Bu protokol, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaraların nasıl üretileceğin ve yaraların morfometrik analiziçin nasıl izlendiğini, hasat edilip hazırlanacağını açıklar. Morfometrik kusurları tanımlamak, tam olarak ölçmek ve tespit etmek için seri histolojik bölümlerin nasıl kullanılacağına iliş bir açıklama dahildir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murine Eksizyonel Yara İyileştirme Modeli ve Histolojik Morfometrik Yara Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Murine eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin ardışık olarak örtüşen evrelerinin her birini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır: inflamasyon, proliferasyon ve remodeling. Mürin yaraları, iyileşme sürecinin bu farklı evrelerinin ölçülebilir olduğu histolojik olarak iyi tanımlanmış ve kolayca tanınabilir bir yara yatağına sahiptir. Alan içinde histolojik analizler için yaranın keyfi olarak tanımlanmış bir "orta" kullanmak yaygındır. Ancak, yaralar üç boyutlu bir varlıktır ve genellikle histolojik olarak simetrik değildir, küçük bir etki boyutuile morfometrik kusurları tespit etmek için iyi tanımlanmış ve sağlam bir nicel yöntem ihtiyacını destekler. Bu protokolde, farelerde ikili, tam kalınlıkta eksizyonel yaralar oluşturma prosedürünün yanı sıra belirli seri bölümlerde bir görüntü işleme programı kullanılarak morfometrik parametrelerin nasıl ölçülmeye cerenebilir ayrıntılı bir talimatı açıklanmıştır. Yara uzunluğu, epidermal uzunluk, epidermal alan ve yara alanının iki boyutlu ölçümleri, yarayı kaplayan üç boyutlu epidermal alanı, genel yara alanı, epidermal hacim ve yara hacmini tahmin etmek için kesitler arasındaki bilinen uzaklıkla birlikte kullanılır. Bu ayrıntılı histolojik analiz konvansiyonel analizlere göre daha fazla zaman ve kaynak tüketen olmasına rağmen, titizliği doğal olarak karmaşık bir yara iyileşme sürecinde yeni fenotipleri tespit etme olasılığını artırır.
Giriş
Kutanöz yara iyileşmesi sırayla örtüşen aşamaları ile karmaşık bir biyolojik süreçtir. Hasarlı epitelin bariyer işlevini geri getirmek için zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş hücresel ve moleküler süreçlerin koordinasyonunu gerektirir. İlk aşamada, inflamasyon, nötrofiller ve makrofajlar yaraya göç, lokal ve sistemik savunma seferber1. İnflamatuar evrenin takibi ve üst üste bindirilen proliferasyon aşamasıdır. Fibroblastlar hızla çoğalmaya ve granülasyon dokusuna göç etmeye başlar. Önden uzak keratinositler, öndeki kenardaki farklılaştırılmış keratinositler yarayı yeniden epitelize etmek için göç ederken yaraya doğru çoğalır
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlanmıştır ve Iowa Üniversitesi'nin politika ve prosedürleri Iowa IACUC Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvanlar ve hayvancılık
- Saç folikülü evresi telogen olduğunda 8-10 yaş arasında istenilen fare hattının yetişkin fareler kullanın.
- Ameliyat günü, temiz kafesler halinde fareler ayrı ve ayrı ayrı ev yara bozulmasını en aza indirmek için.
