Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61671
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 2, 3,4
1Department of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 2Department of Materials Science and Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 3School of Mechanical Engineering, Faculty of Engineering, Tel-Aviv University, 4Center for the Physics and Chemistry of Living Systems, Tel-Aviv University

Summary

De gepresenteerde methode omvat het uniaxiaal uitrekken van 3D zachte hydrogels ingebed in siliconenrubber terwijl live confocale microscopie mogelijk is. Karakterisering van de externe en interne hydrogelstammen en vezeluitlijning worden gedemonstreerd. Het ontwikkelde apparaat en protocol kunnen de reactie van cellen op verschillende stamregimes beoordelen.

Abstract

Externe krachten zijn een belangrijke factor bij weefselvorming, ontwikkeling en onderhoud. De effecten van deze krachten worden vaak bestudeerd met behulp van gespecialiseerde in vitro rekmethoden. Verschillende beschikbare systemen maken gebruik van 2D substraat-gebaseerde brancards, terwijl de toegankelijkheid van 3D-technieken om zachte hydrogels te belasten, beperkter is. Hier beschrijven we een methode die het mogelijk maakt om zachte hydrogels van hun omtrek extern uit te rekken, met behulp van een elastische siliconenstrip als monsterdrager. Het stretching-systeem dat in dit protocol wordt gebruikt, is opgebouwd uit 3D-geprinte onderdelen en goedkope elektronica, waardoor het eenvoudig en gemakkelijk te repliceren is in andere laboratoria. Het experimentele proces begint met het polymeriseren van dikke (>100 μm) zachte fibrine hydrogels (Elastische Modulus van ~100 Pa) in een uitsparing in het midden van een siliconenstrip. Siliconengelconstructies worden vervolgens aan het bedrukte rekapparaat bevestigd en op het confocale microscoopstadium geplaatst. Onder live microscopie wordt het rekapparaat geactiveerd en worden de gels op verschillende rekgroottes afgebeeld. Beeldverwerking wordt vervolgens gebruikt om de resulterende gelvervormingen te kwantificeren, waarbij relatief homogene stammen en vezeluitlijning worden aangetoond over de 3D-dikte van de gel(Z-as). Voordelen van deze methode zijn onder meer de mogelijkheid om extreem zachte hydrogels in 3D te belasten tijdens het uitvoeren van in situ microscopie, en de vrijheid om de geometrie en grootte van het monster te manipuleren volgens de behoeften van de gebruiker. Bovendien kan deze methode met de juiste aanpassing worden gebruikt om andere soorten hydrogels (bijv. collageen, polyacrylamide of polyethyleenglycol) uit te rekken en kan het mogelijk zijn om cellen en weefselrespons op externe krachten te analyseren onder meer biomimetische 3D-omstandigheden.

Introduction

Weefselrespons op mechanische krachten is een integraal onderdeel van een breed scala aan biologische functies, waaronder genexpressie1, celdifferentiatie2en weefselremodellering3. Bovendien kunnen door kracht geïnduceerde veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) zoals vezeluitlijning en verdichting het celgedrag en weefselvormingbeïnvloeden 4,5,6. De vezelige meshstructuur van het ECM heeft intrigerende mechanische eigenschappen, zoals niet-lineaire elasticiteit, niet-affine vervorming en plastische vervormingen7,8,9,10,11,12. Deze eigenschappen beïnvloeden hoe cellen en hun omringende micromilieu reageren op externe mechanische krachten13,14. Inzicht in hoe het ECM en weefsels reageren op mechanische krachten zal vooruitgang mogelijk maken op het gebied van weefseltechnologie en in de ontwikkeling van nauwkeurigere computationele en theoretische modellen.

De meest voorkomende methoden om monsters mechanisch uit te rekken, hebben zich gericht op met cellen beladen 2D-substraten om de effecten op celgedrag te onderzoeken. Deze omvatten bijvoorbeeld het toepassen van stam op polydimethylsiloxaan (PDMS) substraten en het analyseren van celheroriëntatiehoeken ten opzichte van de rekrichting15,16,17,18,19. Toch zijn methoden die de reactie van 3D-celgeïnteceerde hydrogels op externe stretch onderzoeken, een situatie die weefselmicromilieu nauwer nabootst, beperkter. Vooruitgang in de richting van 3D-rekmethoden is van bijzonder belang omdat cellen zich anders gedragen op 2D-substraten in vergelijking met 3D-matrices20. Deze gedragingen omvatten cellulaire herschikking, eiwitexpressieniveaus en migratiepatronen21,22,23.

Methoden en apparaten die het uitrekken van 3D-monsters mogelijk maken , omvatten zowel in de handel verkrijgbare24,25,26,27,28 als die welke zijn ontwikkeld voor laboratoriumonderzoek29. Deze methoden gebruiken opgezette siliconen buizen30,multi-well kamers31,klemmen 26,32,bioreactoren11,33,cantilevers34,35,36,en magneten37,38. Sommige technieken genereren stretch die lokaal 3D-hydrogels vervormt, bijvoorbeeld door naalden van twee enkele punten in de gel te trekken5, terwijl andere vervorming van het hele grootste deel van de gel mogelijk maken16. Bovendien richten de meeste van deze systemen zich op de analyse van het spanningsveld in het X-Y-vlak, met beperkte informatie over het spanningsveld in de Z-richting. Bovendien zijn slechts een handvol van deze apparaten in staat tot microscopische beeldvorming in situ. De grootste uitdaging bij in situ high-magnification imaging (bijv. confocale microscoop) is de beperkte werkafstand van enkele honderden micron van de objectieve lens tot het monster. Apparaten die live beeldvorming tijdens stretch mogelijk maken, offeren de uniformiteit van de spanning in de Z-asop of zijn relatief complex en moeilijk te reproduceren in andere laboratoria39,40.

Deze benadering van stretch 3D hydrogels zorgt voor statische of cyclische uniaxiale belasting tijdens live confocale microscopie. Het rekapparaat (aangeduid als 'Smart Cyclic Uniaxial Stretcher – SCyUS') is gemaakt van 3D-geprinte onderdelen en goedkope hardware, waardoor eenvoudige reproductie in andere laboratoria mogelijk is. Aan het apparaat is een in de handel verkrijgbaar siliconenrubber bevestigd met een geometrische uitsparing in het midden. Hydrogelcomponenten worden gepolymeriseerd om de uitsparing te vullen. Tijdens polymerisatie hechten biologische hydrogels, zoals fibrine of collageen, zich van nature aan de binnenwanden van de uitsparing. Met behulp van de SCyUS wordt de siliconenstrip uniaxiaal uitgerekt, waardoor gecontroleerde stammen worden overgebracht naar de ingebedde 3D-hydrogel41.

Dit systeem maakt een unieke combinatie van functies en voordelen mogelijk in vergelijking met andere bestaande methoden. Ten eerste maakt het systeem eenassige rek mogelijk van dikke 3D-zachte hydrogels (>100 μm dik, <1 kPa-stijfheid) uit hun periferie, met Z-homogenevervorming door de hydrogel. Deze hydrogels zijn te zacht om vast te pakken en uitgerekt te worden door conventionele trektechnieken. Ten tweede kan het rekapparaat gemakkelijk worden gerepliceerd in andere laboratoria, omdat 3D-printen direct beschikbaar is voor onderzoekers en de elektronica die in het ontwerp wordt gebruikt goedkoop is. Ten derde, en misschien wel het meest aantrekkelijke kenmerk, kunnen de geometrie en de grootte van de uitsparing in de siliconenstrip gemakkelijk worden gemanipuleerd, waardoor afstembare stamgradiënten en randvoorwaarden mogelijk zijn, evenals het gebruik van een verscheidenheid aan monstervolumes, tot een paar microliters.

