Summary
Este protocolo describe una técnica crónica de implantación de ventanas craneales que se puede utilizar para imágenes longitudinales de estructuras neuro-glio-vasculares, interacciones y función en condiciones saludables y enfermas. Sirve como una alternativa complementaria al enfoque de imagen transcraneal que, aunque a menudo se prefiere, posee algunas limitaciones críticas.
Abstract
El sistema nervioso central (SNC) está regulado por una compleja interacción de células neuronales, gliales, estromales y vasculares que facilitan su correcta función. Aunque el estudio de estas células en aislamiento in vitro o juntos ex vivo proporciona información fisiológica útil; características destacadas de la fisiología de las células neurales se perderán en tales contextos. Por lo tanto, hay una necesidad de estudiar las células neuronales en su entorno in vivo nativo. El protocolo detallado aquí describe imágenes repetitivas in vivo de dos fotones de células neuronales en la corteza de roedores como una herramienta para visualizar y estudiar células específicas durante largos períodos de tiempo de horas a meses. Describimos en detalle el uso de la vasculatura cerebral groseramente estable como un mapa grueso o dendritas etiquetadas fluorescentemente como un mapa fino de regiones cerebrales seleccionadas de interés. Usando estos mapas como una clave visual, mostramos cómo las células neuronales se pueden reubicar con precisión para obtener imágenes in vivo repetitivas posteriores. Utilizando ejemplos de imágenes in vivo de microglia, neuronas y células NG2+ con etiqueta fluorescente, este protocolo demuestra la capacidad de esta técnica para permitir la visualización repetitiva de la dinámica celular en la misma ubicación cerebral durante largos períodos de tiempo, que puede ayudar aún más a entender las respuestas estructurales y funcionales de estas células en la fisiología normal o seguir insultos patológicos. Cuando sea necesario, este enfoque se puede acoplar a imágenes funcionales de células neuronales, por ejemplo, con imágenes de calcio. Este enfoque es especialmente una técnica poderosa para visualizar la interacción física entre los diferentes tipos celulares del SNC in vivo cuando están disponibles modelos genéticos de ratón o tintes específicos con etiquetas fluorescentes distintas para etiquetar las células de interés.
Introduction
El sistema nervioso central (SNC) se rige por una compleja interacción de interacciones entre varios tipos de células residentes, incluyendo neuronas, glia y células asociadas a vasos. Tradicionalmente, las células neurales se estudiaban en contextos aislados, co-cultivados1,,2,3,4,5 (in vitro) o de tejido cerebral extirpado (ex vivo)6,7,,8,9,10. Sin embargo, es necesario comprender mejor el comportamiento de las células neuronales y las interacciones en el entorno nativo del cerebro in vivo in vivo. En este protocolo, describimos un método para asignar regiones in vivo de interés y volver a escuchar con precisión esas regiones en futuras sesiones de imágenes para realizar un seguimiento de las interacciones complejas entre los distintos tipos de células CNS durante largos períodos de tiempo.
El desarrollo de enfoques de imagen in vivo ha proporcionado ganancias significativas para la comprensión adecuada de la función neuronal11,12,13,14,15. Específicamente, estos enfoques proporcionan varias ventajas sobre los enfoques tradicionales in vitro y ex vivo. En primer lugar, los sistemas de imágenes in vivo tienen componentes celulares y tisulares fisiológicamente relevantes, como la vasculatura, con todo el repertorio de interacciones celulares para proporcionar una comprensión completa de la fisiología de la red neuronal. En segundo lugar, los hallazgos recientes sugieren que cuando se eliminan de su entorno nativo, ciertas células neuronales (como la microglia) pierden características importantes de su identidad y, por lotanto,la fisiología16,17 que se pueden conservar en el entorno in vivo. En tercer lugar, los sistemas de imágenes in vivo proporcionan la oportunidad de realizar investigaciones longitudinales estables de semanas a meses para estudiar las interacciones celulares del SNC. Por último, dada la creciente evidencia de las contribuciones del sistema inmunitario periférico18,19 y el microbioma20,21 en la fisiología del SNC, los sistemas in vivo proporcionan una plataforma para interrogar tales contribuciones y efectos en las células del SNC. Por lo tanto, los enfoques que emplean imágenes in vivo longitudinales para estudiar la fisiología neuroinmune y las interacciones en estados sanos, lesionados y enfermos son una gran adición complementaria a los enfoques tradicionales.
