Nach einer Virusinfektion beherbergt die Niere eine relativ große Anzahl von CD8+ T-Zellen und bietet die Möglichkeit, nicht-mukosaleT-RM-Zellen zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von Mausnierenlymphozyten für die Analyse der Durchflusszytometrie.
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Methodenartikel
Isolierung von Maus-Kidney-Resident-CD8+ T-Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Gewebe-Resident Memory T-Zelle (TRM) ist ein schnell wachsendes Feld der immunologischen Forschung. Die Isolierung von T-Zellen aus verschiedenen nicht-lymphoiden Geweben ist einer der wichtigsten Schritte zur Untersuchung von TRMs. Es gibt leichte Unterschiede in den Lymphozyten-Isolationsprotokollen für verschiedene Organe. Die Niere ist ein essentielles nicht-lymphoides Organ mit zahlreichen Immunzellinfiltrationen, insbesondere nach Pathogen-Exposition oder Autoimmunaktivierung. In den letzten Jahren haben mehrere Labore, darunter unsere eigenen, begonnen, nierenansässige CD8+ T-Zellen in verschiedenen physiologischen und pathologischen Umgebungen sowohl in der Maus als auch im Menschen zu charakterisieren. Aufgrund der Fülle von T-Lymphozyten stellt die Niere ein attraktives Modellorgan dar, um TRMs in nicht-mukosen- oder nicht-barrierefreien Geweben zu untersuchen. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das häufig in TRM-orientiertenLabors verwendet wird, um CD8+ T-Zellen von Mausnieren nach einer systemischen Virusinfektion zu isolieren. Kurz gesagt, mit einem akuten lymphatischen Choriomeningitis-Virus (LCMV) Infektionsmodell in C57BL/6 Mäusen, zeigen wir intravaskuläre CD8+ T-Zell-Etikettierung, enzymatische Verdauung, und Dichte Gradient Zentrifugation zu isolieren und anreichern Lymphozyten aus Mausnieren, um Proben bereit für die nachfolgende Durchflusszytometrie-Analyse zu machen.
Einleitung
Gewebe-Resident-Gedächtnis (TRM) T-Zellen stellen eine der am häufigsten vorkommenden T-Zellpopulationen bei erwachsenen menschlichen und infizierten Mäusen dar. TRM-Zellen bieten die erste Linie der Immunabwehr und sind kritisch in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt1,2,3,4,5. Im Vergleich zu zirkulierenden T-Zellen tragenT-RM-Zellen unterschiedliche Oberflächenmarker mit einzigartigen Transkriptionsprogrammen6,<....
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Protokoll
Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom jeweiligen institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung (IACUC) genehmigt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von IACUC UT Health San Antonio genehmigt.
1. Adoptivtransfer von P14-T-Zellen in C57BL/6-Empfänger und LCMV-Infektion
- Verwenden Sie P14-Mäuse im Alter von 6-12 Wochen. Stellen Sie sicher, dass das Geschlecht der spenderischen P14 TCR transgene Maus mit dem Geschlecht von C57BL/6-Empfängermäusen übereinstimmen sollte. Andernfalls führen Zellen wie männliche T-Zellen, die in weibliche Mäuse übertragen werden, in etwa 12 Tagen....
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Ergebnisse
Das hier beschriebene Protokoll ist in einem Flussdiagramm zusammengefasst (Abbildung 1A). An Tag 30 nach der LCMV-Infektion führten wir eine intravaskuläre Kennzeichnung von CD8+ T-Zellen durch. 5 Minuten später wurden beide Nieren des Tieres seziert, gehackt und der Kollagennaseverdauung unterzogen. Lymphozyten wurden durch Percoll-Zentrifugation aus den verdauten Proben weiter gereinigt und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Wie in Abbildung 1B
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Diskussion
Da die gewebespezifische Immunität ein schnell wachsendes Forschungsgebiet ist, deuten anhäufende Beweise darauf hin, dass Immunzellen, insbesondere Lymphozytenpopulation, in fast allen Organen von erwachsenen menschlichen oder infizierten oder immunisierten Mäusen identifiziert werden können. LCMV-Mausinfektionsmodell ist ein etabliertes Modell zur Untersuchung der antigenspezifischen T-Zell-Reaktion, Despezifikum und Speicher-T-Zelldifferenzierung einschließlichT RM-Biologie über mehrere Gewebe hinweg. Hier .......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Angaben.
Danksagungen
Diese Arbeit wird unterstützt durch NIH-Stipendien AI125701 und AI139721, Cancer Research Institute CLIP-Programm und American Cancer Society Grant RSG-18-222-01-LIB an N.Z. Wir danken Karla Gorena und Sebastian Montagnino von Flow Cytometry Facility. Die in der Flow Cytometry Shared Resource Facility generierten Daten wurden vom University of Texas Health Science Center in San Antonio (UTHSCSA), dem NIH/NCI-Stipendium P30 CA054174-20 (Clinical and Translational Research Center [CTRC] at UTHSCSA) und UL1 TR001120 (Clinical and Translational Science Award) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen | Fisherbrand | 05-408-130 | |
| 15 ml konische Röhrchen | Corning | 431470 | |
| 3 ml Spritze | BD | 309657 | |
| 37C Inkubator | VWR | ||
| Biotin a-CD8a Antikörper (Klon 53-6.7) | Tonbo Biosciences | 30-0081-U025 | |
| Kälberserum | GE Gesundheitswesen Leben Sciences | SH30073.03 | |
| Collegenase B | Millipore Sigma | 11088807001 | |
| Einweg-Messpipetten | Fisherbrand | 13-711-9AM | |
| Insulinspritze | BD | 329424 | |
| Mikropräparierfederschere | Roboz Surgical | RS 5692 | |
| Mojosort Maus CD8 Naï ve T Cells Isolation Kit | Biolegend | 480043 | |
| Deckenleuchte | Amazon | B00333PZZG | |
| PBS | |||
| Percoll | GE Healthcare Life Sciences | 17089101 | |
| Wippe | VWR | ||
| RPMI | GE Healthcare Life Sciences | SH30096.01 | |
| Maus aus massivem Messing Suspension | Braintree Scientific, Inc | SAI-MBR | |
| Swing Bucket Zentrifuge mit Kühlschrank | Thermofisher | ||
| Tissue Culture 6-Well-Platte | Corning | 3516 |
Referenzen
- Mueller, S. N., Gebhardt, T., Carbone, F. R., Heath, W. R. Memory T cell subsets, migration patterns, and tissue residence. Annual Review of Immunology. 31, 137-161 (2013).
- Mueller, S. N., Mackay, L. K. Tissue-resident memory T cells: local specialis....
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Nachdrucke und Genehmigungen
