本文介绍了一种结合全骨髓贴壁法与流式细胞术分选的方法，用于分离、培养、分选和鉴定大鼠下颌骨骨髓间充质干细胞。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种高效分离和体外培养下颌骨骨髓间充质干细胞（mBMSCs）的方法，可快速获得大量高质量细胞以满足实验需求。由于mBMSCs具有优异的自我更新能力和多向分化潜能，未来有望作为组织工程细胞广泛应用于颅面疾病治疗及颅颌面组织再生。因此，大量获取mBMSCs具有重要意义。
本研究中，从下颌骨冲洗获取骨髓，并通过全骨髓贴壁培养法分离原代小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）。进一步通过荧光细胞分选技术纯化获得CD29+CD90+CD45−表型的mBMSCs。实验采用纯化后的第二代mBMSCs进行后续研究，该细胞具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能。利用该体外模型，可获得大量具有增殖能力的mBMSCs，有助于研究mBMSCs的生物学特性、对微环境的响应及其他相关应用。
引言
骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一类来源于骨髓的非造血干细胞，具有强大的增殖能力和多向分化潜能1,2,3,4。自发现以来，BMSCs 一直被认为是骨组织工程与再生医学的理想候选细胞。多年来，髂嵴或胫骨、股骨等长骨一直是颅颌面再生研究中最常用的 BMSCs 来源。然而，口腔颌面部的 BMSCs（如下颌骨 BMSCs，mBMSCs）与长骨来源的 BMSCs 存在一些差异，例如胚胎起源和发展模式不同。下颌骨起源于外胚层神经嵴细胞，并经历膜内成骨过程；而中轴骨和附肢骨骼则起源于中胚层，经历软骨内成骨过程。此外，临床观察和动物实验研究持续表明，口腔颌面部 BMSCs 与髂嵴 BMSCs 在功能上存在差异5,6,7,8。已有报道显示，来源于颅颌面骨（如下颌骨、上颌骨和牙槽骨）的 BMSCs 在增殖能力、生命周期和分化潜能方面优于中轴骨和附肢骨骼来源的 BMSCs9。因此，mBMSCs 被认....
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方案
本文中所有动物实验程序均经上海交通大学医学院附属第九人民医院动物护理委员会批准。
1. 准备
- 实验使用两只5周龄的雄性Sprague Dawley大鼠。
- 将所有器械（包括持针器、镊子和剪刀）在高温下灭菌，或浸入75%乙醇中10分钟进行消毒。
注意：乙醇浸泡时间不宜过长，以免造成细胞损伤。 - 提前配制培养基，其成分见表1。按以下说明为每种培养基添加补充成分。
- α-MEM培养基（含10% FBS）的配制：在最低必需培养基α（α-MEM）中加入10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
- 成骨分化培养基的配制：在成骨分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、0.20%抗坏血酸、1% β-甘油磷酸钠和0.01%地塞米松。
- 成骨诱导培养基的配制：将70%的α-MEM培养基（含10% FBS）与30%的成骨分化培养基混合。
- 脂肪分化培养基A的配制：在脂肪分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素、0.20%胰岛素、0.10%异丁基甲基黄嘌呤（IBMX）、0.10%罗格列酮和0.01%地塞米松。
- 脂肪分化培养基B的配制：在脂肪分化基础培养基中加入10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1%青霉素-链霉素和0.20%胰岛素。 ....
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结果
采用本方案，在初次培养后的第3天，大部分细胞已贴壁。通常在额外培养3-4天后，细胞融合度达到70%至80%（图1B）。通过荧光细胞分选，分离出DAPI-CD29+CD90+CD45−的小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）18,22，其在P0代细胞中约占81.1%（图1C）。
将P2代小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）以每孔100个细胞的密度接种于6孔板中培养一周后，观察到大量集落形成单位，表明mBMSCs具有显著的集落形成能力（图1D）。
为评估多向分化能力，将小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）分别接种于12孔板中，并诱导其向成骨、成软骨和成脂.......