Het gepresenteerde protocol bestaat uit het vormen van fibrinegel in schijven met een diameter van ~ 2 mm in 0,5 mm dikke siliconenrubberstrips die worden uitgevoerd door eenassige stretch onder levende confocale microscopie. Het volgende bespreekt in detail de experimentele procedures voor het meten en analyseren van de stammen die werken op de geometrische uitsparing, de interne stammen die in de hydrogel zijn ontwikkeld, evenals de resulterende vezeluitlijning na verschillende rekmanipulaties. Ten slotte wordt de mogelijkheid besproken om cellen in de hydrogel te verankeren en bloot te stellen aan gecontroleerde externe stretch.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Oplossingsvoorbereiding (vooraf uit te voeren)

  1. Fibrinogeen labeling
    OPMERKING: De etiketteerstap is alleen vereist als het analyseren van de vervorming van de fibrinegel gewenst is. Voor cellulaire experimenten is het mogelijk om een niet-gelabelde gel te gebruiken.
    1. Voeg 38 μL 10 mg/ml succinimidylester fluorescerende kleurstof (opgelost in DMSO) toe aan 1,5 ml fibrinogeenoplossing van 15 mg/ml (molaire verhouding van 5:1) in een centrifugebuis van 50 ml en plaats deze gedurende 1 uur op een shaker bij kamertemperatuur. Plaats daarna de buis 3 minuten in de centrifuge op 800 x g (kamertemperatuur).
    2. Filtreer het supernatant van de vorige stap door een ontleedkolom vol met dextrangelhars(Tabel met materialen)om de niet-gereageerde kleurstof te scheiden,42 door deze stappen te volgen.
      1. Was de kolom voor met 25 ml fibrinogeenbuffer.
      2. Injecteer het gelabelde fibrinogeen langzaam vanaf stap 1.1.1 in de kolom en zorg ervoor dat er geen bellen in het filter komen. Gooi de eerste ~ 0,3 ml geëuteerde oplossing (4-6 druppels zwak gekleurde vloeistof) weg. Verzamel vervolgens de volgende 1,0-1,5 ml gezuiverde oplossing (volg het protocol van de fabrikant voor meer specifieke details).
      3. Voltooi het filtratieproces door de resulterende gezuiverde oplossing te steriliseren met behulp van een spuitgestuurd filter (0,22-0,45 μm).
      4. Om de kolom te reinigen en te recyclen, wast u met 20 ml fibrinogeenbuffer en slaat u deze vervolgens op in 25 ml 20% ethanol.
  2. Verdeel na elutie het resulterende gezuiverde gelabelde fibrinogeen in kleine aliquots van ~ 7-50 μL, afhankelijk van het gewenste aantal uitgerekt gels. Bereid voor elke uitgerekte cirkelgel met een diameter van 2 mm ongeveer 3,5 μL fibrinogeen (2,5 μL wordt per gel + 1 μL gebruikt voor pipetfouten).
    1. Bewaar de aliquots in een vriezer van -20 °C. Ze kunnen tot ongeveer een jaar worden gebruikt (het wordt niet aanbevolen om te ontdooien en opnieuw te bevriezen).
    2. Bewaar voor de rest van dit protocol ongeveer 7 μL van het gezuiverde gelabelde fibrinogeen in de koelkast (4 °C) tot stap 4. Dit volume is bedoeld voor het maken van twee uitgerekte gels (2,5 μL is nodig per gel en een extra volume van 1 μL wordt gebruikt om fouten in de monstervoorbereiding te verklaren).
      OPMERKING: Deze filterprocedure verdunt meestal de initiële 15 mg/ml fibrinogeenoplossing tot een eindconcentratie van ongeveer 10 mg/ml. De verdunningsfactor is afhankelijk van het beginvolume en de concentratie van fibrinogeen, zoals gespecificeerd in het protocol van de fabrikant.
  3. Bereid 7 μL trombineoplossing (verdun met trombinebuffer tot 2 eenheden/ml, tafel met materialen)en bewaar in de koelkast (4 °C) tot stap 4. Dit volume is bedoeld om de uitsparingen van twee uitgerekte gels te vullen.
    OPMERKING: Om interne spanningsanalyse uit te voeren, moeten fluorescerende bolvormige kralen met een diameter van 1 μm (gekocht als een suspensie [2% vaste stoffen] in water plus 2 mM NaN3) aan de trombineoplossing worden toegevoegd (een verhouding van 1:25 v/v % van de kraal: trombine wordt aanbevolen voor een doelstelling van 40x). Kralen mogen alleen worden opgenomen wanneer interne spanningsmetingen gewenst zijn, hetzij in aanwezigheid of afwezigheid van cellen.

2. Siliconen strip voorbereiding

  1. Haal het 0,5 mm dikke siliconenrubber op en snijd het in stroken van 15 x80 mm met een gat met een diameter van 2 mm in het midden van de strip (afbeelding 1). Gebruik indien mogelijk een programmeerbare lasersnijder voor hoge precisie. Als er geen programmeerbare machines beschikbaar zijn, is een schaar voldoende om de omtrek van de strip te snijden en is een kleine gatpons voldoende voor de middenuitsparing.
    OPMERKING: Commercieel siliconenrubber wordt meestal gekocht met plasticfolie aan beide zijden. Bewaar indien mogelijk de originele plastic bekleding aan beide zijden van de siliconen. Als u siliconenstrips uit een eerder experiment hergebruikt, behandel ze dan gedurende 0,5 uur met trypsine, week ze 0,2 M NaOH gedurende 0,5 uur en week ze vervolgens gedurende 1 uur in 70% ethanol. Laat ze drogen voor gebruik.
  2. Bereid afdichtingsfolie (hydrofobe) lagen voor met afmetingen van ten minste 20 × 30 mm2, zodat ze breder zijn dan de siliconenstrip en zo een afdichting kunnen vormen over de hele geometrische uitsparing.
  3. Was een schaal van 10 cm met 70% ethanol en veeg en droog vervolgens met niet-pluisbare delicate taakdoekjes (voor zowel steriele als niet-steriele experimenten). Deze stap is belangrijk omdat het de afdichtingsfilmlagen in staat stelt om beter aan de plaat te plakken en de beweging van het monster tijdens het bereidingsproces te beperken.
  4. Plaats de afdichtingsfolielagen in de gewassen schaal van 10 cm, zodat er voldoende ruimte is om twee stroken naast elkaar in elke schaal te plaatsen (afbeelding 2A).
    1. Verwijder de plasticfolie aan één kant van de siliconenstrip en plaats de blootgestelde zijde op de afdichtingsfilmlaag, zodat de uitsparing volledig wordt omgeven door de afdichtingsfilmlaag(afbeelding 2B). Druk vervolgens voorzichtig op de siliconen tegen de afdichtingsfilmlaag om het gebied rond de uitsparing af te dichten met schone gehandschoende vingers.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtzakken tussen de siliconen en de afdichtingsfolie zitten, vooral rond de uitsparing. Doe dit door de onderkant van de schaal te onderzoeken (figuur 2C).