En este protocolo, describimos un enfoque confiable para la imagen de diferentes tipos de células en el cerebro, incluyendo microglia, neuronas y NG2+ células como ejemplos. Se han desarrollado dos enfoques para visualizar las células neuronales in vivo: el enfoque del cráneo adelgazado y el cráneo abierto con un enfoque craneal de la ventana. Aunque los enfoques del cráneo adelgazado están en uso y son preferidos porque superan algunas de las desventajas del enfoque del cráneo abierto, como la activación de células gliales, la dinámica de la columna vertebral más alta que fisiológica y el uso de agentes antiinflamatorios22,,23,,24,,25,los enfoques del cráneo adelgazado también muestran algunos inconvenientes críticos. En primer lugar, el procedimiento de adelgazamiento es un procedimiento muy delicado que muchos investigadores encuentran difícil de perfeccionar, especialmente cuando es necesario volver a adelgazar. Este es el caso porque a menudo es difícil para los experimentadores determinar que han adelgazado el cráneo a una profundidad de 20 m. En segundo lugar, para las comparaciones adecuadas entre ratones, el adelgazamiento tendría que ser idéntico y una variedad de éxito de adelgazamiento entre sesiones de diagnóstico por imágenes o ratones podría complicar la visualización de las estructuras neuronales. En tercer lugar, cuando se emplean para imágenes longitudinales, los animales con cráneos adelgazados sólo se pueden utilizar para un número limitado de sesiones cuando se emplea el re-adelgazamiento del cráneo. En adelante, dado que todavía queda parte del tejido óseo, la claridad en profundidad de las imágenes podría verse comprometida a partir del enfoque del cráneo adelgazado, lo que permite una gran visualización de las regiones más superficiales pero no tan profundas. A la luz de esto, las estructuras cerebrales más profundas, como el hipocampo, no se pueden imaginar con éxito con el enfoque del cráneo adelgazado. Estas consideraciones plantean la necesidad de enfoques alternativos y complementarios que puedan superar estas preocupaciones.
Alternativamente al enfoque del cráneo adelgazado, el enfoque de implantación de la ventana del cráneo abierto utiliza un procedimiento en el que el cráneo se reemplaza con un cubreobjetos de vidrio ópticamente transparente. Esto permite un número casi ilimitado de sesiones de imágenes. Además, dado el reemplazo del cráneo por el cubreobjetos de vidrio, este método permite una ventana de visualización clara de células cerebrales etiquetadas fluorescentemente durante largos períodos de tiempos de horas a meses y, por lo tanto, se puede emplear para estudiar la actividad celular y las interacciones que son relevantes para la fisiología, el envejecimiento y la patología.
En general, detallamos los pasos que se pueden seguir para implantar ventanas craneales crónicas a través de una craneotomía estereotaxica que permite la toma de imágenes in vivo de las regiones cerebrales de interés. También describimos cómo la vasculatura cerebral muy estable o las dendritas etiquetadas fluorescentemente podrían utilizarse para generar un mapa grueso o fino, respectivamente de las regiones cerebrales de interés. Este enfoque se puede utilizar para imágenes repetidas durante varias sesiones. La importancia de esta técnica, por lo tanto, radica en su capacidad para imaginar los cambios a largo plazo o éxtasis en los elementos cerebrales, incluyendo la disposición, morfología, y las interacciones de los diferentes tipos celulares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos los pasos están de acuerdo con las pautas establecidas y aprobadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso animal de la Universidad de Virginia.
1. Preparación del ratón para la implantación de ventanas craneales
NOTA: Varias líneas transgénicas del ratón con etiquetas florescentes son adecuadas para la toma de imágenes.
- Utilice ratones CX3CR1GFP/+ 26 para visualizar la microglia in vivo. Por lo general, se utilizan ratones juveniles a adultos jóvenes de 4 a 10 semanas de edad que pesan 17-25 g.
NOTA: Aunque, este enfoque es incluso apto para ratones pre-destetados, la necesidad de devolver los ratones a su jaula con sus madres para la alimentación, puede complicar la recuperación si la madre no cuida adecuadamente a los cachorros después de la cirugía. Por lo tanto, se recomienda el uso de ratones después del destete. - Anestesar el ratón usando isoflurano (5% de flujo de oxígeno para la inducción durante 1 min) en una cámara anestésica. Compruebe que el ratón no muestre ningún movimiento o respuestas de contracción a los pellizcos de los dedos del dedo del dedo del y/o de la cola. Saca el ratón de la cámara y al aire libre afeita bien el cabello de la cabeza entre las orejas desde aproximadamente el nivel de los ojos hasta la parte superior de la región del cuello usando un recortador de cabello.
NOTA: La concentración de isoflurano utilizado dependería del tamaño de la cámara de inducción. Por lo tanto, para cámaras más pequeñas, el isoflurano del 3-4% se puede utilizar para inducir eficazmente la anestesia, mientras que las cámaras más grandes requerirán hasta un 5%. - Mueva el ratón al cono nasal de la estación de cirugía estereotáctica para anestesia (1,5-2% para el mantenimiento de la cirugía), estabilice la cabeza con barras para los oídos y mantenga el ratón en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura del cuerpo caliente.
- Lubricar ambos ojos con pomada en los ojos. Inyectar 100 l de 0,25% de bupivicaína (para proporcionar analgesia local al ratón que durará 8-12 h) y 100 l de dexametasona de 4 mg/ml (para reducir la inflamación que puede resultar del procedimiento de cirugía) subcutánea en el lugar de la incisión. Deje que el ratón se siente durante al menos 5 minutos antes de pasar al siguiente paso.