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讨论
本方案描述了一种通过结合全骨髓贴壁法和荧光细胞分选技术从大鼠下颌骨体外分离骨髓间充质干细胞（BMSCs）的方法，该方法简单可靠，可获得具有强增殖能力和分化潜能的mBMSCs。该方法可通过流式细胞分选对mBMSCs进行初步纯化，但如果对细胞均一性有更高要求，则可能需要采用更精确的纯化方法。
目前，分离小鼠骨髓间充质干细胞（mBMSCs）主要有四种技术，包括全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、荧光细胞分选法和磁珠激活细胞分选法22。全骨髓贴壁法和密度梯度离心法是最常用且操作简便的方法，可在较短时间内获得mBMSCs，但其主要缺点是所获得的细胞纯度较低。后两种方法可通过免疫学技术分离出高纯度的mBMSCs，但存在成本高、耗时长以及细胞活性受损等不足。本研究结合了全骨髓贴壁法与荧光细胞分选法的优点，以期在较短时间内获得足量且具有增殖能力的mBMSCs。
毫无疑问，本方案中最关键的步骤之一是大鼠下颌骨的解剖，这与中轴骨和附肢骨的解剖有显著不同。要获得完整的样本，必须充分了解大鼠下颌骨的解剖结构。.......
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披露
所有作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢上海第九人民医院数字化口腔医学实验室及颅面畸形研究中心提供的协助。本论文工作受到国家自然科学基金（NSFC）[81570950, 81870740, 81800949]和上海市高峰学科计划 & 高原学科项目，上海精准医学研究院-上海交通大学医学院附属第九人民医院基金 [JC201809]，上海交通大学医学院高水平创新团队激励计划。L.J. 是上海市优秀青年医学人才计划学者 "医学新星人才" 上海交通大学青年发展计划与“陈星”项目
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA(1X) | Gibco | 25200072 | |
| 10 cm 培养皿 | Corning | ||
| acutenaculum | |||
| 成脂分化培养基 | Cyagen Biosciences Inc. | MUBMX-90031 | |
| 阿利新蓝 | 碧云天生物技术 | ||
| 茜素红 | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| 碱性磷酸酶显色试剂盒 | 碧云天生物技术 | C3206 | |
| α-最低必需培养基 | GE Healthcare HyClone 细胞培养 | SH30265.01B | |
| 抗胶原蛋白II兔多克隆抗体 | Abcam | ab34712 | |
| 抗CD16/CD32抗体 | |||
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | 碧云天生物技术 | P0131 | |
| APC标记抗小鼠/大鼠CD29抗体 | biolegend inc | 102215 | |
| 生物安全柜 | Esco | AC2-4S8-CN | |
| CD45单克隆抗体（OX1），PE，eBioscience | Invitrogen | 12-0461-82 | |
| CD90.1（Thy-1.1）单克隆抗体（HIS51），FITC，eBioscience | Invitrogen | 11-0900-85 | |
| 离心机 | cence | L500 | |
| 成软骨分化培养基 | cyagen biosciences inc. | ||
| 共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | LSM880 | |
| Countess II FL 自动细胞计数仪 | Invitrogen | AMQAF1000 | |
| 结晶紫染色液 | 碧云天生物技术 | C0121 | |
| 胎牛血清 | GE Healthcare HyClone 细胞培养 | SH30084.03 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488） | abcam | ab150077 | |
| 培养箱 | Esco | CCL-170B-8 | |
| 倒置显微镜 | olympus | CKX53 | |
| Magzol试剂（Trizol试剂） | Magen | ||
| 微量移液器 | Eppendorf | ||
| 油红O | |||
| 成骨分化培养基 | cyagen biosciences inc. | MUBMX-90021 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| 磷酸盐缓冲液(1X) | Gibco | 20012027 | |
| PrimeScript RT 主混合液 | TakaRa Bio Inc | RR036A | |
| 蛋白酶K | Sigma-Aldrich | P6556 | |
| QuickBlock 封闭缓冲液 | 碧云天生物技术 | P0260 | |
| 剪刀 | |||
| SYBR1 预混液 | TakaRa Bio Inc | ||
| 甲苯胺蓝 | 碧云天生物技术 | ||
| 台盼蓝溶液，0.4% | Gibco | 15250061 |
参考文献
- Jin, C., et al. Stem cell education for medical students at Tongji University: Primary cell culture and directional differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Biochemistry and Molecular Biology Education. 46 (2), 151-154 (2018).
- Chu, D. T., et al.
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重印与许可