Figure 1
Figuur 1: Hydrogel spannen aanpak. (A) 15 × 80 mm2 siliconenstrip met een uitsparing met een diameter van 2 mm in het midden van de strip (B) Een siliconenstrip met een ronde uitsparing met ingebouwde fibrinegel. Ter illustratie is de uitsparing in de siliconen groter dan in de eigenlijke experimenten (C) Schematisch van de rekbenadering met de siliconenstrip (oranje), cirkelvormige gel (uitsparing in het midden) en stoffen extenders (groen) die de siliconen verbinden met het rekapparaat. Vergroot gebied van de gel duidt op de vervorming van de gel, als reactie op eenassige stretching van de siliconen. Voor de eenvoud wordt de compressie langs de dikte van de gel(Z-as)niet weergegeven in de afbeelding. De figuren 1B & 1C zijn aangepast van Roitblat Riba et al.41Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Voorbeeld van een juiste plaatsing van een siliconenstrip op een afdichtingsfilmlaag voorafgaand aan gelpolymerisatie. (A) Plaatsing van twee afdichtingsfilmlagen in een schaal van 10 cm (B) Plaatsing van siliconenstrips op de afdichtingsfilmlagen (C) Onderaanzicht van de schaal, met de luchtafdichting tussen de siliconen en de afdichtingsfilmlaag. Links: Juiste afdichting van de afdichtingsfilmlaag op de siliconenstrip rond de uitsparing zonder luchtzakken. Rechts: Onjuiste afdichting van de afdichtingsfilmlaag op de siliconenstrip uitsparing met luchtzakken rond de rand van de uitsparing. Dit zal leiden tot het lekken van de hydrogel componenten onder de siliconen. Rode pijl wijst naar een gebied waar een luchtzak werd gevormd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

3. Trombine bereiden met cellen

OPMERKING: Voer deze stap alleen uit als het insluiten van cellen in de hydrogel gewenst is, en onder steriele omstandigheden in een biologische kap (Tabel van materialen).

  1. Sterilisatie: de dag voorafgaand aan het cellulaire experiment, plaats de siliconen strips en afdichtingsfilmlagen 's nachts in 70% ethanol en voer vervolgens 30 minuten UV-sterilisatie uit aan elke kant (als de 10 cm-schalen nog niet steriel zijn, moeten ze ook 30 minuten na een 70% ethanolwas onder UV-licht worden gesteriliseerd). Het UV-systeem dat in het protocol wordt gebruikt, is het systeem dat in de biologische kap is ingebouwd.
    OPMERKING: Als alternatief kan een autoclaafsterilisatiecyclus (140 °C) worden uitgevoerd op de siliconenstrips, omdat deze bestand zijn tegen maximaal 260 °C.
  2. Voer een celtelling uit om de celconcentratie te bepalen en centrifugeer en hang de celkorrel vervolgens opnieuw op met 7 μL trombine (2 eenheden/ml) in een centrifugebuis van 1,5 ml. We raden een celconcentratie van 800 cellen/μL trombine aan. Houd de cellen gekoeld tot gebruik (niet langer dan een half uur om beschadiging van de cellen te voorkomen).

4. Polymerisatie van fibrinegels

  1. Haal de trombine van 2 eenheden/ml & 10 mg/ml gelabelde fibrinogeenoplossingen uit de koelkast (bereid in stap 1) en plaats ze op ijs waar ze toegankelijk zijn.
    OPMERKING: Oplossingen worden koud gehouden voorafgaand aan het mengproces om de polymerisatiereactiekinetiek te vertragen. Dit zorgt voor een homogenere menging van de eiwitten.
  2. Met de schotel(s) (stap 2) onttrekt u 2,5 μL gelabeld fibrinogeen en pipeteert u deze gelijkmatig in de siliconen uitsparing (met de afdichtingsfilmlaag aan de onderkant bevestigd), zodat de gehele omtrek van de uitsparing in contact komt met fibrinogeen. Zorg ervoor dat er zich nergens in de oplossing luchtzakken of bellen vormen, met bijzondere aandacht voor de onderranden van de uitsparing (de interface tussen de afdichtingsfilmlaag en siliconen).
  3. Neem onmiddellijk 2,5 μL trombine (met of zonder cellen/kralen) en pipetteer het direct in de fibrinogeenoplossing in de uitsparing (tot het uiteindelijke volume van 5 μL fibrine). Meng vervolgens snel de twee oplossingen door ze zorgvuldig ~10 keer op en neer te pipetten. Beweeg tijdens het mengproces de punt rond het hele volume om een zo homogeen mogelijke oplossing te creëren.
  4. Voeg een zeer kleine hoeveelheid Fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) [alternatief celmedium voor celexperimenten, Tabel van Materialen] toe langs de rand van elke schaal, zodat de hydrogel niet uitdroogt tijdens het polymerisatieproces. Zorg ervoor dat er geen contact is tussen het PBS/celmedium en de monsters, omdat dit het monster zal beschadigen.
  5. Dek de schaal(en) af en plaats ze gedurende 30 minuten in de incubator op 37 °C.
    OPMERKING: De vereiste incubatietijd is afhankelijk van het volume van de gel. Als grotere volumes worden gebruikt, moet de incubatietijd toenemen.
  6. Haal de schaal(en) uit de incubator en voeg PBS/celmedium toe aan de schaal, onderdompel de hele gel-siliconen constructie.
  7. Til het monster voorzichtig één voor één uit de schaal en zorg ervoor dat de afdichtingsfilmlaag aan de strip blijft hechten. Maak de afdichtingsfilmlaag langzaam los van de siliconen door voorzichtig van het ene uiteinde van de siliconen naar het andere te pealen (figuur 3). Vermijd het trekken van gebieden dicht bij de uitsparing waar stressconcentraties kunnen bestaan (dit is vooral belangrijk voor niet-cirkelvormige geometrieën). Vermijd elk contact met de uitsparing, omdat dit het monster zal beschadigen.
  8. Plaats de strip terug in de schaal met PBS/celmedium zodat de strip in de schaal zweeft. Breng vervolgens de schotel(s) naar een standaard celkweekmicroscoop om de toestand van elk monster kwalitatief te beoordelen. Gels moeten uniform zijn, continu gedurende de uitsparing en er mogen geen bubbels aanwezig zijn. Selecteer de beste monsters voor verdere analyse met figuur 4 als leidraad.

Figure 3
Figuur 3: Juiste verwijdering van de afdichtingsfilmlaag van de onderkant van de siliconenstrip. Het verwijderingsproces moet langzaam worden uitgevoerd, zodat de hydrogel de hechting met de binnenwanden van de uitsparing niet scheurt of breekt. De witte pijl toont de richting van verwijdering. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Microscopische observatie van fibrinegels in de siliconenuitsparing. (A) Twee voorbeelden van een goed gepolymeriseerde fibrinegel. Let op de relatieve homogeniteit van de gel en de volledige hechting aan de randen van de uitsparing (B) Twee voorbeelden van falende polymerisatie van het monster. Boven: Let op de vele bubbels en de aggregaten gevormd aan de linkerkant. Onder: Let op het scheuren van de gel van de uitgesneden randen en de aggregaten in het linkerbenedenhoek van de uitsparing. Schaalbalk = 300 μm Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

5. Monsterbelasting op het SCyUS-apparaat

  1. Vul het bad met PBS/celmedium(afbeelding 5)en plaats de siliconenstrip met de monstergel over de bovenkant zodat de uiteinden aan elke kant van het bad zitten. Het bad is bedoeld om het drogen van de gel te voorkomen. Plaats en draai de klemmen (paars) samen met de stoffen stroken (groen) vast, zodat alle stukken zijn verbonden om één rechte strook te vormen met de uitsparing in het midden (Afbeelding 5).
  2. Haal het SCyUS-apparaat op en bevestig de aluminium vloeistofput en 22 mm x 40 mm rechthoekige glazen afdeklip (nr. 1 of 1.5) (afbeelding 6Aiii). Bevestig de afdekstrip aan de onderkant van de put met afdichtingsmateriaal (bijv. vacuümvet) zodat de put zonder lekkage met vloeistof kan worden gevuld.
    1. Vul de put met ~1-2 ml PBS/celmedium en plaats de strip + stof + gelconstructie (figuur 6B) in het apparaat. Klem de textielstrip (2) in de beugel (1) zodat de uitsparing + gel (5) zich in het midden bevindt zoals afgebeeld, plaats vervolgens voorzichtig het pin-down inzetstuk (4) in het apparaat en vergrendel het op zijn plaats.
    2. Plaats vervolgens de andere stoffen zijde aan de spindel (zonder de servomotor te bevestigen) en vergrendel deze in de spindel (afbeelding 6C).
  3. Plaats het SCyUS-apparaat met het bijgevoegde monster in het stadium van de microscoop (figuur 6C). Sluit de microcontroller (Table of Materials) aan op de computer via een USB-kabel en sluit de servomotor aan op de microcontroller. Open de SCyUS-besturingsmodule op de computer. Het monster is nu klaar voor beeldvorming om de geschiktheid van de dikte en vezelhomogeniteit van de gel onder de confocale microscoop te controleren.

