Descrevemos aqui um protocolo para caracterizar interações proteína-proteína entre duas proteínas altamente diferentes expressas em Pseudomonas aeruginosa viva usando medidas FLIM-FRET. O protocolo inclui construções de cepas de bactérias, imobilização de bactérias, rotinas de análise de dados de imagem e pós-imagem.
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Artigo de método
Medições FLIM-FRET de Interações proteína-proteína em bactérias vivas.
Neste artigo
Resumo
Resumo
As interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células. A microscopia de imagem por imagem de fluorescência (FLIM) combinada com a transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) fornece informações precisas sobre PPIs em células vivas. A FLIM-FRET baseia-se na medição da decadência ao longo da vida de um doador de FRET em cada pixel da imagem FLIM, fornecendo informações quantitativas e precisas sobre PPIs e suas organizações celulares espaciais. Propomos aqui um protocolo detalhado para as medições FLIM-FRET que aplicamos para monitorar PPIs em Pseudomonas aeruginosa ao vivo no caso particular de duas proteínas interativas expressas com números de cópias altamente diferentes para demonstrar a qualidade e robustez da técnica em revelar características críticas dos PPIs. Este protocolo descreve detalhadamente todas as etapas necessárias para a caracterização do PPI - desde construções mutantes bacterianas até a análise final usando ferramentas recentemente desenvolvidas fornecendo possibilidades avançadas de visualização para uma interpretação direta de dados complexos FLIM-FRET.
Introdução
Interações proteína-proteína (PPIs) controlam vários processos-chave nas células1. Os papéis dos PPIs diferem com base na composição proteica, as afinidades funcionam e locais nas células2. Os PPIs podem ser investigados por meio de diferentes técnicas3. Por exemplo, a co-imunoprecipitação é uma técnica relativamente simples, robusta e barata comumente usada para identificar ou confirmar PPIs. No entanto, estudar PPIs pode ser desafiador quando as proteínas interativas têm baixos níveis de expressão ou quando as interações são transitórias ou relevantes apenas em ambientes específicos. Estudar os ....
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Protocolo
1. Construção plasmid
- Amplificar por dois PCR (PCR1 e 3) as sequências de DNA (usar DNA genômico de P. aeruginosa PAO1) dos 700 pares de base rio acima e rio abaixo das regiões correspondentes ao local de inserção em P. aeruginosa genoma com polimerase de DNA de alta fidelidade. Adicione sites de restrição aos primers em azul e verde e adicione uma sequência sobreposta com mCherry aos primers em vermelho(Figura 2).
- Para PvdA rotulado no C-terminus com eGFP, amplie a região de 700 bp upstream em relação ao códon stop pelos primers em azul, e amplie a região a jusante de 700 bp contendo o códon stop com o....
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Resultados
Funções de distribuição cumulativa empírica (ecdf) das vidas de fluorescência medidas para as diferentes cepas bacterianas são mostradas na Figura 8. Se ocorrer o FRET, os ecdfs são deslocados para as vidas de menor duração(Figura 8A,8B). Note-se que quando a interação das duas proteínas resulta em uma longa distância entre os dois fluoroforos, não pode ocorrer nenhum TRAF(Figura 8C). Essa situação não pode ser dist.......
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Discussão
FLIM-FRET oferece algumas vantagens importantes sobre a imagem FRET baseada em intensidade. Fluorescência vitalícia é um parâmetro intrínseco do fluoróforo. Como consequência, não depende das concentrações locais de fluoroforos nem da intensidade da excitação da luz. A vida útil da fluorescência também é também mal afetada pelo branqueamento fotográfico. É particularmente interessante evidenciar PPIs em células onde concentrações de proteínas locais podem ser altamente heterogêneas em todos os compartimentos ou regiões s.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Reconhecemos o Dr. Ludovic Richert por sua valiosa assistência na aquisição de dados da FLIM e pela manutenção técnica e desenvolvimento da configuração da FLIM. Este trabalho foi financiado por subsídios da Fondation pour la Recherche en Chimie (https://icfrc.fr/). A VN é financiada pela Fondation pour la Recherche Médicale (FRM‐SPF201809006906). A YM agradece ao Institut Universitaire de France (IUF) pelo apoio e pelo tempo adicional para se dedicar à pesquisa. O IJS e a JG reconhecem o Instituto de Entrega de Drogas de Estrasburgo pelo seu apoio financeiro.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Filtro passa-banda de 525/50 nm | F37-516, AHF, Alemanha | ||
| Filtro passa-curta de 680 nm | F75-680, AHF, Alemanha | ||
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| Sulfato de amônio (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| DreamTaq DNA polimerase 5U/μ L | ThermoFisher Scientific | EP0714 | |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | C404010 | |
| Fotodiodo de avalanche acoplado a fibra | SPCM-AQR-14- FC, Perkin Elmer | ||
| Glass covershives (Espessura No. 1.5, 20× | Vidro Knitel | MS0011 | |
| de 20mm Polimerase de DNA de Alta Fidelidade Phusion 2U/μ L | ThermoFisher Scientific | F530S | |
| Caldo de Lisogenia (LB) | Millipore | 1.10285 | |
| Sulfato de Magnésio Heptahidratado (MgSO4 . 7H2O) | Lâminas de microscópio Sigma-Aldrich | 10034-99-8 | |
| (25&vezes; 75mm) | Vidro Knitel | MS0057 | |
| NucleoSpin Gel e PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| NucleoSpin Plasmídeo | Macherey-Nagel | 740588.10 | |
| Fosfato de Potássio Dibásico (K2HPO4) | Sigma-Aldrich | RES20765 | |
| Fosfato de Potássio Monobásico (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sódio Succinato (Dissódico) | Sigma-Aldrich | 14160 | |
| SPCImage, software SPCM | Becker & Alça | ||
| Nunc | 7648-1PAK | ||
| T4 DNA ligase 1U/μ L | ThermoFisher Scientific | 15224017 | |
| módulo TCSPC | SPC830, Becker & Hickl, Alemanha | ||
| Ti: Insight DeepSee do laser da safira | |||
| dos | espectros |
Referências
- Braun, P., Gingras, A. C. History of protein-protein interactions: From egg-white to complex networks. Proteomics. 12, 1478-1498 (2012).
- Nooren, I. M. A., Thornton, J. M. Structural characterisation and functional significance of....
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Reimpressões e permissões