- Limpie la cabeza afeitada con tres hisopos alternos de betadina y un 70% de alcohol. Haga una incisión del cuero cabelludo de línea media utilizando cuchilla quirúrgica o tijeras que se extienden desde la parte posterior de la región del cráneo entre las orejas hasta el área frontal entre los ojos. La piel restante se corta para exponer el cráneo.
- Limpie el tejido conectivo situado entre el cuero cabelludo y el cráneo subyacente con un 3% de peróxido de hidrógeno (H2O2)y localice el área del cerebro a tomar imágenes con coordenadas estereotácticas.
NOTA: A menudo hay algo de sangrado (paso 1.5) de la incisión en la superficie del cráneo. Este sangrado generalmente se resuelve por sí mismo dentro de 3-5 min. La limpieza con el peróxido ayuda. También se observa un tratamiento previo con bupivacaína (paso 1.4) para limitar la cantidad de sangrado durante este tiempo.
2. Cirugía de implantación de ventanas craneales de ratón
- Taladre una abertura circular de 4 mm en el cráneo utilizando una broca dental (0,7 mm de diámetro de la punta) y retire cuidadosamente esta parte del cráneo utilizando fórceps puntiagudos. Para tomar imágenes de la corteza somatosensorial de ratones de 6-8 semanas de edad, localice el centro de la craneotomía en -2.5 posterior y de 2.0 laterales al bregma. Durante la perforación, humedezca regularmente el cráneo con solución salina estéril y hisopos de algodón para enfriar el cerebro, limpiar los restos óseos y suavizar el hueso del cráneo para su eliminación final.
NOTA: Las coordenadas de la craneotomía variarían dependiendo de la región de interés y la edad de los ratones. - Después de retirar el cráneo, coloque cuidadosamente una pequeña cubierta (tamaño #0 de 0,1 x 0,02 mm de espesor) humedecida con solución salina en la craneotomía. Seque el exceso de solución salina con una toallita estéril.
- Usando un aplicador puntiagudo (como una punta de pipeta o el extremo puntiagudo de un palo de hisopo de algodón de madera roto), aplique pegamento de cianoacrilato alrededor de la ventana y permita que se adhiera al cerebro y al cráneo. Aplicar el pegamento de imprimación al resto del cráneo y curarlo con una luz de curado durante 20-40 s. Preparar un pozo alrededor de la ventana con el pegamento final y curar con una luz de curado para 20-40 s.
- Pega una pequeña placa de cabeza en el cráneo en el hemisferio contralateral de la craneotomía primero con el pegamento de imprimación como imprimación y luego con el pegamento final. Curar ambos con la luz de curado durante 20-40 s cada uno.
NOTA: Las suturas no son necesarias si el cráneo está totalmente cubierto con el pegamento durante este procedimiento.
3. Atención post-cirugía
- Permita que el ratón se despierte en ausencia de anestesia (la recuperación realizada en una almohadilla de calentamiento acorta el tiempo de recuperación) y vuelva a su jaula de casa una vez completamente despierto. Inyectar una dosis subcutánea de buprenorfina SR (0,5 mg/kg) como analgesia postoperatoria suficiente para 72 h.
- Para facilitar una recuperación saludable de la cirugía, proporcionar al ratón un alimento suave extra, que puede ser en forma de comida sólida regular en agua para suavizar la comida o alimentos en forma de un gel.
NOTA: Una provisión única de los alimentos blandos inmediatamente después de la cirugía es suficiente. - Monitoree el ratón diariamente para la salud y la recuperación adecuada para las primeras 72 h del procedimiento de cirugía. Después, realice imágenes desde tan solo 2 semanas desde la cirugía de implantación de ventanas.
NOTA: Si se hace bien, los ratones se recuperan bien mostrando comportamientos ambulatorios normales, suficiente exploración de jaulas, buena hidratación, aumento de peso estable e interacciones extensas con otros ratones en la jaula y otros artículos en la jaula. Los ratones que muestran letargo, deshidratación y más del 10% de pérdida de peso después de la cirugía son eutanasiados y eliminados del estudio.
4. Mapeo cerebral de dos fotones para imágenes iniciales
- Anestfetizar el ratón (isoflurano, 5 % de inducción y 1,5 % de mantenimiento). Estabilice la cabeza con tornillos para montar la placa frontal en la etapa del microscopio de dos fotones, manteniendo en una placa calefactora a 35 oC. Inyectar por vía intraperitoneal 100 ml de tinte para los vasos sanguíneos como Rhodamine B (2 mg/ml).