Figure 5
Figuur 5: (A) Jig met een PBS-bad (3D-geprint) (B) Stripplaatsing op de mal om een goede in-line bevestiging van beugels (in paars) te garanderen en uitdroging van de gel te voorkomen. Deze figuur is gewijzigd met toestemming van Roitblat Riba et al.41Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: SCyUS rekapparaat. (A) Verschillende weergaven van een CAD-model van de belangrijkste delen van de SCyUS: spindel aangesloten op de servo (blauw), statisch anker (rood), inzetstuk dat de siliconenstrip naar beneden speldt (paars) en fixers die voorkomen dat de insert opstijgt (geelgroen). Een bovenaanzicht van het systeem (Ai), een gesneden weergave van het systeem (Aii) met het pad van de strip (oranje lijn), en een onderaanzicht(Aiii)van de aluminium vloeistofput met een glazen afdeklip. De vloeistofput kan op en neer worden bewogen met de draai van een schroef die in de hoofddraad is gemonteerd. De opwaartse beweging van de aluminium put wordt beperkt door de zijvleugels van de paarse wisselplaat, zoals blijkt uit de witte pijlen (B) Het eigenlijke systeem: (1) statisch anker (2) groene niet-rekbare stof (3) schroef voor aluminium vloeistofput hoogteregeling (4) rode pin-down insert (5) een siliconen strip met een cirkelvormige uitsparing (6) blauwe verbindingsklemmen (C) Het reksysteem geplaatst op een confocale microscoop. De servomotor en de spindel worden met pijlen weergegeven. Deze figuur is gewijzigd met toestemming van Roitblat Riba et al.41Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Zorg voor voldoende gel voor bemonstering

  1. Met behulp van de confocale microscoop(Tabel van materialen)neem een lage vergroting (10×), lage resolutie (~ 1,4 μm x 1,4 μm pixelgrootte) confocale Z-stack (≤10 Z-plakjes met een stapgrootte van ongeveer 10 μm is voldoende) tegelbeeld van de hele gel met behulp van lasers van 488/543/561 om de homogeniteit en hechting teonderzoeken. Gebruik deze Z-stackafbeelding als kaart voor de volgende stappen.
  2. Scan met behulp van live beeldvorming met lage resolutie de gel en bepaal de laagste Z-positiewaar volledige hechting aan de binnenwanden van de uitsparing zichtbaar is zonder scheuren of bellen en let op de Z-locatievan de microscoop (Zl). Om de volledige hechting van de gel op de siliconen gedurende de omtrek te bepalen, scant u de interface van het fluorescerende label van de gel en de siliconenstrip (donkere achtergrond) onder de microscoop(figuur 7C).
  3. Ga omhoog in de Z-richtingtotdat er geen continuïteit meer is in de gel en noteer de Z-positie(Zu):
  4. Trek de bovengrens (Zu) van de Z-richtingaf van de ondergrens (Zl). Dit is de referentiedikte van het monster (Zo):
    Equation 1
    Als Zo ≥ 100 μm dan wordt de gel als bevredigend beschouwd voor analyse. Merk op dat de dikte van de siliconen uitsparing ongeveer 500 μm is, maar gelpolymerisatie in de uitsparing resulteert meestal in een kleinere geldikte. 100 μm is de minimaal aanbevolen dikte om een stabiel rekproces te garanderen, zonder scheuren of loslating van de gel van de siliconenuitsparing.
    OPMERKING: Op verschillende XY-locaties kan de dikte van de gel variëren. Dit gedeelte van het protocol meet de minimale dikte van de gel, waardoor we de gelkwaliteit kunnen bepalen en aangeven of het voldoende is om uit te rekken. Bovendien biedt het vinden van het midden van de gel een referentiepunt om terug te keren naar post-stretching, statisch of dynamisch.

Figure 7
Figuur 7: Gelhomogeniteit. Tegelbeelden werden vastgelegd en gestikt met behulp van de confocale microscoopsoftware (Tabel van materialen) (A) Een enkel gestikt tegel Z-slice beeld van een fibrinegelmonster met relatief inhomogene vezeldichtheid als gevolg van onjuiste trombine en fibrinogeenmenging prepolymerisatie. Deze gel zal geen betrouwbare analyse (B) Een enkele gestikte tegel Z-slice afbeelding van een fibrine gel monster met relatief homogene vezeldichtheid. Dit is een acceptabele gel voor rekexperimenten. Schaalbalk voor afbeeldingen A & B is 200 μm (C)Zoom in op de interface tussen de fluorescerend gelabelde gel (rood) en de siliconen (zwarte achtergrond). Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

7. SCyUS-operatie, stretching en beeldvorming

  1. Nu is vastgesteld dat het monster van bevredigende kwaliteit is en correct op het SCyUS-apparaat is ingesteld, bepaalt u de voorgespannen positie van het monster. Dit wordt bereikt door live beeldvorming onder de confocale microscoop te gebruiken (vergelijkbaar met stap 6.2).
    1. Zorg ervoor dat de servomotor op zijn nulpositie staat door op de go to zero servo pos knop te klikken (klik op figuur 8A en zorg ervoor dat figuur 8B nul weergeeft) en bevestig deze aan de rekinrichting zoals te zien in figuur 6C.
      OPMERKING: Doe deze stap langzaam en voorzichtig om geen overspanning op het monster te zetten.
    2. Terwijl u het monster in beeld houdt, beweegt u de motor één graad (figuur 8C) tegelijk met de klok mee door op de +1-knop te klikken totdat de rechterkant van de uitsparing wordt waargenomen om te bewegen. Draai vervolgens de beweging (figuur 8D) terug naar de voorlaatste stappositie door op de -1-knop te klikken. Dit controleert of het monster onder minimale spanning staat. Klik op de knop Min Servo positie instellen ( afbeelding8E) om de referentiepositie in te stellen. Het is mogelijk om op elk gewenst moment terug te keren naar de referentiepositie door op de knop Ga naar min Servopositie (Afbeelding 8F) te klikken.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een vergrotingsdoelstelling (≥40×) voor deze stap te gebruiken om fouten te minimaliseren.
    3. Leg een hoge vergroting (40×), hoge resolutie (~ 0,2 μm × pixelgrootte van 0,2 μm) vast, een enkele Z-segment tegelafbeelding van het hele gelgebied. Dit wordt gebruikt als referentieafbeelding voor nabewerkingsanalyse. Het wordt aanbevolen om een enkele Z-sliceafbeelding vast te leggen in het midden van de geldikte (door Zo van Eq. 1te gebruiken), dit zal de terugkeer naar ongeveer dezelfde Z-positiena het uitrekken mogelijk maken. Houd er ook rekening mee dat tegelafbeeldingen met hoge resolutie van het hele gelgebied veel tijd in beslag nemen (~ 20-30 minuten).
    4. Nu is het monster klaar voor statisch uitrekken. Stel de servomotor in op de gewenste rekgrootte door één graad (figuur 8C) tegelijk in de GUI te vooruitgaan (voer dit langzaam uit, ongeveer 1 graad/seconde).
  2. Leg bij elke stretchgrootte waar analyse gewenst is, een enkele Z-slice tegelafbeelding met hoge resolutie van het hele gelgebied vast voor nabewerkingsanalyse. Net als bij stap 6.2, controleer of de gel niet is losgeraakt van de siliconen gedurende de hele omtrek door de interface tussen de gel (rood) en de siliconen (donkere achtergrond) te scannen, op zoek naar veranderingen in de hechting ten opzichte van de vorige rekgrootte.
    OPMERKING: Gebruik tijdens het activeren van de motor live beeldvorming om de gellocatie in X-Y te volgen (met instellingen met lage resolutie en lage vergroting). De gel ervaart een Z-Poisson-effect waarbij de onderkant van de gel stijgt, daarom moet de Z-positievan de microscoop ook worden aangepast aan het geschatte midden van de geldikte voor elke rekgrootte. Dit kan worden bereikt door Zo (Eq. 1) voor elke rekgrootte opnieuw te berekenen. Omdat stretch in de Z-richtingrelatief homogeen is, is het niet van cruciaal belang om de exacte centrumdiepte van de gel te vinden.

