Method Article

Knenotransplantasyon Modelinin KanLarında Dolaşan Domuza Özgü DNA'nın Ölçülmesi

DOI:

10.3791/61579

⸱

September 22nd, 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shenzhen Xenotransplantation Medical Engineering Research and Development Center, Institute of Translational Medicine, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Xianning Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Liver-biotechnology (Shenzhen) Co., Ltd., 4Department of Radiology, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 5Department of Life Sciences, University of Toronto, 6Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplantation, Nanjing Medical University, 7Department of Hepatopancreatobiliary Surgery, Shenzhen University Health Science Center, Shenzhen University School of Medicine, First Affiliated Hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türe özgü astarlar kullanılarak, domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde cpsDNA qPCR ile ölçüldü.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Xenotransplanttransplantorgan yetmezliği tedavisinde uygulanabilir bir yöntemdir. Ancak knenotransplantasyonun immün reddinin nasıl etkin bir şekilde izlenilen bir sorundur. Bu el yazması domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-monkey arter yama transplantasyon modellerinde bağışıklık reddi izlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklar. Dolaşımdaki DNA organ hasarı için potansiyel olarak non-invaziv bir biyobelirteçtir. Bu çalışmada, dolaşımdaki domuza özgü DNA (cpsDNA) kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) tarafından ksenogreft reddi sırasında izlendi. Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur. Türlere özgü astarlar daha sonra domuzdan fareye hücre nakli modellerinde ve domuzdan maymuna arter yama transplantasyonu modellerinde qPCR ile cpsDNA'yı ölçmek için kullanıldı. Bu yöntemin değeri, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için basit, kullanışlı, düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organ yetmezliği ölüm ana nedenlerinden biridir1. Hücre, doku ve organ nakli organ yetmezliği ni tedavi etmenin etkili bir yoludur2. Bununla birlikte, donör organların sıkıntısı bu yöntemin klinik uygulamasınırlar 3,4. Çalışmalar domuz klinik transplantasyon için insan organlarının potansiyel bir kaynak olarak kullanılabilir göstermiştir5,6. Ancak türler arası organ nakli tehlikeli bağışıklık reddi ile karşı karşıya. Bu nedenle knenotransplantasyonun immün reddini izlemek çok önemlidir. Şu anda, immün ret....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Shenzhen Üniversitesi Birinci Bağlı Hastanesi Shenzhen İkinci Halk Hastanesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun ilgili yönergeleri ve yönetmeliklerine uygun olarak yapılmıştır.

1. Tasarım domuz özel astarlar

  1. NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) yazılımını kullanarak, insanların, maymunların veya farelerden farklı olan domuzlara özgü genleri belirlemek için tüm genom BLAST analizini yapın.
  2. Primer 5'in yazılımını kullanarak 19 domuza özgü gene(Tablo 1)göre astar tasarla.

2. Genomik DNA'yı yalıtma

NOT: Genomik DNA (domuz, maymun, gönüllü insan, domuz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, domuza özgü astarlar tasarlanmış, plazmid içeren domuz spesifik DNA parçaları inşa edilmiş ve nicellik için standart eğriler oluşturulmuştur(Şekil 4). 19 astarın tür özellikleri PCR tarafından doğrulandı. Türlere özgü astarlar (astar #4 ve astar #11) daha sonra domuz-fare hücre nakli modelleri ve domuz-to-maymun arter yama transplantasyon modellerinde qPCR ile cpsDNA ölçmek için kullanıldı.