NOTA: Las imágenes también se pueden hacer en ratones despiertos sin anestesia. Sin embargo, estudios recientes indican que la anestesia afecta a la dinámica de vigilancia microglial27,28,29 y que la fijación de la cabeza para dos imágenes de fotones en ratones despiertos aumenta el estrés incluso durante la toma de imágenes crónicas durante al menos 25 días (ver Juczewski et al., 2020)30. - Limpie suavemente la superficie de la ventana craneal con un hisopo de algodón en un 70% de etanol. Ponga unas gotas de agua o solución salina en la ventana craneal y baje la lente objetivo en la solución ya que el objetivo es una lente de inmersión.
- Dibuje a mano un mapa grueso para denotar los principales puntos de referencia de los vasos sanguíneos en un cuaderno de laboratorio mientras mira a través del ocular por epiflorescencia. Utilice este dibujo para identificar las regiones específicas durante dos imágenes de fotón. Alternativamente, tome fotos de los vasos sanguíneos ya sea a través de una cámara instalada en el microscopio o a través de una cámara de mano o teléfono.
NOTA: Estas imágenes y imágenes dibujadas a mano son para facilitar la revisión de las mismas regiones anchas bajo el microscopio antes de dos imágenes de fotones. No se trata de una asignación de imágenes precisa. - Bajo dos imágenes de fotones, recoger imágenes de células florescentes y vasos según sea necesario. Tome notas cuidadosas con las coordenadas adecuadas para asegurarse de que las regiones precisas se pueden revisar para la toma de imágenes posteriores. Recopile varios campos de visión en esta sesión inicial de imágenes, por ejemplo, adquiera imágenes de la pila z cada 1-2 m a través de un volumen de tejido.
NOTA: Al recopilar imágenes por dos fotónicos, los puntos de referencia de los vasos sanguíneos se utilizan para el mapeo grueso. Si se necesita una asignación fina, se utilizan dendritas etiquetadas por YFP de ratones Thy1-YFP31.- Utilice estos parámetros recomendados para la toma de imágenes: una longitud de onda de 880-900 nm es óptima; para la excitación GFP y/o dsRed / Rhodamine, se utilizan un espejo dicroico de 565 nm con filtros de emisión de 525/50 nm (canal verde) y 620/60 nm (canal rojo); para la separación de GFP y YFP, se utiliza un espejo dicroico de 509 nm con filtros de emisión de 500/15 y 537/26 nm; el poder en el cerebro se mantiene a 25 mW o menos; La resolución de la imagen es de 1024 x 1024 píxeles, el campo de visión tomado con un objetivo de 25X 0,9 NA a un factor de zoom de 1,5X es de 295,24 x 295,24 m.
- Al final de la toma de imágenes, saque el ratón del escenario, permita que se despierte de la anestesia y regrese a su jaula doméstica hasta una futura sesión de diagnóstico por imágenes.
5. Imágenes de dos fotones y re-imagen
- Para futuras sesiones de diagnóstico por imágenes posteriores, que podrían ser en cualquier lugar de unas pocas horas a meses después de la sesión inicial de imagen, anestesiar el ratón (isoflurano, 5% de inducción y 1,5% de mantenimiento), montar en el microscopio de dos fotones, mantener en una placa de calentamiento e inyectar 100 l de un tinte de los vasos sanguíneos como Rhodamine B (2 mg/ml).
- Abra las imágenes previamente obtenidas en ImageJ y, utilizando estas imágenes, así como las notas de la sesión anterior, identifique las áreas previamente imagen y vuelva a ser cuidadosamentelas.
- Repita esto mientras la ventana de imágenes esté clara o como esencial para la extensión del estudio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Para visualizar la dinámica microglial in vivo, se utilizaron ratones transgénicos dobles transgénicos CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. La línea Thy1-YFP H se utiliza en comparación con la línea Thy1-GFP M para evitar la superposición de florescencia de microglia (GFP) y neuronas (YFP). Los enfoques alternativos podrían utilizar una línea de reportero en la que la microglia se etiqueta con, por ejemplo, tdTomato y luego se puede utilizar la línea Thy1-GFP M. Un inconveniente de la línea H es que YFP etiqueta una gran cantidad de neuronas y la etiqueta aumenta con el aumento de la edad (observación personal). La línea M exhibe un etiquetado escaso de las neuronas. Entre 2 – 4 semanas de la cirugía de implantación de ventanas, la dinámica microglial puede ser seguida por imágenes repetidas. Los vasos sanguíneos grandes se utilizan para localizar regiones específicas y luego las dendritas etiquetadas por YFP se utilizan para el mapeo fino de las regiones cerebrales. Con este enfoque, las dendritas específicas se pueden utilizar como puntos de referencia estables para el mapeo fino de regiones cerebrales (Figura 1, flechas en la Figura 1b). Mientras que las dendritas son estables, algunas microglia se mueven diariamente(Figura 1c).
