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方法文章

利用GAL4-UAS系统在Anopheles gambiae中进行功能遗传学研究

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DOI：

10.3791/62131

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2021年4月15日

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1Department of Vector Biology, Liverpool School of Tropical Medicine, 2IMBB FORTH, 3Department of Biology, University of Crete

本文内容

摘要

双组分GAL4-UAS系统是一种多功能工具，可用于在可控的时空条件下调控基因表达，从而在Anopheles gambiae中进行功能性遗传学分析。本文所述该系统的使用方法包括半标准化的克隆策略、基于荧光蛋白标记对蛹进行性别鉴定和筛选，以及胚胎固定。

摘要

双组分 GAL4-UAS 系统是一种多功能且强大的功能遗传学分析工具。该系统的核心在于将转基因“驱动”品系与转基因“响应”品系进行杂交：驱动品系以组织特异性方式表达酵母转录因子 GAL4，而响应品系携带一个候选基因或 RNA 干扰结构，其表达受上游激活序列（UAS）控制，而 UAS 可与 GAL4 结合。在杂交后代中，目标基因或基因沉默结构便按照预设的时空模式表达，从而可对所产生的表型进行检测，并据此推断基因功能。该双元系统使实验设计具有高度灵活性，能够在多种组织特异性表达模式下筛选转基因表达所引发的表型，即使这些表型伴随严重的适合度代价亦可进行。我们已将此系统应用于非洲主要疟疾传播媒介——Anopheles gambiae。

本文介绍了一些在 GAL4-UAS 分析过程中常用的实验方法。我们描述了已建立的冈比亚按蚊（An. gambiae）GAL4-UAS 品系，以及用于基因上调和 RNAi 沉默的新效应子载体的克隆方法。我们提供了按蚊蛹期性别鉴定的逐步操作指南，以建立遗传杂交，并包括对后代进行筛选，以追踪标记驱动子和效应子插入的荧光基因标记的遗传情况。此外，我们还介绍了一种用于透明化冈比亚按蚊（An. gambiae）胚胎以研究胚胎发育的实验方案。最后，我们提出了通过 CRISPR/Cas9 技术将 GAL4 插入目标基因下游以构建驱动子品系的潜在改进方法。

引言

双组分GAL4-UAS系统是昆虫模式生物Drosophila melanogaster1,2,3中基因功能鉴定的主要工具。使用GAL4-UAS系统时，将携带酵母转录因子GAL4的转基因驱动品系（其表达受特定调控序列控制）与响应品系（携带由GAL4识别的上游激活序列（UAS）控制的目的基因或RNA干扰（RNAi）构建体）进行杂交。该杂交后代中，目的转基因的表达模式由驱动GAL4表达的启动子决定，呈现特定的时空表达特征（图1）。通过分析驱动品系与响应品系杂交后代所表现出的表型，可揭示候选基因的功能。尽管D. melanogaster已被用于研究其他生物的基因4,5,6,7，但目前GAL4-UAS系统已拓展应用于具有医学和农业重要性的其他昆虫物种，以实现对目标物种的直接功能分析8,9,10,11,12,13,14。

在非洲疟疾按蚊Anopheles gambiae中，GAL4-UAS系统最初通过细胞系共转染实验进行了测试9。研究人员对多种构建体在不同成对组合中的效率进行了检测，发现当与一系列GAL4驱动子联合使用时，含有14个串联重复UAS并添加一个小的人工内含子（UAS-14i）的构建体表现出最广泛的激活潜力。为验证该系统在体内的功能，随后利用PiggyBac转化技术8构建了两个独立的转基因An. gambiae品系：一个驱动品系，其GAL4由中肠特异性启动子驱动；另一个响应品系，其萤光素酶和增强型黄色荧光蛋白（eYFP）基因均受UAS序列调控。子代中肠特异性的萤光素酶活性和荧光信号表明，该系统在Anopheles中具有高效性。此后，研究人员已构建出在其他与媒介能力及杀虫剂抗性相关的重要组织中表达转基因的驱动品系，包括oenocytes15和血细胞16，以及接近泛组织表达的品系10。同时，还构建了大量UAS响应品系，用于检测参与代谢与隔离介导的杀虫剂抗性、表皮碳氢化合物合成的基因，并对不同细胞和组织类型进行荧光标记（表1）。对于响应品系，目前通过ΦC31介导的重组盒交换技术实现转基因的定点整合17,18，以固定UAS调控基因的基因组环境。该方法可消除基因组插入位点对表达水平的影响，从而更准确地比较不同候选基因的表型效应。