Agarose elektroforezi yukarıdaki örneklerden güçlendirilmiş.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Domuz dolaşan DNA'nın ölçülmesi, ksenotransplantasyonun immün reddini izlemek için uygulanabilir bir yaklaşımı temsil eder. Gadi ve ark.24, akut ret olan hastaların kanında donör kaynaklı dolaşım DNA (ddcfDNA) içeriğinin reddedilmeden hastalarınkinden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu buldular. Bu çalışmalar ddcfDNA'nın organ grefthasarının izlenmesinde ortak bir biyobelirteç olabileceğini düşündürmektedir. Son yıllarda qPCR, basit çalışması, yüksek otomasyon derecesi, yüksek hassasiyet, iyi özgü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar çıkar çatışması bildirmez.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Ar-Ge Programı (2017YFC1103704), Shenzhen Bilim ve Teknoloji Vakfı (JCYJ20170817172116272), Guang'daki Yüksek Düzeyli Hastanelerin İnşaatı Için Özel Fonlar tarafından desteklenmiştir. Dong Eyaleti (2019), Shenzhen Tıp Sanming Projesi (SZSM201412020), Shenzhen Yüksek Düzeyli Tıbbi Disiplin İnşaat Fonu (2016031638), Shenzhen Sağlık ve Aile Planlama Komisyonu Vakfı (SZXJ2017021 , SZXJ2018059).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseBiowest, Barselona, İspanya111860
BamHI-HFNew England Biolabs, Ipswich, Mass, ABDR3136S
1.5 mL mikrosantrifüj tüpüAxygen  Biosciences, Union City, CA, ABDMCT-150-C
0.2 mL PCR tüpüAxygen  Biosciences, Union City, CA, ABDPCR-02-C
C57BL / 6 FarelerGuangdong Eyaleti Tıbbi Hayvan Merkezi,  Çin8 ~ 10 hafta
SantrifüjTermo  Balıkçı  Bilimsel, Waltham, MA, ABDMikro 21R
2-Log DNA MerdiveniNew England Biolabs, Ipswich, Mass, ABDN3200S0.1– 10.0 kb
İşaretleyici I Tiangen, Pekin, ÇinMD101-020.1– 0.6 kb
DNA Mini Sütunu (HiBind DNA Mini Sütunları)Omega Bio-tek, Norcross, GA, ABDDNACOL-01
DNA yükleme tamponuSolarbio, Pekin, ÇinD1010
E.Z.N.A.Plazmid DNA Mini Kiti I ve E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini Kiti IIOmega Bio-tek, Norcross, GA, ABDD6942
D6943
EcoR ITakara  Bio, Shiga, Japonya  1040S
Dişi Bama mini domuzlarBGI Ark Biyoteknoloji, Shenzhen, Çin2 ~ 4 ay
Genomik DNA Ekstraksiyon Kiti?Tiangen, Pekin, ÇinDP304-02
SYBR Yeşil Gerçek Zamanlı PCR Master MixToyobo, Osaka, JaponyaQPK-201
Jel Doc XRBio-Rad, Herkül, ABD
Erkek sinomolgus maymunlarıGuangdong Landau Biyoteknoloji, Guangzhou, Çin8 yıl
Nükleik asit boyası (Gelred)Biotium, Fremont, ABD42003
polimeraz (Premiks Taq)Takara ve nbsp; Bio, Shiga, JaponyaRR901A
pMD19-T plazmidTakara  Bio, Shiga, JaponyaD102A
qPCR makinesiUygulamalı Biyosistemler QSDx, Waltham, ABD
Serum/Dolaşımdaki DNA Ekstraksiyon KitiTiangen, Pekin, ÇinDP339
TAEsangon Biotech, Şangay, ÇinB548101

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buchman, T. Multiple organ failure. Current Opinion In General Surgery. , 26-31 (1993).
  2. Smith, M., Dominguez-Gil, B., Greer, D., Manara, A., Souter, M. Organ donation after circulatory death: current status and future potential. Intensive care medicine. 45 (3), 310-321 (2....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

XenotransplantationCirculating DNAqPCR QuantificationPig Specific DNABlood Sample ProcessingAgarose ElectrophoresisStandard Curve PreparationSpecies Specific PrimersImmune Rejection MonitoringDNA Extraction Kit

Related Articles