2. Cerrahi
NOT: Steril cerrahi koşulların sürdürülmesi gereksizdir. Hayvanlar arasında kısırlığı korumaya özen gösterilmesi gerekirken, yumruğun kendisi temiz ama s....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 5, birden fazla cerrah tarafından farklı fare suşlarında üretilen ve farklı bireyler tarafından analiz edilen yabani tip yaralar üzerinde morfometrik analiz ler yaparak elde edilen ölçülen ve hesaplanan değerlerdeki aralığı gösterir. Farklı suşlardan gelen yabani fareler hem çalışmalarımızda hem de literatürde açıklandığı gibi istatistiksel farklılıklar gösterebilir9,10. Bu temsili sonuçlara dayanarak, bir çalışmada, sadece bir.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İki taraflı eksizyonel yara modeli, yara iyileşmesinin birçok farklı yönünü incelemek için kullanılabilecek son derece özelleştirilebilir bir işlemdir. Bir yara iyileştirme projesi başlamadan önce, araştırmacılar belirli bir etki boyutu nda bir kusur tespit etmek için gerekli yaraların sayısını belirlemek için bir güç analizi yapmak gerekir. Literatürde tek tek farelerin veya yaraların biyolojik kopya olarak kullanılıp kullanılmadığı konusunda tutarsızlıklar mevcut, ancak yeni yapılan bir çalışma, tek bir hayvanda buluna.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.
Teşekkürler
Dunnwald Laboratuarı'nın yıllar boyunca bu protokolün optimizasyonuna katkıda bulunan tüm üyelerine ve yara analizi için seri kesit kullanımını teşvik etmedeki ısrarı yaratılmasını mümkün kılan Gina Schatteman'a minnettarız. Bu çalışma NIH/NIAMS'tan Martine Dunnwald'a (AR067739) yapılan fonla desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| %100 etanol | |||
| %70 etanol | |||
| %80 etanol | |||
| %95 etanol | |||
| Alkol Hazırlama | NOVAPLUS | V9100 | %70 İzopropil alkol, steril |
| Amonyum hidroksit | |||
| Biyopsi pedleri | Hücre yolu | 22-222-012 | |
| Siyah plastik levha | Bir kağıt yaprağının boyutu hakkında sağlam ancak manipüle edilebilir bir şey | ||
| Brightfield mikroskobu | Dijital alım yetenekleri ve 4X objektif ile | ||
| Pamuk uçlu aplikatörler | |||
| Lameller | 22 x 60 # 1 | ||
| Dijital kamera | Varsa ölçek için bir cetvel ekleyin | ||
| Diseksiyon alay iğnesi (düz) | |||
| Gömme kalıpları | 22 x 22 x 12 | ||
| Gömme halkaları | Simport Scientific Inc. | M460 | |
| Eosin Y Buzlu | |||
| asetik asit | |||
| Saç kesme makinesi | |||
| Isıtma yastığı | Conair | Nemli kuru Isıtma Yastığı | |
| Hematoksilen | |||
| Mikrotom Mikrotom | |||
| bıçakları | |||
| Boya fırçaları | |||
| Parafin Tip 6 | |||
| Paraformaldehit | |||
| Permount | |||
| Fosfat tampon çözeltisi (PBS) | |||
| Povidon-iyot | Aplicare | 82-255 | |
| İşleme kaseti | Simport Scientific Inc. | M490-2 | |
| Tıraş bıçakları | ASR.009 | ||
| Neşter bıçakları #10 | |||
| Neşter sapı | |||
| Ameliyat için steril | cerrahi makas | ||
| Cilt biyopsisi yumrukları | Araştırmacı tarafından belirlenen boyut | ||
| Slayt kutuları | |||
| Slayt ısıtıcıları | |||
| Süper buzlu mikroskop slaytları | Fisher Scientific | 22 037 246 | |
| Sıcaklık kontrollü su banyosu | |||
| Doku gömme istasyonu | Minimum parafin dağıtıcısı ve soğuk plaka | ||
| Doku işlemcisi | Minimum vakum pompalı fırın | ||
| Üçlü antibiyotik oftalmik merhem | |||
| cımbız, cerrahi cımbız için kavisli uç | steril | ||
| ameliyat için | konik uç | ||
| WypAll X60 | Kimberly-Clark | 34865 |
Kaynaklar
- Eming, S. A., Martin, P., Tomic-Canic, M. Wound repair and regeneration: mechanisms, signaling, and translation. Science Translational Medicine. 6 (265), (2014).
- Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