Además, este enfoque es suficiente para las imágenes longitudinales semanales a largo plazo. Por lo tanto, se utilizaron ratones CX3CR1GFP/+ transgénicos para seguir la microglia junto con inyecciones intraperitoneales de Rhodamine B para etiquetar la vasculatura durante cada sesión de diagnóstico por imágenes durante un máximo de 8 semanas(Figura 2). Alternativamente, como se mencionó anteriormente, los ratones Thy1 podrían ser utilizados para el mapeo fino longitudinal. Cuando se realiza imágenes semanales, la vasculatura se observa que se fija de forma estable, pero se puede ver que la microglia es dinámica como se muestra en tres regiones específicas de interés (ROI, círculos discontinuos) en la Figura 2. En el roi superior, microglia comienza a introducir el ROI en la4a semana de imágenes y continúa a lo largo de la8a semana de imágenes. En el ROI medio con un vaso bifurcado, una célula microgliaal emerge alrededor del vaso inferior en la3a semana, se pierde en la semana6 y otra microglia emerge en el vaso sanguíneo superior en lasemana 7 y se mantiene en la semana8. Finalmente, en el ROI inferior, una célula microglial se mantuvo durante la semana6 y se perdió en lassemanas 7 y 8 de la toma de imágenes. Estos resultados indican cambios dinámicos en la red posicional microglial durante semanas o meses.
Este enfoque también se puede utilizar para investigar la dinámica celular después de una lesión aguda o durante la progresión patológica de la enfermedad. Se utilizaron ratones CX3CR1GFP/+ transgénicos únicos para seguir microglia junto con inyecciones intraperitoneales de Rhodamine B para etiquetar la vasculatura antes (no se muestran datos) y después de convulsiones graves inducidas por ácido kainico (Figura 3). Después de las convulsiones, la estructura del lecho vascular se mantiene sin perturbaciones excesivas(Figura 3a). Sin embargo, la red celular microglial y el paisaje posicional se cambia transitoriamente (algunas células se "ganan" y otras se "pierden" en el campo de visión) con mayores cambios dentro de 24-48 h de convulsiones que se restablece a la normalidad por 72 h(Figura 3b) como hemos informado previamente32.
Por último, este enfoque también se puede utilizar para investigar interacciones células o comparar dinámicas entre tipos de células neuronales. Doble transgénico CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+ ratones se utilizaron para rastrear microglia y NG2+ células in vivo. Sin etiquetar las células vasculatura, microglia y NG2 (Figura 4a). NG2 es un proteoglicaco que etiqueta tanto los pericitos asociados a los vasos como las células precursoras de oligodendrocitos (OPC)33,,34. Los pericitos suelen tener procesos alargados que siguen a lo largo de la pared vascular (presumidamente identificados con puntas de flecha en la Figura 4a)y OPC suelen mostrar cuerpos celulares más grandes que residen en el parénquima cerebral lejos de la vasculatura (presumidamente identificada con flechas en la Figura 4a). Para distinguir adecuadamente pericitos y OPC, la vasculatura está etiquetada con Rhodamine B. La florescencia más brillante de las células asociadas a NG2+-vessel (pericitos, puntas de flecha) se puede distinguir de la más débil florescencia de la luminal Rhodamine a pesar de una excitación similar por dos imágenes fotónicas (Figura 4b,c). Las imágenes diarias muestran que los pericitos se colocan de forma estable, mientras que los OPC (asteriscos en la Figura 4b)y la microglia (círculos de la Figura 4b)son dinámicos coherentes con los informes anteriores32,,35,,36.
Figura 1: Imágenes diarias de microglia utilizando mapeo fino con dendritas neuronales en ratones transgénicos dobles CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. (a) Imagen representativa de dos fotones de microglia (verde) y dendritas (roja) de un doble ratón transgénico CX3CR1GFP/+:Thy1YFP. (b-c), Imágenes diarias de la región en caja en (a) que muestran repetidamente dendritas de imagen (flechas en b) y dendritas con microglia (c). Mientras que las estructuras dendríticas eran posicionalmente estables, se observó que algunas microglias se translocaban de su posición original en días posteriores. Dichas células se identificaron con un número (1, 2 o 3). El día anterior, su posición se observó con un asterisco blanco y en un día posterior, su posición se observó con un asterisco amarillo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes semanales a largo plazo de microglia en ratones CX3CR1GFP/+ durante varios meses. (a-h), Imágenes representativas de dos fotones de microglia (verde) de un ratón CX3CR1GFP/+ durante imágenes repetidas utilizando vasculatura agudamente etiquetada (rojo, Rhodamine, 2 mg/ml, i.p.) como punto de referencia grueso para rastrear la red microglial durante un máximo de 8 semanas. La vasculatura fue estructuralmente estable durante el período de diagnóstico por imágenes. Tres pequeñas regiones con la vasculatura (círculos discontinuos) se resaltaron para indicar el movimiento de somata microglial en (dos círculos discontinuos superiores) o fuera de (círculo inferior) esas