., Pantel, K. Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients. Nature Reviews Cancer. 11 (6), 426-437 (2011).
  52. Malyuchenko, N. V., et al. PARP1 Inhibitors: antitumor drug design. Acta Naturae. 7 (3), 27-37 (2015).
  53. Fleischhacker, M., Schmidt, B. Circulating nucleic acids (CNAs) and cancer-A survey. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1775 (1), 181-232 (2007).
  54. Jung, K., Fleischhacker, M., Rabien, A. Cell-free DNA in the blood as a solid tumor biomarker—A critical appraisal of the literature. Clinica Chimica Acta. 411 (21-22), 1611-1624 (2010).
  55. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS: a database of human, mouse and fruit fly chimeric transcripts and RNA-sequencing data. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 142-151 (2013).
  56. Frenkel-Morgenstern, M., et al. ChiTaRS 2.1--an improved database of the chimeric transcripts and RNA-seq data with novel sense-antisense chimeric RNA transcripts. Nucleic Acids Research. 43, Database issue 68-75 (2015).
  57. Gorohovski, A., et al. ChiTaRS-3.1-the enhanced chimeric transcripts and RNA-seq database matched with protein-protein interactions. Nucleic Acids Research. 45 (1), 790-795 (2017).
  58. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Research. 47 (1), 941-947 (2019).
  59. Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
  60. Szopa, W., Burley, T. A., Kramer-Marek, G., Kaspera, W. Diagnostic and Therapeutic Biomarkers in Glioblastoma: Current Status and Future Perspectives. BioMed Research International. 2017, 1-13 (2017).
  61. Salesse, S., Verfaillie, C. M. BCR/ABL: from molecular mechanisms of leukemia induction to treatment of chronic myelogenous leukemia. Oncogene. 21 (56), 8547-8559 (2002).
  62. Frenkel-Morgenstern, M., Valencia, A. Novel domain combinations in proteins encoded by chimeric transcripts. Bioinformatics. 28 (12), 67-74 (2012).
  63. Frenkel-Morgenstern, M., et al. Chimeras taking shape: Potential functions of proteins encoded by chimeric RNA transcripts. Genome Research. 22 (7), 1231-1242 (2012).
  64. Simon, M., et al. TERT promoter mutations: a novel independent prognostic factor in primary glioblastomas. Neuro-Oncology. 17 (1), 45-52 (2015).
  65. Waitkus, M. S., Diplas, B. H., Yan, H. Isocitrate dehydrogenase mutations in gliomas. Neuro-Oncology. 18 (1), 16-26 (2016).
  66. Kindler, T., Meyer, R. G., Fischer, T. BCR-ABL as a target for novel therapeutic interventions. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 6 (1), 85-101 (2002).
  67. Overman, M. J., et al. Use of research biopsies in clinical trials: are risks and benefits adequately discussed. Journal of Clinical Oncology Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 31 (1), 17-22 (2013).
  68. Vanderlaan, P. A., et al. Success and failure rates of tumor genotyping techniques in routine pathological samples with non-small-cell lung cancer. Lung Cancer. 84 (1), Amsterdam, Netherlands. 39-44 (2014).
  69. Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. 228-229, 169-179 (2018).
  70. Normanno, N., et al. The liquid biopsy in the management of colorectal cancer patients: Current applications and future scenarios. Cancer Treatment Reviews. 70, 1-8 (2018).
  71. Hufnagl, C., et al. Evaluation of circulating cell-free DNA as a molecular monitoring tool in patients with metastatic cancer. Oncology Letters. 19 (2), 1551-1558 (2020).
  72. Petit, J., et al. Cell-Free DNA as a Diagnostic Blood-Based Biomarker for Colorectal Cancer: A Systematic Review. The Journal of Surgical Research. 236, 184-197 (2019).
  73. Poulet, G., Massias, J., Taly, V. Liquid Biopsy: General Concepts. Acta Cytologica. 63 (6), 449-455 (2019).
  74. Alix-Panabières, C. The future of liquid biopsy. Nature. 579 (7800), 9(2020).
  75. Eisenstein, M. Could liquid biopsies help deliver better treatment. Nature. 579 (7800), 6-8 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sıvı BiyopsiPlazma İzolasyonuDNA EkstraksiyonuYeni Nesil DizilemeFragment AnaliziKanser BiyobelirteçleriKan Örneği İşlemeNükleik Asit KantifikasyonuJel Elektroforezi
Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.