Figure 8
Figuur 8: GUI voor de SCyUS-besturingsmodule. (A) Positie van de motor in graden. De waarde varieert van -90° tot 90° (B) 'Set Minimum Servo Position'. Deze knop maakt een vooraf ingestelde minimumpositie mogelijk, voor het instellen van een nieuwe referentiepositie die verschilt van de Zero Servo Position (C) 'Plus 1°' knop beweegt de servomotor een graad met de klok mee (D) 'Minus 1°' knop beweegt de servomotor een graad tegen de klok in (E) 'Ga naar nul positie' knop zet de servomotor positie op 0° ([A] wordt ingesteld op nul) (F) 'Ga naar minimale servo positie' knop beweegt de servomotor. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

8. Nabewerking externe stammetingen

  1. Om de effectieve spanningen van de uitgesneden grenzen te meten, meet u de lengtes van rand tot rand in de rekrichting (X-as) in het midden van de Y-as(figuur 9A).
    1. Upload de pre-stretch afbeelding naar de beeldverwerkingssoftware (ImageJ FIJI43) en meet de grootste afstand van rand tot rand die wordt gedefinieerd als de axiale lengte van het gat ( Equation 8 ) in het midden.
    2. Definieer de grootste afstand van boven naar beneden als de loodrechte afstand ( Equation 6 ).
    3. Herhaal dit proces voor alle stretchintervalafbeeldingen en bereken de axiale ( Equation 7 ) en loodrechte ( Equation 5 ) afstanden van de uitgesneden periferie(figuur 9A, onder) en voer vervolgens de volgende berekeningen uit om de spanningen van de uitgesneden randen te vinden:

Equation 2

Equation 3

Figure 9
Figuur 9: Gelspanningen door externe stretching van de siliconenstrip. (A) X-Y doorsnede van een niet-uitgerekt fibrinegel (boven), en na het aanbrengen van εgat = 64% spanning langs de x-richting (onder). De gel is ingebed met fluorescerende kralen. De relevante lengtes van d en l die worden gebruikt voor de berekening van εgat worden aangegeven in de afbeeldingen (B) Inzoomafbeeldingen van het onderbroken vierkante gebied gemarkeerd in A (C) Illustratie van de stamtypen die in deze studie worden overwogen: εgat is de axiale stam van de uitsparing bij de maximale diameter, en εgel is de axiale stam in het midden van de gel (gemeten door de verzamellocaties van de kraal) (D) Er werd een lineaire relatie gevonden tussen εgat en ε gel in zowel de rode lijn als de εgel. Deze figuur is aangepast met toestemming van Roitblat Riba et al.41Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Vezeloriëntatieanalyse

  1. Gebruik kwantificering van vezeluitlijning om de structurele reactie van de vezelige gel op toenemende magnitudes van stretch te karakteriseren. Upload afbeeldingen met hoge resolutie naar ImageJ FIJI-software (NIH)43 en analyseer vervolgens met behulp van de OrientationJ (EPFL)44-module (Instellingen: Gaussiaans verloop en venster van 3 pixels, afbeelding 10).
    1. Bereken de 2D Nematic Order Parameter (NOP) van het oriëntatie histogram als:45
      Equation 4
      OPMERKING: Een waarde van NOP = 1 geeft een perfecte uitlijning aan langs de axiale richting (hoek nul) en NOP = 0 geeft isotropie aan. De oriëntatiehoek, θ, is de vezelhoek ten opzichte van de spanningsas (x-as) verkregen door beeldanalyse en nauwkeurig gedefinieerd in de OrientationJ-documentatie. 44

Figure 10
Figuur 10: Vezeloriëntatieanalyse met FIJI ImageJ-software. (A) Hoofdmenu van ImageJ met een pijl die de locatie aangeeft van het keuzemenu 'Plug-ins' waar 'OrientationJ' te vinden is. Klik onder het uitgebreide menu van 'OrientationJ' op de optie 'OrientationJ Distribution' (B) OrientationJ's Distribution module. Stel 'Lokaal venster σ' in op 3 pixels en 'Verloop' op 'Gaussiaans'. Druk vervolgens op de 'Run'-knop (rode pijl). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

10. Handmatige interne gelstamanalyse

  1. Terwijl u live high-magnification imaging van een hydrogel met ingebedde kralen uitvoert, lokaliseert u handmatig een regio van belang (ROI) met gemakkelijk herkenbare kenmerken (bijv. aggregaten van kralen), om na elke rekgrootte terug te keren naar dezelfde locatie.
    OPMERKING: Compressie in de Z-richting (Poisson-effect) kan leiden tot een toename van de kraaldichtheid naarmate de rek toeneemt, daarom raden we aan om kraalaggregaten te kiezen die groot genoeg zijn, zodat ze duidelijk identificeerbaar zijn. Dit protocol vereist de analyse van de centrale regio van de fibrinegel, hoewel elke regio kan worden gekozen.
  2. Leg in de pre-stretch positie (stap 6) een Z-stackafbeelding met hoge resolutie vast van de geselecteerde ROI. Na elk gewenst stretchinterval keert u terug naar dezelfde ROI en herhaalt u het proces voor het vastleggen van afbeeldingen.
  3. Neem de afbeeldingen en importeer ze in ImageJ. Noteer in de ROI de X-Y pixellocatie van elk zichtbaar kralenaggregaat. Breng de opgenomen gegevens over naar een spreadsheet.
  4. Meet de afstanden tussen elk paar aggregaten en vergelijk ze met de afstanden van dezelfde paren in de referentieafbeelding, zodat spanningen in de X- en Y-richtingen kunnen worden berekenen.
    OPMERKING: Als een continue real-time film wordt opgenomen terwijl de gel wordt uitgerekt (in plaats van statische beeldopname), kan een automatische analyse van stammen worden uitgevoerd met digitale beeld- of volumecorrelaties (DIC/DVC) methoden, zoals eerder aangetoond46,47. Opgemerkt moet echter worden dat automatische DIC / DVC-analyse in deze instelling een uitdaging is, omdat de Z-stackniet alleen in het X-Y-vlak beweegt, maar ook in de Z-richtingvanwege het Poisson-effect (compressie), wat aanzienlijke driften tijdens de opgenomen film met zich meedraagt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representatieve gegevens van statische rek van toenemende omvang toegepast op de siliconen strip met een 3D fibrine hydrogel, ingebed met 1 μm fluorescerende kralen, wordt weergegeven in figuur 9. De analyse toont het effect van siliconen stretch op geometrische veranderingen van de cut-out en de ontwikkelde stammen in de gel. Z-stackafbeeldingen van de gehele gel worden gebruikt om de vervorming van de oorspronkelijke cirkelvormige uitsnede van de elliptische geometrie te evalueren (figuur 9A). Deze afbeeldingen worden gebruikt om εxx(gat) (Vergelijking 2) te berekenen. Door in te zoomen en handmatig verschillende kralenaggregaten (figuur 9B) te volgen tijdens het uitrekken van gel, kunnen lokale gelstammen in het midden worden berekenen, in de axiale εxx(gel)en loodrecht εyy(gel) richtingen (Figuur 9C,D). De axiale stammen vermeerderen zich relatief lineair van de siliconen uitgesneden rand tot het midden van de gel en zijn groter dan de drukbestendige loodrechte stammen (figuur 9D).