regiones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Imágenes diarias a largo plazo de microglia en ratones CX3CR1GFP/+ después de convulsiones. (a-b), Imágenes representativas de dos fotones durante la toma de imágenes diarias del mismo campo de visión de una región cerebral específica con microglia (verde) y etiquetado agudo de la vasculatura (rojo, Rhodamine, 2 mg/ml, i.p.). Las imágenes comienzan después de la inducción de convulsiones graves utilizando un agente quimioconvulsivo, ácido kainico. La estructura vascular se mantuvo ya que los segmentos vasculares individuales (flechas) se pueden identificar a través del tiempo (a). Sin embargo, la dinámica de la red microglial se incrementó durante los dos primeros días siguientes a las convulsiones y vuelve a los niveles normales para el tercer día (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Imágenes diarias de microglia y NG2+ células en ratones CX3CR1GFP/+:NG2dsRed/+. (a) Una imagen representativa de dos fotones de microglia (verde) y NG2+ células (rojo) in vivo. La vasculatura sin etiquetar no distingue las células NG2 (pericitos, identificadas presuntivamente con puntas de flecha) y las células NG2 no asociadas con la vasculatura (células precursoras de oligodendrocitos o OPC, identificadas presuntivamente con flechas). (b) Representativas de imágenes de dos fotones de microglia (verde) y NG2+ células (rojo) en días consecutivos de imagen con la vasculatura etiquetada con Rhodamine. Los pericitos (puntas de flecha) son estacionarios mientras que los OPC son dinámicos (asteriscos de blanco a amarillo). Las microglia también son dinámicas (círculos: los círculos discontinuos representan una posición sin microglia y el círculo relleno representa una posición con una microglia correspondiente). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El advenimiento de las imágenes in vivo de dos fotones ha abierto oportunidades para explorar la plétora de interacciones celulares y dinámicas que ocurren en el cerebro sano. Los estudios iniciales se centraron en el uso del enfoque de craneotomía del cráneo abierto para la imagen de las dendritas neuronales por imágenes agudas y crónicas37,,38. Esto también se puede utilizar para dilucidar interacciones neuroinmunes en el cerebro. Este protocolo describe un método para la toma de imágenes fiables de células etiquetadas fluorescentemente (especialmente microglia, la célula inmune residente del cerebro) durante largos períodos de tiempo a corto o largo plazo. El uso de dendritas vasculares y/o etiquetadas fluorescentemente con etiqueta de tinte se detalla para el mapeo grueso o fino de las regiones cerebrales de interés para permitir imágenes repetidas y confiables de las células. Aunque la línea Thy1YFP se sugiere para su uso para el mapeo cerebral fino, enfoques alternativos podrían utilizar otras técnicas o líneas de ratón para el etiquetado de poblaciones neuronales selectas como en la electroporación del útero39,40, inyecciones tempranas de AAV postnatal41 o el uso de ratones TRAP42. Además, aunque la imagen cortical fue el foco de esta discusión, este enfoque se puede adaptar para visualizar las estructuras cerebrales profundas a largo plazo, así43.
Para este protocolo, el procedimiento de cirugía en cada ratón se puede completar en 30-60 min desde el inicio de la anestesia hasta la recuperación de la anestesia. Durante la cirugía, el cráneo se extrae cuidadosamente y se reemplaza con un cubrecubra estéril que se implanta para obtener imágenes a largo plazo después de al menos dos semanas. La mortalidad es extremadamente rara (menos del 5%) en ratones de tipo salvaje, aunque los ratones con problemas de coagulación, como los ratones noqueadores P2Y12R, muestran una mayor mortalidad y fallo de cirugía. En estos ratones, el sangrado puede persistir durante períodos más largos de tiempo y los ratones pueden morir dentro de las primeras 48 h de la craneotomía presumiblemente debido a complicaciones de sangrado interno. Ratones con ventanas implantadas de este protocolo no se han notado para mostrar ningún signo de infección y el protocolo se puede utilizar de forma fiable para generar ventanas claras para imágenes a largo plazo en 50-80% de ratones.
Alternativa al enfoque actual de implantación de ventanas crónicas, el enfoque del cráneo delgado existe para visualizar las células cerebrales en el cerebro intacto repetidamente. Varios estudios han destacado el valor e incluso la prioridad de elección del enfoque del cráneo delgado sobre el enfoque de implantación deventanas 22,,23,,24,,25. La promesa de este enfoque no debe ser ignorada ya que, cuando se hace correctamente, contrarresta varias limitaciones o desventajas destacadas del enfoque actual, incluyendo la falta de activación de las células gliales, la baja rotación de las espinas que es más fisiológica, y la falta de necesidad de utilizar agentes antiinflamatorios que también podrían afectar la fisiología cerebral. Al seleccionar un enfoque para preguntas específicas de investigación, estas serias limitaciones deben ser consideradas antes de elegir el enfoque detallado en este protocolo.
