本方案描述了一种低成本声流控装置的组装与操作方法，该装置通过超声造影剂诱导的声孔效应，实现分子对细胞的快速递送。
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本文内容
摘要
摘要
生物分子的有效细胞内递送对于广泛的生物医学研究和基于细胞的治疗应用至关重要。超声介导的声孔效应是一种新兴的生物分子快速细胞内递送技术。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞的体外声孔处理技术受限于通量低、每个细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本的声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声孔效应。该装置采用标准的光刻技术制备基于PDMS的微流控芯片，将一个超声压电圆盘换能器连接至装置，并由微控制器驱动。整个组件可集成于一个3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞和微泡流经装置。本声流控系统已成功实现了向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与整体处理方法相比，该声流控系统提高了处理通量并降低了实验变异性，有助于改进生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。
引言
病毒性和非病毒性递送平台已被用于增强分子向细胞的递送。病毒递送（转导）是一种常用于需要基因组修饰的细胞治疗中的技术。病毒递送的局限性包括潜在的插入突变、转基因容量有限以及非预期的多重感染1,2。因此，非病毒性分子递送技术正在被开发，以适用于广泛的生物医学和科研应用。常见技术包括机械法、电穿孔法、流体动力法，或利用基于激光的能量来促进生物分子进入细胞 3。电穿孔是一种常用的非病毒性分子递送平台，能够诱导细胞膜产生瞬时穿孔，从而实现分子化合物的胞内递送4,5,6,7,8,9。然而，细胞膜的瞬时穿孔是一个随机过程，通过电穿孔实现的分子摄取通常依赖于分子被动扩散穿过瞬时形成的膜孔4,7,8。....
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方案
根据路易斯维尔大学机构审查委员会批准的方案，从健康献血者采集全血。
1. 制备 的 声流控 设备
- 获取具有同心螺旋结构的光掩模，其中通道直径为 500 µm。补充文件中提供了一个 CAD 文件作为示例。可从商业供应商处订购定制光掩模，或使用掩模写入设备自行制备。
- 使用标准光刻技术在涂有光刻胶的硅片上制备同心螺旋结构的模具。
- 在 100 mm 硅片上加入约 2 汤匙（~30 mL）SU-8 2100。
- 将硅片置于匀胶机上，以 150 rpm 的速度旋转 30 秒以铺展光刻胶，然后将速度提高至 1,200 rpm 持续 60 秒，形成厚度为 200 µm 的涂层。
- 将涂有光刻胶的硅片放入聚酰亚胺真空烘箱中，在 115 °C 下进行固化：先升温 30 分钟，保温 30 分钟，再降温 30 分钟。
- 使用掩模对准器，通过步骤 1.1 中的光掩模对涂有光刻胶的硅片曝光 130 秒。
- 曝光后，按照步骤 1.2.3 中所述相同过程对硅片进行烘烤。
- 将光刻胶在 SU-8 显影液中显影约 8 分钟。
注意：仅可在通风良好的化学通风橱中使用显影液。
- 对模具进行硅烷化处理，使其表面更具疏水....
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结果
图1展示了组装在3D打印外壳内的声流控系统的图像。本方案构建的声流控系统可用于在多种细胞系中利用超声造影剂增强细胞内分子递送。
图2 显示，与未处理的对照组相比，采用声流控处理可显著增强荧光化合物荧光素向原代人T细胞的胞内递送（p<0.05，n=3/组）。将T细胞以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液和25 µL/mL超声造影剂溶液的PBS中，混合液经声流控装置进行超声处理。处理后通过离心洗涤去除胞外荧光素，再通过流式细胞术检测胞内荧光素的递送效率及细胞活力。未处理对照组的T细胞同样以1×10⁶个/mL的浓度悬浮于含100 µg/mL荧光素溶液的PBS中，但未添加超声造影剂溶液，且未经过声流控装置处理。经声流控处理后，T细胞的荧光强度较未处理对照组提高了5倍，表明荧光素的递送效率显著增强。声流控处理后细胞活力略有下降，但仍保持在80%以上（p<0.05，n=3/组）。
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讨论
本方案描述了一种低成本声流控系统的组装与操作方法，该系统可增强生物分子向细胞内的递送，适用于科研应用。在组装和操作该系统时，需考虑若干重要因素。声流控装置由聚二甲基硅氧烷（PDMS）制成，这是一种生物相容性材料，可方便地模塑成型，并保持通道尺寸的一致性27。在进行声流控处理前，可用15 mL的70%乙醇溶液冲洗装置通道，以提高与培养细胞操作时的无菌性。乙醇清洗后，可使用15 mL去离子水冲洗装置，以在加入细胞溶液前清除通道中残留的乙醇。微小的声流控通道容易被碎屑或细胞聚集体堵塞，这限制了装置的频繁使用。每次样品处理后彻底冲洗通道有助于防止通道堵塞问题。此外，每批次可制备多个PDMS装置，以便在必要时快速更换。对于基于超声的应用，制备具有均匀厚度的PDMS装置至关重要，因为PDMS厚度的差异会影响流体通道内的超声压力。超声波在装置中持续传播，透射波与反射波相互作用形成稳定的声波模式，该模式对PDMS厚度的差异极为敏感17。PDMS的厚度主要由加入模具中的PDMS量决定（步骤1.7），本方案所得PDMS厚度为3.5 mm。
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披露
共同作者 MAM 和 JAK 持有 DesiCorp 的所有权，该公司可能从与本研究相关的產品中获得经济利益。
致谢
本工作部分得到了美国国家科学基金会（#1827521、#1827521、#1450370） 和美国国立卫生研究院（U01HL127518）资助。光刻服务由路易斯维尔大学微/纳米技术中心提供。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 声流控装置的制备 | |||