High-vergroting beelden van de fluorescerend gelabelde gel maakt observatie en kwantificering van vezel uitlijning, geïnduceerd door de siliconen stretch. Figuur 11 toont representatieve inzoombeelden van een typische niet-uitgerekt en relatief isotrope hydrogel (figuur 11A) en een hydrogel onder hoge 80% uitsparingsspanning die sterk uitgelijnde vezels in de rekrichting weergeeft (figuur 11B). Analyse van vezelheroriëntatie met behulp van ImageJ onthulde ongeveer lineaire afhankelijkheid tussen vezeluitlijning (NOP) en de externe belasting op de uitsparing(εgat)tot spanningen van 40%, met matige verzadiging bij spanningen boven 40% (Figuur 11D). Een gedetailleerde analyse van vezeluitlijning in verschillende Z-segmentenis weergegeven in figuur 12. Hier worden histogrammen van vezeluitlijning berekend voor elke Z-slice(figuur 12A),evenals hun overeenkomstige NOP (figuur 12B), en de gemiddelde NOP over alle Z-slicesvoor elke externe belastingsomvang van de cut-out ( Figuur12C). Naarmate εgat toeneemt, neemt de uitlijning van vezels toe, na een algehele niet-lineaire curve zoals weergegeven in figuur 12C. Merk op dat de gel samentrekt langs de Z-asals gevolg van het Poisson-effect, vertegenwoordigd door de kortere lijnen bij hogere stammen in figuur 12B.

Omdat het moeilijk is gebleken om diepgaande analyse van de interne stammen in de hele gel uit te voeren, bieden we hier voorlopige resultaten van eindige element (FE) simulaties uitgevoerd op 2D continu materiaal gezien de mechanische eigenschappen van fibrine (Figuur 13). De externe stam van de uitsparing is ~40% en de kleurenkaart vertegenwoordigt het rek-geïnduceerde spanningsveld. De kleurenkaart varieert van 38%-42%, wat aangeeft dat gelstammen relatief homogeen zijn in het hele cirkelvormige gelgebied. We merken op dat als andere gelgeometrieën worden gebruikt, gradiënten in spanning kunnen ontstaan, en dit is een onderwerp voor toekomstige studies.

Om aan te tonen dat ingebedde fibrinegels hechting aan de siliconenstrip kunnen behouden bij hoge stammen (0 tot +30%) en frequenties (tot 1 Hz), hebben we voorbereidende tests uitgevoerd (protocol voor deze test is niet inbegrepen in dit werk) waaruit blijkt dat de gels niet loskomen van de binnenwanden van de uitsparing. Drie gels werden getest, gel 1 voor een totale duur van ~ 87 minuten, gel 2 voor 60 minuten en gel 3 voor 30 minuten totaal(tabel 1). In alle drie deze gevallen handhaafden fibrinehydrogels hun hechting aan de siliconen.

Figure 11
Figuur 11: Gelvezel uitlijning als reactie op externe stretch. Afbeeldingen genomen in het midden van een fluorescerend gelabelde gel terwijl (A) niet uitgestrekt en (B) na het aanbrengen van εgat= 80% (C) Gemiddeld histogrammen van vezeloriëntaties onder toenemende εgat [%] stammen. Grijze foutbalken geven verschillen aan tussen 40 segmenten in de z-stack die voor elke geteste stam (D) Averaged Nematic Order Parameter (NOP) worden beoordeeld als functie van εgat voor drie verschillende gelmonsters (waaronder "Gel 1" die wordt geanalyseerd in figuur 11A-C). Foutbalken geven verschillen aan tussen segmenten in de Z-stackvan elke rekgrootte. Deze figuur is aangepast met toestemming van Roitblat Riba et al.41Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 12
Figuur 12: Analyse van vezeloriëntatie met behulp van de OrientationJ44-tool (ImageJ-software)43 (A) 3D-histogrammen van vezeloriëntatie voor verschillende Z-segmenten. Hier worden voorbeelden getoond van twee histogrammen berekend voor uitgerekt(εgat = 17,6%, boven) en niet-uitgerekt (onderste) gels. Het histogram is zodanig genormaliseerd dat het gebied onder de curve gelijk is aan 1 (B) Resulterende NOP versus Z-diepte; de grafiek toont de berekeningen van NOP van elk histogram als functie van Z-diepte (C) Gemiddelde NOP als functie van εgat. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardafwijking van NOP voor alle Z-segmentenin een afzonderlijke rekgrootte op hetzelfde XY-punt in dezelfde gel. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figure 13
Figuur 13: 2D eindige elementen (FE) simulatie van een uitgerekte gel. Gel wordt uitgerekt(εgat ≈ 40%) door een siliconen drager. Het spanningsveld wordt gepresenteerd met waarden van maximale hoofdspanning waarbij kleine gradiënten worden waargenomen. De cirkel die wordt weergegeven door de stippellijn is de voorgespannen geometrie van het gat, de oorspronkelijke lengte (lo) is de middelste lengte langs de x-as voordat stretch wordt toegepast, en de uitgerekt lengte (l) is de middelste lengte langs de x-as nadat stretch is toegepast. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Gel #1 Dynamische spanningsamplitude (frequentie 1 Hz) Dynamische rekduur (min)
0-37% 0.1
1
5
15
30
0-48% 1
5
30
Totale tijd onder dynamische stretch 87 min
Gel #2 Dynamische spanningsamplitude (frequentie 1 Hz) Dynamische rekduur (min)
0-30% 0
10
20
30
0-50% 30
Totale tijd onder dynamische stretch 60 min
Gel #3 Dynamische spanningsamplitude (frequentie 1 Hz) Dynamische rekduur (min)
0-30% 10
20
30
Totale tijd onder dynamische stretch 30 min

Tabel 1: Representatieve resultaten van dynamische stretch proof of concept. Drie gels werden ingebed in siliconen strips en dynamisch uitgerekt (1 Hz) voor verschillende duur. Stammen varieerden van nul tot verschillende magnitudes boven de 30%. Alle drie de gels hebben met succes hun hechting aan de binnenwanden van de ronde uitsparing van de siliconenstrip behouden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De methode en het protocol die hierin worden gepresenteerd, zijn grotendeels gebaseerd op onze eerdere studie door Roitblat Riba et al.41 We nemen hier het volledige computerondersteunde ontwerp (CAD), Python en microcontrollercodes van het SCyUS-apparaat op.

De belangrijkste voordelen van de gepresenteerde methode ten opzichte van bestaande benaderingen zijn de mogelijkheid om zeer zachte 3D-hydrogels (Elastische Modulus van ~ 100 Pa) uit hun omtrek te belasten, en onder live confocale beeldvorming. Andere methoden zijn meestal beperkt in hun vermogen om spanningsvelden in de Z-asaan te brengen en zijn niet in staat om in situ microscopiebeelden met hoge vergroting te leveren tijdens het uitrekken, meestal vanwege werkafstandsbeperkingen van het monster tot de objectieve lens. De meeste beschikbare systemen zijn gebaseerd op 2D-substraatrekken, die beperkt zijn in het nabootsen van fysiologische weefselomgevingen.

Beperkingen van het systeem omvatten potentiële inconsistente homogeniteit van de vezeldichtheid van de gel postpolymerisatie(figuur 7A),vooral wanneer grote gelvolumes of complexe geometrieën worden gebruikt. Dergelijke niet-homogeniteiten kunnen leiden tot niet-uniforme stammen en vezeluitlijning in de gel. Bovendien kunnen optische beperkingen bij relatief diepe Z-secties(>30 μm) aanleiding geven tot fouten in de analyse van de vezeloriëntatie.