Sin embargo, el atractivo de este enfoque es doble. En primer lugar, el enfoque de implantación de ventana craneal es atractivo debido a la facilidad de dominio de este procedimiento en relación con el procedimiento de cráneo delgado. El adelgazamiento adecuado del cráneo no siempre puede ser dominado por los experimentadores y si no se hace bien puede resultar en la activación glial que limita su atractivo. En segundo lugar, este enfoque de implantación de ventanas craneales proporciona una poderosa claridad de profundidad de las estructuras cerebrales a medida que el cerebro se muestra a través de una ventana ópticamente clara. La ventana disponible para la toma de imágenes también suele ser mucho más grande que la utilizada en el enfoque del cráneo delgado, lo que permite el acceso a un mayor volumen de tejido para su análisis. En tercer lugar, al igual que la claridad de profundidad, este enfoque permite una claridad uniforme a través de la ventana, ya que el cubreobjetos de vidrio es uniformemente delgado y claro. Esto facilita las comparaciones entre sesiones y entre animales. Se requiere una experiencia especial para la técnica del cráneo delgado para asegurar una claridad uniforme a través de la ventana durante sesiones repetidas y entre animales. Por último, este enfoque ofrece mucha flexibilidad en la frecuencia de la toma de imágenes de horas, de días a semanas o meses e incluso años. Para el enfoque de cráneo delgado, se ha sugerido un máximo de cinco repeticiones24.
Las aplicaciones futuras de este enfoque son muchas. En primer lugar, las aplicaciones podrían implicar la elucidación de nuevas interacciones neuro-glio-vasculares en el cerebro tanto en la fisiología normal como en la patología. En segundo lugar, aunque las células residentes se discuten en este procedimiento, el enfoque se puede utilizar para estudiar la dinámica y las interacciones de las células inmunitarias infiltrantes como ocurre, por ejemplo, durante lesiones agudas, infección crónica del cerebro, y / o condiciones neurodegenerativas, siempre y cuando los ratones con las respectivas células etiquetadas fluorescentemente están disponibles. Por último, este enfoque se ha discutido principalmente en el contexto de estudios estructurales de células cerebrales. Sin embargo, con la llegada de imágenes funcionales, porejemplo,utilizando calcio44,45,,46 o técnicas de imagen de voltaje47,48, este enfoque se puede utilizar para imágenes funcionales a lo largo del tiempo en la salud y la enfermedad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Eyo por discutir las ideas presentadas en este manuscrito. Agradecemos al Dr. Justin Rustenhoven del Laboratorio Kipnis de la Universidad de Virginia por el regalo de ratones NG2DsRed 33. Este trabajo es apoyado por la financiación del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares del Instituto Nacional de Salud a la U.B.E (K22 NS104392).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverglass (3mm) | Warner Instruments | 64-0726 | |
| Cyanoacrylate glue (Krazy Glue) | Amazon | https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2 | |
| Demi Ultra LED Curing Light System | Dental Health Products, Inc | 910860-1 | |
| Dental Drill | Osada: www.osadausa.edu | EXL-M40 | |
| Drill Bit | Fine Science Tools | #19008-07 | |
| Eye Ointment | Henry Schien | 1338333 | |
| iBond Total Etch (Primer glue) | Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer) | 66040094 | |
| Rhodamine B | Millipore Sigma | 81-88-9 (R6626) | |
| Tetris Evoflow glue (Final glue) | Top Dent (Ivoclar Vivadent) | #595956 | |
| Wahl Brav Mini+ | Amazon | https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1 |
References
- Engle, S. J., Blaha, L., Kleiman, R. J. Best Practices for Translational Disease Modeling Using Human iPSC-Derived Neurons. Neuron. 100 (4), 783-797 (2018).
- Osaki, T., Shin, Y., Sivathanu, V., Campisi, M., Kamm, R. D. In Vitro Microfluidic Models for Neurodegenerative Disorders. Advanced Healthcare Materials. 7 (2), (2018).
- Croushore, C. A., Sweedler, J. V. Microfluidic systems for studying neurotransmitters and neurotransmission. Lab Chip. 13 (9), 1666-1676 (2013).
- Wu, V. W., Schwartz, J. P. Cell culture models for reactive gliosis: new perspectives. J Neuroscience Research. 51 (6), 675-681 (1998).
- Abbott, N. J. Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. Journal of Anatomy. 200 (6), 629-638 (2002).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Pena, F. Organotypic cultures as tool to test long-term effects of chemicals on the nervous system. Current Medicinal Chemistry. 17 (10), 987-1001 (2010).
- Humpel, C. Organotypic Brain Slice Cultures. Current Protocols in Immunology. 123 (1), 59 (2018).
- Heine, C., Franke, H. Organotypic slice co-culture systems to study axon regeneration in the dopaminergic system ex vivo. Methods in Molecular Biology. 1162, 97-111 (2014).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecualar Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Kerr, J. N., Denk, W. Imaging in vivo: watching the brain in action. Nature Review Neurosciences. 9 (3), 195-205 (2008).
- Akassoglou, K., et al. In Vivo Imaging of CNS Injury and Disease. Journal of Neuroscience. 37 (45), 10808-10816 (2017).
- Tran, C. H., Gordon, G. R. Astrocyte and microvascular imaging in awake animals using two-photon microscopy. Microcirculation. 22 (3), 219-227 (2015).
