Los cambios fisiopatológicos en el sistema nervioso autónomo cardíaco, especialmente en su rama simpática, contribuyen al inicio y mantenimiento de las arritmias ventriculares. En el actual protocolo, mostramos cómo caracterizar los ganglios estrellado murine para mejorar la comprensión de los procesos moleculares y celulares subyacentes.
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Artículo de método
Localización, Disección, Y Análisis Del Ganglio Estrellado Murino
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Resumen
Resumen
El sistema nervioso autónomo es un conductor substancial de la electrofisiología cardiaca. Especialmente el papel de su rama comprensiva es una materia en curso de la investigación en la patofisiología de las arritmias ventriculares (VA). Las neuronas en los ganglios estrellados (SG) – estructuras bilaterales en forma de estrella de la cadena simpática – son un componente importante de la infraestructura simpática. Los SG son una blanco reconocida para el tratamiento vía la desnervación comprensiva cardiaca en pacientes con el VA terapia-refractario. Mientras que el remodelado neuronal y la activación glial en el SG se han descrito en pacientes con el VA, los procesos celulares y moleculares subyacentes que potencialmente preceden el inicio de la arritmia se entienden solamente escaso y se deben aclarar para mejorar la modulación autonómica. Los modelos de ratón nos permiten estudiar la remodelación neuronal simpática, pero la identificación del SG murino es un desafío para el investigador inexperto. Así, los estudios biológicos celulares y moleculares profundizados del SG murine están careciendo para muchas enfermedades cardiacas comunes. Aquí, se describe un repertorio básico para la disección y el estudio de la SG en ratones adultos para análisis a nivel de ARN (aislamiento de ARN para análisis de expresión génica, hibridación in situ), nivel de proteína (inmunofluorescente de montaje entero de tinción), y el nivel celular (morfología básica, medición del tamaño celular). Presentamos soluciones potenciales para superar los desafíos en la técnica de preparación, y cómo mejorar la tinción a través del temple de la autofluorescencia. Esto permite la visualización de neuronas, así como células gliales a través de marcadores establecidos con el fin de determinar la composición celular y los procesos de remodelación. Los métodos aquí presentados permiten caracterizar el SG para obtener más información sobre la disfunción autonómica en ratones propensos al VA y pueden complementarse con técnicas adicionales que investigan los componentes neuronales y gliales del sistema nervioso autónomo en el corazón.
Introducción
El sistema nervioso autónomo cardíaco es un equilibrio estrechamente regulado de componentes simpáticos, parasimpáticos y sensoriales que permite al corazón adaptarse a los cambios ambientales con la respuesta fisiológica adecuada1,2. Las alteraciones en este equilibrio, por ejemplo, un aumento de la actividad simpática, se han establecido como un factor clave para la aparición, así como el mantenimiento de las arritmias ventriculares (AV)3,4. Por lo tanto, la modulación autonómica, lograda a través de la reducción farmacológica de la actividad simpáti....
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Protocolo
Todos los procedimientos relacionados con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Estado de Hamburgo (ORG870, 959) y la Agencia Estatal de Renania del Norte-Westfalia para la Naturaleza, el Medio Ambiente y la Protección del Consumidor (LANUV, 07/11) y se ajustan a la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (2011). Los estudios fueron realizados usando los ratones masculinos y femeninos (envejecidos 10-24 semanas) C57BL/6 (número común 000664, laboratorios de Jackson) y los ratones homocigóticos (db/db) o heterozigóticos (db/het; control) para la mutación espontánea de la diabetes (Db....
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Resultados
La Figura 1 visualiza cómo identificar y diseccionar el SG. La Figura 1A muestra un dibujo esquemático de la ubicación, mientras que la Figura 1B presenta la vista hacia el tórax después de la eliminación del paquete corazón-pulmón. Los músculos longus colli izquierdo y derecho medial del SG y la caja torácica son puntos de referencia importantes para la orientación. La disección se realiza a lo largo de las líneas punteadas entre l.......
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Discusión
La comprensión de los procesos celulares y moleculares en neuronas y células gliales del sistema nervioso simpático que preceden a la aparición del AV es de alto interés, ya que la parada cardíaca súbita sigue siendo la causa más común de muerte en todo el mundo5. Por lo tanto, en el manuscrito actual, proporcionamos un repertorio básico de métodos para identificar el SG murino , un elemento murino dentro de esta red , y realizar análisis posteriores a nivel de ARN, proteína y celular.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a Hartwig Wieboldt por su excelente asistencia técnica, y al Centro de Microscopía de Imágenes UKE (Umif) del Centro Médico Universitario Hamburgo-Eppendorf por proporcionar microscopios y apoyo. Esta investigación fue financiada por el DZHK (Centro Alemán de Investigación Cardiovascular) [FKZ 81Z4710141].