Kritieke stappen in het 3D-rekprotocol zijn onder meer de volgende (i) Zorg ervoor dat monstergels een volledige hechting hebben bereikt op de binnenwanden van de geometrische uitsparing in de siliconen, zonder bellen of scheuren, vooral langs de Z-richting. Volledige hechting en continuïteit van het monster met een dikte van ten minste 100 μm (Eq. 1) is cruciaal om het monster betrouwbaar uit te rekken tot een gewenste stam (ii) Bevestig het monster correct aan het SCyUS-apparaat voordat u het uitrekt. Het is noodzakelijk om de siliconenstrip aan de beugels en niet-elastische stoflengteverlengers te bevestigen met behulp van de 3D-geprinte jig (figuur 5A) en om te valideren dat alle stukken in-line zijn bevestigd, zodat spanning symmetrisch in de gel wordt geïnduceerd. Dit geldt ook voor de juiste belasting van de spindel van het apparaat (figuur 6B-C) (iii) Leg de referentiepositie (pre-stretch) van het monster zorgvuldig vast. Als het referentiebeeld wordt genomen terwijl het monster al onder spanning staat (bijv. door de bevestiging van de servomotor vóór deze stap), zijn alle spanningsmetingen onnauwkeurig.

Mogelijke toekomstige toepassingen en wijzigingen van het gepresenteerde protocol omvatten het volgende:

i) Op de in cellen ingebedde hydrogels kan een cyclisch rekregime worden toegepast. Aangezien dynamische beweging van de motor wordt gecodeerd door de microcontrollersoftware, kan elk cyclisch profiel worden geprogrammeerd, alleen beperkt door de resolutie en de rotatiesnelheid van de motor die in het systeem wordt gebruikt (meer details beschikbaar in Roitblat Riba et al.41). In dit werk hebben we aangetoond dat fibrinegel hechting kan behouden onder dynamische stretch (Tabel 1). Hoewel verdere tests noodzakelijk zijn, zou de toepassing van cyclische belasting inzicht geven in de dynamische respons van de hydrogel en ingebedde cellen.

ii) De geometrie en het volume van de siliconenuitsparing kunnen worden gewijzigd. In het huidige protocol richtten we ons alleen op gels in een cirkelvormige geometrie. Onder dergelijke omstandigheden zijn interne stammen relatief homogeen in de hele gel, zoals voorspeld door onze FE-simulaties (Figuur 13). Als echter andere gelgeometrieën worden overwogen door het uitgesneden gedeelte van de siliconen te wijzigen, zullen gradiënten ontstaan. Een 'diamant'-vormige uitsparing kan bijvoorbeeld leiden tot een gradiënt in de gelstammen als gevolg van een geleidelijke verandering in de beginlengte van de uitsparing langs de rekrichting. Deze methode van gelstamcontrole is bijzonder aantrekkelijk, omdat verschillende gevormde uitsparingen relatief triviaal zijn om te produceren. Bovendien kunnen de dikte en het gebied van de siliconenuitsparing gemakkelijk worden gewijzigd, waardoor aanpassingen in gelvolumes mogelijk zijn, van miniatuurvolumes van een paar microliters tot grotere volumes die verband houden met mm-cm schaalgelgroottes. Bovendien is het mogelijk om meerdere uitsparingen in dezelfde siliconenstrip op te nemen, waardoor meerdere gels tegelijkertijd kunnen worden uitgerekt.

(iii) Cellen kunnen in de hydrogel worden ingebed. Er zijn een paar uitdagingen waarmee rekening moet worden gehouden bij het inbedden van cellen in de uitgerekte hydrogels. De meeste cellen ingebed in 3D-hydrogels brengen aanzienlijke tractiekrachten aan op de matrix en degraderen de matrix in de loop van de tijd. Dit kan resulteren in wereldwijde samentrekking en spijsvertering van de gel, wat kan leiden tot ontkoppeling van de gel van de siliconen uitgesneden binnenwand op langdurige momenten van incubatie. Een mogelijke manier om met deze situatie om te gaan, is door lage celconcentraties te gebruiken en de tijd van cellulaire experimenten te beperken tot een interval dat gelcontractie en afbraak minimaal zijn. We hebben eerder aangetoond dat het cultiveren van fibroblastcellen in de fibrinegel onder statische rek van 10%, over een periode van 5 uur, zonder enig bewijs van gel scheuren of ontkoppeling van de siliconen cut-out41.

iv) Deze opstelling moet ook worden getest met andere soorten hydrogels, met name synthetische, zoals hydrogels op basis van polyacrylamide (PAA) of polyethyleenglycol (PEG), die vaak worden gebruikt voor celkweek. De natuurlijke hechting van deze hydrogels op de siliconenuitsparing moet worden onderzocht en als blijkt dat deze onvoldoende is voor het uitrekken van gel, moeten technieken worden gebruikt om hechting aan te moedigen. Het gebruik van biologische lijmen48,49 of chemische behandelingen50,51,52 op het uitgesneden oppervlak moet worden overwogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets bekend te maken.

Acknowledgments

Sommige figuren hier zijn aangepast met toestemming van het Copyright Clearance Center: Springer Nature, Annals of Biomedical Engineering. Spannen van 3D-hydrogels met uniforme z-asstammen terwijl live microscopiebeeldvorming mogelijk wordt, A. Roitblat Riba, S. Natan, A. Kolel, H. Rushkin, O. Tchaicheeyan, A. Lesman, Copyright© (2019).