目前已创建的响应品系旨在通过RNA干扰（RNAi）实现外源基因的高水平表达或降低特定基因的表达。 通常将cDNA克隆与UAS序列融合以构建合适的表达质粒，但若全基因组序列长度适合克隆，也可使用。为构建沉默结构，我们采用了三种不同方法获得可形成发夹双链RNA（dsRNA）并诱导RNAi的串联反向序列，包括融合PCR、不对称PCR以及发夹结构的商业合成。这些方法的共同点是在反向重复序列之间插入一段内含子序列，以提高克隆的稳定性。现已开发出可插入目的基因或RNAi结构的响应质粒15。这些质粒还含有进行RMCE所必需的ΦC31 attB位点（详见Adolfi在JoVE上发表的配套论文，该论文详细描述了RMCE技术）。本文包含了在选择用于过表达的插入序列时所需关键步骤的操作方案。此外，还描述并图示了两种构建RNAi发夹结构的实验方案。

在创建新品系时，鉴定稀有的转基因个体至关重要，这是建立和维持转基因品系的基础。对于GAL4-UAS系统而言，最关键的是要能够区分应答子（responder）和驱动子（driver）品系，以便设计杂交实验，并鉴定出同时携带两种转基因的后代个体。这一目标通过在驱动子和应答子载体上连接不同的显性可筛选标记基因来实现。最常用的是荧光标记基因，它们可通过光学滤光片清晰区分（例如 eYFP、eCFP、dsRed）。标记基因的表达需具有已知且稳定的时空模式，这有助于更容易地识别异常情况和污染。荧光标记基因的表达通常由合成的3xP3启动子调控，该启动子在An. gambiae发育的各个阶段均特异性地驱动眼部和腹神经节的表达19。本文所描述的所有转化质粒均包含由3xP3调控的荧光标记基因。此处提供了一套详细的实验方案，用于筛选荧光标记的An. gambiae蛹期GAL4-UAS品系。

GAL4-UAS 系统的一个关键要素是必须将带有不同标记的驱动系和响应系进行杂交。为此，在交配前需将各品系的雄性和雌性个体分开。成虫可通过外观轻易区分，但在建立遗传杂交时，为确保交配尚未发生，宜在成虫羽化前即进行性别分离。雄性和雌性之间普遍存在体型差异 An. gambiae 蛹的形态变异过大，无法作为高效且可靠的性别鉴定方法20. 相反，外生殖器存在明显的形态学差异，可作为性别鉴定的可靠依据 An. gambiae. 本文中，我们描述了一种可靠的性别鉴定方法 An. gambiae 蛹以建立适当的杂交组合。

利用RNAi发夹结构、克隆、杂交及昆虫模型中表型分析的基因编辑过程示意图
图1 —在冈比亚按蚊中使用双组分GAL4-UAS系统流程的示意图。（A）展示了一个示例载体（pSL-attB-UAS14-gyp[3xp3-eYFP]）的主要组成部分，详细标明了多克隆位点内可用于插入目标基因发夹结构或编码序列的限制性酶切位点（EcoRI、NheI、XhoI 和 NcoI）。图中还展示了整合位点品系的结构。（B）展示了杂交步骤，使用驱动品系的雄性个体（携带由目标启动子驱动的GAL4以及由3xP3启动子驱动的eCFP）与响应品系的雌性个体（携带由UAS启动子控制的目标基因或发夹结构，以及由3xP3启动子控制的eYFP标记）进行交配。（C）图示说明了在B步骤杂交后代中，GAL4驱动目标基因表达的情况，以及部分常规检测的表型列表。缩写：多克隆位点（MCS）、重组酶介导的盒式交换（RMCE）、上游激活序列（UAS）、增强型黄色荧光蛋白（eYFP）、增强型青色荧光蛋白（eCFP）。请点击此处查看此图的放大版本。

正是杂交的使用赋予了GAL4-UAS系统双组分的特性，使其相较于更为线性的方法具有显著优势。例如，通过该系统可评估的驱动系与响应系组合数量远超每种启动子/基因组合均需独立构建并维持一个转基因品系的线性方法所能实现的范围。更重要的是，该系统使得研究人员能够分析那些在表达受到干扰时导致致死或不育表型的基因，而这类基因在线性系统中难以构建和维持。此类致死表型可能在发育的各个阶段出现，具体取决于基因功能及其时空表达模式，但最常在胚胎发育期间被观察到。要观察蚊子胚胎的发育过程，需去除覆盖在卵表面的不透明卵壳。我们参照Trpiš（1970）21和Kaiser等（2014）22所描述的方法，介绍了我们在保持胚胎结构完整性的前提下进行固定以及漂白以去除内卵壳、从而实现显微观察与成像的实验方案。