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Placa de 96 pocillos | TPP | 92097 | Portaobjetos de |
| adhesión de ARNscope SuperFrost plus 25 x 75 x 1 mm | R. Langenbrinck | 03-0060 | Microscopía |
| Albúmina bovina Fracción V grado receptor lyophil. | Serva | 11924.03 | Tinción de montaje completo |
| bisBenzimida H33342 triclorhidrato (Hoechst) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU | B2261 | Tinción de montaje completo |
| Pollo anti neurofilamento | EMD Millipore | AB5539 | Tinción de montaje completo |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Merck, KGA, Darmstadt, Alemania | D8418 | Tinción de montaje completo |
| Donkey anti pollo IgY Alexa 647 | Merck, KGA, Darmstadt, Alemania | AP194SA6 | Tinción de montaje completo |
| Burro anti cabra IgG Alexa 568 | Thermo Fisher Scientific | A11057 | Tinción de montaje completo |
| Burro anti conejo IgG Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | Tinción de montaje completo |
| Bloque de secado 37-100 mm | Whatman (Sigma Aldrich) | WHA10310992 | Tinción de montaje completo |
| Eosin Y | Sigma Aldrich | E4009 | Tinción de montaje completo |
| Etanol 99 % desnaturalizado con MEK, IPA y Bitrex (min. 99,8 %) | Th.Geyer | 2212.5000 | Tinción de montaje completo Medio de |
| montaje Eukitt | AppliChem | 253681.0008 | Tinción de montaje completo |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | Tinción de montaje completo |
| Fluoromount-G + DAPI | Southern Biotech | 0100-20 | Tinción de montaje entero |
| Acetiltransferasa anti colina de cabra | EMD Millipore | AP144P | Tinción de montaje completo |
| H2O2 30% (p/p) | Merck, KGA, Darmstadt, Alemania | H1009 | Tinción de montaje entero |
| Heparina Sódica 25.000 UI / 5ml | Rotexmedica | PZN: | 3862340 Preparación SG |
| Kit de transctipción inversa de ADNc de alta capacidad | Life technologies | 4368813 | Aislamiento de ARN |
| Isoflurano (Foreno) | Abbott Laboratories | 2594.00.00 | Preparación |
| Solución de hemalum de SG Mayer | Merck | 1.09249.0500 | Tinción de montaje completo |
| Metanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Tinción de montaje completo |
| Cubreobjetos de microscopio de 20x20 mm o menos | Marienfeld | 0101040 | Tinción de montaje completo |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | aislamiento de ARN |
| NanoDrop 2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C Aislamiento de | ARN |
| Opal 570 Paquete de reactivos Opal 570 | Akoya Bioscience | FP1488001KT | RNAscope |
| Paraformaldehído, 16% c/v aq. soln., sin metanol | Alfa Aesar | 43368 | Pipetas Pasteur para tinción de montaje entero |
| , LDPE, no estériles, 3 ml, 154 mm | Th.Geyer | 7691202 | Tinción de montaje completo |
| Comprimidos de solución salina tamponada con fosfato | Gibco | 18912-014 | Pinzette de tinción de montaje entero |
| Pinzette Pinzette SS | FineScienceTools | 11203-25 | Preparación SG |
| QIAzol Reactivo de lisis | Qiagen | 79306 | Aislamiento de ARN |
| Conejo anti tirosina hidroxilasa | EMD Millipore | AB152 | Tinción de montaje completo |
| RNAlater | Merck | R0901-100ML | Aislamiento de ARN (opcional) |
| RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 | biotechne (ACD) | 323100 | RNAscope |
| RNAscope Probe-Mm-S100b-C2 | biotechne (ACD) | 431738-C2 | RNAscope |
| Sonda de ARNsonda mm-Tubb3 | biotechne (ACD) | 423391 | ARNoscopio |
| Perlas de acero inoxidable 7 mm | Qiagen | 69990 | Aislamiento de ARN |
| Negro de Sudán B | Roth | 0292.2 | Tinción de montaje completo |
| Ensayo de expresión génica TaqMan Cdkn1b (Mm00438168_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de expresión génica |
| Ensayo de expresión génica TaqMan Colina acetiltransferasa (Mm01221880_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de |
| expresión génicaEnsayo de expresión génica TaqMan MKi67 (Mm01278617_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de expresión génica |
| Ensayo de expresión génica TaqMan PTPCR (Mm01293577_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de expresión génica |
| Ensayo de expresión génica TaqMan S100b (Mm00485897_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de |
| expresión génicaEnsayo de expresión génica TaqMan Tirosina hidroxilasa (Mm00447557_m1) | Thermo Fisher Scientific | 4331182 | Análisis de expresión génica |
| TaqMan mastermix | Biosistemas aplicados | 4370074 | análisis de expresión génica |
| Tissue Lyser II | Qiagen | 85300 | Aislamiento de ARN |
| Triton X-100 Solución al 10% | Sigma-Aldrich | 93443-100ml | Tinción de montaje completo |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416-100ML | RNAscope |
| Bolígrafo de bambú Wacom Wacom | CTL-460/K Mediciones del tamaño de | la célula | |
| Papel de filtro cualitativo preplilado Whatman, Grado 595 1/2 | Sigma-Aldrich | WHA10311647 | Aglutinina de germen de trigo de tinción de montaje entero |
| , Alexa Fluor 633 Conjugado | Thermo Fisher Scientific | W21404 | RNAscope |
Referencias
- Goldberger, J. J., Arora, R., Buckley, U., Shivkumar, K. Autonomic nervous system dysfunction: JACC focus seminar. Journal of the American College of Cardiology. 73 (10), 1189-1206 (2019).
- Jänig, W. Neurocardiology: a neurobiologist's perspective. The Jo....
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Reimpresiones y permisos