https://doi.org/10.1007/s10439-019-02426-7

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose) Biological Industries 01-052-1A Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5 Bar-Naor Ltd. BN72204-30 22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO Sigma-Aldrich Inc. D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Biological Industries 02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human) Omrix Biopharmaceuticals 3902 Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer N/A Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm) Invitrogen F8820 Orange (540/560)
Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber McMaster-Carr 3788T41 580 µm-thick
E = 1.5 Mpa
Poisson Ratio = 0.48
Tensile Strength = 4.8 MPa
Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed) GE Healthcare 17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39 National Institute of Health, Bethesda, MD Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3) Arduino/Adafruit Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge Thermo Scientific 75002470
Parafilm Bemis PM-996
Primovert Light Microscope Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd. 491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks) Dassault Systèmes N/A
SCyUS Code37 N/A N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010 Adafruit 155
SL 16R Centrifuge Thermo Scientific 75004030 For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates Corning 430167
Thrombin buffer N/A Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%) Biological Industries 03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male) N/A N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope Carl Zeiss AG 2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black) Carl Zeiss AG Release Version 14.0.0.0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bleuel, J., Zaucke, V., Bruggemann, G. P., Niehoff, A. Effects of cyclic tensile strain on chondrocyte metabolism: a systematic review. PLoS ONE. 10, 0119816 (2015).
  2. Pennisi, C. P., Olesen, C. G., de Zee, M., Rasmussen, J., Zachar, V. Uniaxial cyclic strain drives assembly and differentiation of skeletal myocytes. Tissue Engineering Part A. 17, 2543-2550 (2011).
  3. Grodzinsky, A. J., Levenston, M. E., Jin, M., Frank, E. H. Cartilage Tissue Remodeling in Response to Mechanical Forces. Annual Review of Biomedical Engineering. 2 (1), 691-713 (2000).
  4. Munster, S., et al. Strain history dependence of the nonlinear stress response of fibrin and collagen networks. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110, 12197-12202 (2013).
  5. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS ONE. 4, 5902 (2009).
  6. Badylak, S. F. The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction. Seminars in Cell & Developmental Biology. 13 (5), 377-383 (2002).
  7. Natan, S., Koren, Y., Shelah, O., Goren, S., Lesman, A. Molecular Biology of the Cell. 31 (14), 1474-1485 (2020).
  8. Ban, E., et al. Mechanisms of Plastic Deformation in Collagen Networks Induced by Cellular Forces. Biophysical Journal. 114 (2), 450-461 (2018).
  9. Kim, J., et al. Stress-induced plasticity of dynamic collagen networks. Nature Communications. 8, 842 (2017).
  10. Storm, C., Pastore, J. J., MacKintosh, F. C., Lubensky, T. C., Janmey, P. A. Nonlinear elasticity in biological gels. Nature. 435, 191-194 (2005).
  11. Wen, Q., Basu, A., Janmey, P. A., Yodh, A. G. Non-affine deformations in polymer hydrogels. Soft Matter. 8, 8039-8049 (2012).
  12. Muiznieks, L. D., Keeley, F. W. Molecular assembly and mechanical properties of the extracellular matrix: A fibrous protein perspective. Biochimica et Biophysica Acta. 1832, 866-875 (2012).
  13. Brown, A. E. X., Litvinov, R. I., Discher, D. E., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Multiscale mechanics of fibrin polymer: gel stretching with protein unfolding and loss of water. Science. 325, 741-744 (2009).
  14. Carroll, S. F., Buckley, C. T., Kelly, D. J. Cyclic tensile strain can play a role in directing both intramembranous and endochondral ossification of mesenchymal stem cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 5, 73 (2017).
  15. Livne, A., Bouchbinder, E., Geiger, B. Cell reorientation under cyclic stretching. Nature Communications. 5, 3938 (2014).
  16. Wang, L., et al. Patterning cellular alignment through stretching hydrogels with programmable strain gradients. ACS Applied Materials & Interfaces. 7, 15088-15097 (2015).
  17. Xu, G. K., Feng, X. Q., Gao, H. Orientations of Cells on Compliant Substrates under Biaxial Stretches: A Theoretical Study. Biophysical Journal. 114 (3), 701-710 (2017).
  18. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2013).
  19. Lu, J., et al. Cell orientation gradients on an inverse opal substrate. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (19), 10091-10095 (2015).
  20. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125, 3015-3024 (2012).
  21. Bono, N., et al. Unraveling the role of mechanical stimulation on smooth muscle cells: a comparative study between 2D and 3D models. Biotechnology and Bioengineering. 113, 2254-2263 (2016).
  22. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).
  23. Riehl, B. D., Park, J. H., Kwon, I. K., Lim, J. Y. Mechanical stretching for tissue engineering: two-dimensional and three-dimensional constructs. Tissue Engineering Part B: Reviews. 18, 288-300 (2012).
  24. Flexcell. Linear Tissue Train Culture Plate. Flexcell. , (2019).
  25. Flexcell. Tissue Train. Flexcell. , (2019).
  26. CellScale. MCT6 Stretcher. CellScale. , (2019).
  27. STREX. STB-150. STREX. , (2019).
  28. STREX. Stretch Chambers. STREX. , (2019).
  29. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab on a Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  30. Weidenhamer, N. K., Tranquillo, R. T. Influence of cyclic mechanical stretch and tissue constraints on cellular and collagen alignment in fibroblast-derived cell sheets. Tissue Engineering Part C: Methods. 19, 386-395 (2013).
  31. Yung, Y. C., Vandenburgh, H., Mooney, D. J. Cellular strain assessment tool (CSAT): precision-controlled cyclic uniaxial tensile loading. Journal of Biomechanics. 42, 178-182 (2009).
  32. Chen, K., et al. Role of boundary conditions in determining cell alignment in response to stretch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 115, 986-991 (2018).
  33. Heher, P., et al. A novel bioreactor for the generation of highly aligned 3D skeletal muscle-like constructs through orientation of fibrin via application of static strain. Acta Biomaterialia. 24, 251-265 (2015).
  34. Foolen, J., Deshpande, V. S., Kanters, F. M. W., Baaijens, F. P. T. The influence of matrix integrity on stress-fiber remodeling in 3D. Biomaterials. 33, 7508-7518 (2012).
  35. Walker, M., Godin, M., Pelling, A. E. A vacuum-actuated microtissue stretcher for long-term exposure to oscillatory strain within a 3D matrix. Biomedical Microdevices. 20, 43 (2018).
  36. Zhao, R. G., Boudou, T., Wang, W. G., Chen, C. S., Reich, D. H. Decoupling cell and matrix mechanics in engineered microtissues using magnetically actuated microcantilevers. Advanced Materials. 25, 1699-1705 (2013).
  37. Li, Y. H., et al. Magnetically actuated cell-laden micro-scale hydrogels for probing strain-induced cell responses in three dimensions. NPG Asia Materials. 8, 238 (2016).
  38. Li, Y. H., et al. An approach to quantifying 3D responses of cells to extreme strain. Scientific Reports. 6, 19550 (2016).
  39. Humphrey, J. D., et al. A theoretically-motivated biaxial tissue culture system with intravital microscopy. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 7, 323-334 (2008).
  40. Niklason, L. E., et al. Enabling tools for engineering collagenous tissues integrating bioreactors, intravital imaging, and biomechanical modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 107, 3335-3339 (2010).
  41. Roitblat Riba, A., et al. Straining 3D hydrogels with uniform z-axis strains while enabling live microscopy imaging. Annals of Biomedical Engineering. , (2019).
  42. Gomez, D., Natan, S., Shokef, Y., Lesman, A. Mechanical interaction between cells facilitates molecular transport. Advanced Biosystems. 3 (12), 1900192 (2019).
  43. Schindelin, J., et al. Fiji: an open- source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  44. EPFL Switzerland. OrientationJ plug in. EPFL Switzerland. , (2019).
  45. Goren, S., Koren, Y., Xu, X., Lesman, A. Elastic anisotropy governs the decay of cell-induced displacements. Biophysical Journal. 118 (5), 1152-1164 (2019).
  46. Notbohm, J., Lesman, A., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Quantifying cell-induced matrix deformation in three dimensions based on imaging matrix fibers. Integrative Biology. 7 (10), 1186-1195 (2015).
  47. Lesman, A., Notbohm, J., Tirrell, D. A., Ravichandran, G. Contractile forces regulate cell division in three-dimensional environments. Journal of Cell Biology. 205 (2), 155-162 (2014).
  48. Cha, C. Y., et al. Tailoring Hydrogel Adhesion to Polydimethylsiloxane Substrates Using Polysaccharide Glue. Angewandte Chemie International Edition. 52, 6949-6952 (2019).
  49. Wirthl, D., et al. Instant tough bonding of hydrogels for soft machines and electronics. Science Advances. 3, (2017).
  50. Juarez-Moreno, J. A., Avila-Ortega, A., Oliva, A. I., Aviles, F., Cauich-Rodriguez, J. V. Effect of wettability and surface roughness on the adhesion properties of collagen on PDMS films treated by capacitively coupled oxygen plasma. Applied Surface Science. 349, 763-773 (2015).
  51. Kim, H. T., Jeong, O. C. PDMS surface modification using atmospheric pressure plasma. Microelectronic Engineering. 88, 2281-2285 (2011).
  52. Prasad, B. R., et al. Controlling cellular activity by manipulating silicone surface roughness. Colloids and Surfaces. 78, 237-242 (2010).

Tags

Bioengineering Hydrogel Extracellulaire matrix Mechanobiologie Celmechanica Mechanische kracht Externe stretching Vezelnetwerk Fiber alignment
Gecontroleerde stam van 3D-hydrogels onder live microscopiebeeldvorming
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, … More

Kolel, A., Roitblat Riba, A., Natan, S., Tchaicheeyan, O., Saias, E., Lesman, A. Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (166), e61671, doi:10.3791/61671 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter