遗传学上易于操作的线虫Caenorhabditis elegans可作为药物发现的简单且低成本的模型。本文描述了一种用于鉴定抑制RAS和EGFR蛋白下游信号传导的抗癌治疗药物的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
表皮生长因子受体（EGFR）及其下游效应分子RAS在细胞质膜上的定位变化与多种疾病（包括癌症）相关。C. elegans作为一种自由生活的线虫，具有进化上保守且功能相似的EGFR-RAS-ERK MAPK信号级联通路，该通路在阴门发育过程中起核心作用。RAS同源基因LET-60和EGFR同源基因LET-23的功能获得性突变可诱导线虫腹侧体壁形成可见的、无功能的异位假阴门。此前研究表明，这些线虫中的多阴门（Muv）表型可被小分子化学物质所抑制。本文介绍了一种基于液体培养体系利用该线虫筛选能够抑制EGFR和RAS蛋白活性的抑制剂的实验方案。通过该检测方法，我们证明R-芬地林（R-fendiline）——一种K-RAS的间接抑制剂——可抑制let-60(n1046)和let-23(sa62)突变线虫所表现出的Muv表型。该检测方法操作简便、成本低廉、建模耗时短，可作为抗癌药物发现的初步筛选平台。
引言
调控生物体内发育事件的细胞通路在所有后生动物中高度保守。其中一个通路是表皮生长因子受体-鼠肉瘤病毒癌基因同源物-细胞外信号调节激酶（EGFR-RAS-ERK）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号级联，该通路在调控细胞增殖、分化、迁移和存活中起关键作用1,2。该信号通路的缺陷可导致病理状态或疾病，例如癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在人类肿瘤中表现出高表达，包括50%的口腔鳞状细胞癌，并促进恶性肿瘤的发展3,4,5。而H-RAS、K-RAS和N-RAS这三种RAS亚型的突变是多种人类癌症中恶性转化的主要驱动因素。在这三种RAS亚型中，K-RAS的致癌突变最为常见6,7,8。EGFR和RAS要发挥功能，必须定位于质膜（PM）。阻止这些分子向质膜的定位可完全抑制该信号通路的生物学活性9,10。因此，抑制这些蛋白向质膜的定位是一种阻断下游....
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方案
1. 线虫生长培养基（NGM）平板的制备
- 在2 L锥形瓶中加入2.5 g蛋白胨和3 g NaCl至970 mL去离子水中，使用磁力搅拌子搅拌内容物。随后向瓶中加入20 g琼脂。将瓶内物质在121 °C、15 lb/in2压力下高压灭菌30分钟。灭菌后，将锥形瓶置于搅拌台上，使培养基冷却至温度达到50 °C。
- 制备NGM平板时，向已冷却的培养基中加入以下试剂：25 mL 1 M磷酸钾缓冲液（pH = 6.0）、1 mL 1 M MgSO4、1 mL 1 M CaCl2、1 mL（5 mg/mL溶于95%乙醇）胆固醇溶液、1 mL（10% v/w溶于乙醇）制霉菌素溶液以及1 mL 25 mg/mL链霉素溶液。
- 在超净工作台内，将冷却后的培养基倒入60 mm × 15 mm无菌培养皿中。让平板静置凝固2小时。这些平板可在4 °C保存1个月。
2. C. elegans 的培养
- 在每个NGM平板的中心位置点加100 μL过夜培养的E. coli OP50，置于超净台中干燥24小时。随后可将平板储存于聚苯乙烯容器中。
注意：E. coli OP50菌种在接种平板前需在37 °C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养。该菌液可在....
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结果
我们首先证明，与DMSO处理的线虫相比，R-fendiline能够抑制let-60(n1046)突变株的多阴门（Muv）表型。实验数据显示，R-fendiline能够以剂量依赖的方式阻断let-60(n1046)突变株的Muv表型（图2A,B）。然而，在lin-1功能缺失突变株中，随着R-fendiline浓度的增加，并未观察到Muv表型的逆转（图2B）。该结果表明，R-fendiline在C. elegans中于RAS水平上阻断了活化的let-60信号通路。类似地，我们观察到，在let-23(sa62)突变株中，经3、10和30 µM R-fendiline处理后，Muv表型相较于DMSO处理组显著减少（图2C,D）。所有实验均采用Student t-检验来确定统计学.......
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讨论
我们所描述的利用线虫筛选EGFR和RAS功能抑制剂的检测方法简单且成本低廉。C. elegans 是一种具有吸引力的药物发现模型，因其生命周期短（在20 °C下为3天）且能够产生大量幼虫，易于在实验室中培养。更重要的是，EGFR-RAS-ERK MAPK信号通路在进化和功能上与哺乳动物高度保守，提供了一个遗传上易于操作的系统，用于分析EGFR和RAS抑制剂的作用效果。此外，线虫透明的身体结构使研究者能够通过微分干涉差（DIC）显微镜和荧光显微镜观察到特定结构以及绿色荧光蛋白（GFP）或其他荧光染料与目标蛋白融合后的定位情况。
本研究中用于繁殖和维持各种C. elegans的实验方案此前已有 established20,21。然而，在制备NG平板时，我们加入了链霉素和制霉菌素，以防止细菌和真菌污染。添加这些抗菌剂并未影响线虫的发育及多阴门表型的诱导。
通过线虫同步化方案获得L1.......
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
我们感谢斯瓦西·阿鲁尔博士（MD Anderson 癌症中心）提供 let-60(n1046)我们还要感谢德克萨斯农工大学大卫·赖纳博士（Dr. David Reiner）&M 健康科学中心生物科学研究所 & Technology 位于休斯顿）的 lin-1 菌株。最后，我们感谢 Danielle Garsin 博士及其团队（德克萨斯大学麦戈文医学院）提供了部分试剂。部分线虫菌株由CGC提供，CGC由美国国立卫生研究院研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。本研究由德克萨斯州癌症预防与研究研究所（CPRIT）资助，项目编号RP200047，授予JF Hancock。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>培养基与化学试剂 | |||
| 琼脂糖 | Millipore Sigma | A9539-50G | |
| Bacto蛋白胨 | Fisher Scientific | DF0118-17-0 | |
| BD Difco 琼脂 | Fisher Scientific | DF0145-17-0 | |
| BD Difco LB 肉汤 | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | |
| 氯化钙 | Fisher Scientific | BP510-500 | |
| 胆固醇 | Fisher Scientific | ICN10138201 | |
| 硫酸镁 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| 制霉菌素 | Acros Organics | AC455500050 | |
| 磷酸氢二钾 | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| 磷酸二氢钾 | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| R-芬地林 | 商业合成（药品级） | ||
| 叠氮化钠 | Millipore Sigma | S2002-25G | |
| 氯化钠 | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| 8.25% 次氯酸钠 | 漂白剂 | ||
| 磷酸氢二钠 | Fisher Scientific | BP332-500 | |
| 硫酸链霉素 | Fisher Scientific | BP910-50 | |
| (−盐酸左旋咪唑 | Millipore Sigma | L9756 | |
| UO126（MEK抑制剂） | 默克生命科学 | 19-147 | |
| <强>耗材 | |||
| 15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | Fisher Scientific | 12-565-269 | |
| 50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管 | Fisher Scientific | 12-565-271 | |
| 一次性聚苯乙烯刻度吸管 10 mL | Fisher Scientific | 07-200-574 | |
| 一次性聚苯乙烯血清移液管 25mL | Fisher Scientific | 07-200-575 | |
| 1.5号 18 mm × 18 mm 盖玻片 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| 带透明盖的培养皿（60 × 15 mm） | Fisher Scientific | FB0875713A | |
| 带透明盖的培养皿（100×15 mm） | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 普通载玻片（75 × 25 mm） | Fisher Scientific | 12-544-4 | |
| 12 孔组织培养板 | Fisher Scientific | 50-197-4804 | |
| <强>软件 | |||
| Prism | Graphpad | ||
| <强>细菌菌株 | |||
| E. coli OP50 | |||
| <强>线虫品系 | |||
| <强>菌株 | <强>基因型 | <强>转基因 | <强>源 |
| MT2124 | let-60(n1046) IV | CGC | |
| MT7567 | lin-1(sy254) IV. | CGC | |
| PS1839 | let-23(sa62) II. | CGC |
参考文献
- Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
- Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H.
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重印与许可