- Tvrdik, P., Kalani, M. Y. S. In Vivo Imaging of Microglial Calcium Signaling in Brain Inflammation and Injury. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2366 (2017).
- Bennett, F. C., et al. A Combination of Ontogeny and CNS Environment Establishes Microglial Identity. Neuron. 98 (6), 1170-1183 (2018).
- Bohlen, C. J., et al. Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined-Medium Cultures. Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).
- Mueller, K. L., Hines, P. J., Travis, J. Neuroimmunology. Science. 353 (6301), 760-761 (2016).
- Kipnis, J., Filiano, A. J. Neuroimmunology in 2017: The central nervous system: privileged by immune connections. Nature Reviews Immunology. 18 (2), 83-84 (2018).
- Moloney, R. D., Desbonnet, L., Clarke, G., Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome: stress, health and disease. Mammalian Genome. 25 (1-2), 49-74 (2014).
- Skonieczna-Zydecka, K., Marlicz, W., Misera, A., Koulaouzidis, A., Loniewski, I. Microbiome-The Missing Link in the Gut-Brain Axis: Focus on Its Role in Gastrointestinal and Mental Health. Journal of Clinical Medicine. 7 (12), 521 (2018).
- Xu, H. T., Pan, F., Yang, G., Gan, W. B. Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex. Nature Neuroscience. 10 (5), 549-551 (2007).
- Pan, F., Gan, W. B. Two-photon imaging of dendritic spine development in the mouse cortex. Developmental Neurobiology. 68 (6), 771-778 (2008).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Grutzendler, J., Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Gan, W. B. Transcranial two-photon imaging of the living mouse brain. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (9), (2011).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Molecular Cell Biology. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Liu, Y. U., et al. Neuronal network activity controls microglial process surveillance in awake mice via norepinephrine signaling. Nature Neuroscience. 22 (11), 1771-1781 (2019).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Sun, W., et al. In vivo Two-Photon Imaging of Anesthesia-Specific Alterations in Microglial Surveillance and Photodamage-Directed Motility in Mouse Cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421 (2019).
- Juczewski, K., Koussa, J., Kesner, A., Lee, J., Lovinger, D. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method. bioRxiv. , (2020).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
- Eyo, U. B., et al. P2Y12R-Dependent Translocation Mechanisms Gate the Changing Microglial Landscape. Cell Reports. 23 (4), 959-966 (2018).
- Nishiyama, A., Komitova, M., Suzuki, R., Zhu, X. Polydendrocytes (NG2 cells): multifunctional cells with lineage plasticity. Nature Review Neurosciences. 10 (1), 9-22 (2009).
- Zhu, X., Bergles, D. E., Nishiyama, A. NG2 cells generate both oligodendrocytes and gray matter astrocytes. Development. 135 (1), 145-157 (2008).
- Hughes, E. G., Kang, S. H., Fukaya, M., Bergles, D. E. Oligodendrocyte progenitors balance growth with self-repulsion to achieve homeostasis in the adult brain. Nature Neuroscience. 16 (6), 668-676 (2013).
- Berthiaume, A. A., et al. Dynamic Remodeling of Pericytes In Vivo Maintains Capillary Coverage in the Adult Mouse Brain. Cell Reports. 22 (1), 8-16 (2018).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Holtmaat, A. J., et al. Transient and persistent dendritic spines in the neocortex in vivo. Neuron. 45 (2), 279-291 (2005).
- Wang, C., Mei, L. In utero electroporation in mice. Methods in Molecular Biology. 1018, 151-163 (2013).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments. (54), e3024 (2011).
- Chakrabarty, P., et al. Capsid serotype and timing of injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain. PLoS One. 8 (6), 67680 (2013).
- Guenthner, C. J., Miyamichi, K., Yang, H. H., Heller, H. C., Luo, L. Permanent genetic access to transiently active neurons via TRAP: targeted recombination in active populations. Neuron. 78 (5), 773-784 (2013).
- Pilz, G. A., et al. Live imaging of neurogenesis in the adult mouse hippocampus. Science. 359 (6376), 658-662 (2018).
- Wu, J., et al. Kilohertz two-photon fluorescence microscopy imaging of neural activity in vivo. Nature Methods. 17 (3), 287-290 (2020).
- Yang, W., Yuste, R. In vivo imaging of neural activity. Nature Methods. 14 (4), 349-359 (2017).
- Hannan, S., et al. In vivo imaging of deep neural activity from the cortical surface during hippocampal epileptiform events in the rat brain using electrical impedance tomography. Neuroimage. 209, 116525 (2020).
- Kulkarni, R. U., et al. In Vivo Two-Photon Voltage Imaging with Sulfonated Rhodamine Dyes. ACS Central Science. 4 (10), 1371-1378 (2018).
- Chamberland, S., et al. Fast two-photon imaging of subcellular voltage dynamics in neuronal tissue with genetically encoded indicators. Elife. 6, (2017).