| DOW SYLGARD 184 硅胶封装剂，透明，0.5 kg 套件 | 埃尔斯沃思粘合剂 | 4019862（SKU） | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core（2.5 mm） | 电子显微镜科学公司 | 69039-25 | |
| 15 mL Falcon管微型储液器 - S型（2/4端口） | 达尔文微流控 | LVF-KPT-S-2（货号） | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| 显微镜载玻片 | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| 三氯硅烷 | Gelest | 105732-02-3（Cas号） | 氯硅烷具有高度危险性和易燃性。接触会导致严重灼伤和眼部损伤。 |
| Tygon PVC 软塑料管（1/16" ID，1/8" OD | McMaster-Carr | 5233K51（部件编号） | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| 声流控系统的组装 | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050（条形码） | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| 超声造影剂的制备 | |||
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-乙基磷脂酰胆碱（DSEPC） | Avanti Lipids | 890703P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DSPC） | Avanti Lipids | 850365P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸甘油（DSPG） | Avanti Lipids | 840465P-25mg（货号） | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP（十氟丁烷气体） | FlouroMed | 355-25-9（Cas No.） | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 混合器 | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| 聚氧乙烯40硬脂酸酯 | Sigma-Aldrich | P3440-250G（货号） | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=zh&®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj 高效递送生物分子进入细胞内是广泛生物医学研究和细胞治疗应用所必需的。超声介导的声致孔技术是一种新兴的生物分子胞内递送方法。当充满气体的微泡发生空化时，会在邻近细胞膜上形成瞬时孔隙，从而使细胞快速摄取周围液体中的生物分子。目前针对悬浮细胞体外声致孔的技术受限于通量低、各细胞所受超声暴露条件不一致以及成本高昂等问题。为克服这些局限，已开发出一种低成本声流控装置，该装置将超声换能器集成于基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控芯片中，结合超声造影剂，在细胞流经通道时实现稳定一致的声致孔效应。该装置采用标准光刻技术制备PDMS微流控芯片，将压电超声圆盘换能器连接至装置并由微控制器驱动。整个组件可集成于3D打印外壳中以提供额外保护。通过连接PVC管路的注射泵或蠕动泵推动细胞与微泡流经装置。该声流控系统已成功实现向人源T细胞和肺癌细胞高效递送生物分子。与传统的批量处理方法相比，该系统提高了通量并降低了实验变异性，有助于优化生物医学研究中的细胞处理方法以及细胞治疗产品的生产制备。 vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 超声波破碎仪 | Qsonica | Q125-110（参考） | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&&_sid=406df3776&_ss=r |
| 原代T细胞的制备 | |||
| autoMACs 运行缓冲液 | Miltenyi Biotec | 130-091-221（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| 人泛T细胞分离试剂盒（泛T细胞生物素抗体混合液） && Pan T细胞微珠混合液） | Miltenyi Biotec | 130-096-535（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| 磁性细胞分选仪（autoMACS Pro 分离器） | Miltenyi Biotec | 130-092-545（订单号） | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| A549 肺癌细胞的制备 | |||
| 海藻糖检测试剂盒 | Megazyme | K-TREH（货号） | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| 台盼蓝（0.4% 水溶液，即用型，无菌） | VWR | 97063-702（货号） | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
参考文献
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vecto....
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重印与许可