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方案

1. UAS 载体的设计与构建

  1. 候选基因表达载体的设计与构建
    1. 确定用于候选基因上调的序列。
      1. 对目标品系的 cDNA/gDNA 进行测序，并与已发表序列进行比对，以验证其身份，并识别潜在的 SNP 和用于诊断性酶切的限制性酶切位点。
      2. 在适当情况下，确保用于基因扩增的正向引物覆盖天然的 Kozak 序列和起始密码子。设计在起始密码子上游约 10 个碱基处结合的引物，可包含 Kozak 序列。
      3. 在大多数情况下，反向引物扩增的片段中应包含终止密码子。可使用文中所述质粒载体提供的 3' 终止序列，或从候选基因的基因组序列中扩增获得。
      4. 如需要，可订购具有特定密码子偏好性的商业合成序列。
    2. 采用标准亚克隆方法将基因表达盒插入 UAS 质粒载体中，例如用于基因上调和 RNAi 构建的 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15（图 1）。
    3. 利用 ΦC31 重组介导的表达盒交换技术生成转基因蚊子10,17,18,23。
  2. RNAi 发夹结构构建：利用不对称 PCR 进行单步扩增15,24
    1. 采用 Livak 方法25从携带目标候选基因的成年雌性 An. gambiae 中提取基因组 DNA（gDNA）。
      1. 设计正向引物，使其结合至目标外显子 5' 端，并朝向相邻内含子方向。设计桥接引物的 3' 端，使其结合至前一个外显子末端以扩增内含子，其 5' 端则与紧随内含子之后的目标外显子小片段互补。
    2. 按照 Xiao（2006）24 所述进行不对称 PCR 反应（图 2）。
    3. 将纯化的 PCR 产物克隆至含有 UAS 启动子的合适载体中（例如 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]15）。
      注：适用于 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] 克隆15 及后续步骤的多克隆位点内的酶切位点见 图 1。必须使用单一酶切，因为仅引入一个限制性酶切位点。质粒去磷酸化可提高克隆效率。
  3. RNAi 发夹结构构建：cDNA 与 gDNA 的融合 PCR15
    1. 采用 Livak 方法25从携带目标候选基因的成年雌性 An. gambiae 中提取基因组 DNA（gDNA）。
      1. 将 gDNA 用于 PCR 反应，共同扩增目标外显子和内含子区域（图 2）。
      2. 设计正向引物的 3' 端，使其结合至反向目标外显子序列，并朝向目标内含子序列扩增；其 5' 端携带限制性酶切位点，以利于后续克隆。
      3. 设计反向引物（1），使其 3' 端结合至内含子的 5' 端，5' 端突出部分携带相邻外显子正向序列的前几个碱基。该突出部分用于融合 PCR。
      4. 纯化目标反应产物。
    2. 提取 RNA，使用 DNase 去除 DNA，并按照制造商说明书从携带目标候选基因的成年雌性 An. gambiae 中制备 cDNA。
    3. 使用 cDNA 进行 PCR 反应，仅扩增目标外显子区域（图 2）。
      1. 设计正向引物（2），使其 3' 端结合至互补目标外显子序列的 3' 端，5' 端携带用于克隆的限制性酶切位点。
        注：步骤 1.3.1.2 中的正向引物可在此第二轮反应中重复使用。但这意味着必须采用单一酶切。若使用带有不同限制性酶切位点的第二个正向引物，则可进行双酶切，可能提高克隆效率。
      2. 设计反向引物（2），使其 3' 端结合至相邻外显子的 5' 端以扩增目标外显子，5' 端则结合至内含子正向链的 3' 端。该突出部分用于融合 PCR。
      3. 纯化目标反应产物。
    4. 将步骤 1.3.1 和 1.3.2 的产物作为模板，使用正向引物 1 和 2，按照标准浓度进行融合 PCR 反应。纯化目标产物。
    5. 对纯化后的产物进行酶切，以产生用于克隆的突出末端，并将其克隆至 UAS 启动子下游的合适载体中。适用于 pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP] 克隆15 及后续步骤的酶切位点见 图 1。

不对称PCR和融合PCR示意图；外显子-内含子靶向；酶切；基因编辑技术。
图2 —通过两种方法构建用于插入pSL-attB-UAS14-gyp[3xP3-eYFP]载体的RNAi表达载体的示意图：（A）单步不对称PCR（改编自Xiao Y H 等，2006）；（B）多步融合PCR。请点击此处查看该图的放大版本。

2. An. gambiae 蛹的筛选

  1. 用于显微表征的蛹收集
    注意：本方案中提及的水均指添加了0.01%池塘盐的蒸馏水。
    1. 按照标准方案（例如MR426）饲养An. gambiae蚊子至蛹期。
      注意：在整个过程中需小心操作，避免损伤蛹。
    2. 将蛹收集至适合体视显微镜观察的透明平底培养皿中（例如100 × 15 mm塑料培养皿），避免靠近边缘放置。
      注意：收集蛹时，我们使用一支3 mL塑料巴斯德移液管，将其末端剪去约10 mm以扩大开口，防止损伤蚊体。虽然可对单个个体进行筛选和性别鉴定，但效率极低。建议以每组50–200个蛹进行批量筛选与性别鉴定（具体数量受所用培养皿大小限制，并可根据个人偏好调整）。若需处理大量样本，可先将蛹排列成4–5层深的行列，再将目标蛹从中移出，以提高效率。
    3. 使用巴斯德移液管小心吸除蛹周围几乎全部的水，仅保留少量水使蛹基本无法活动，但仍可用细毛笔轻松移动。若蛹难以移动，可适当补充水分。
      注意：当水分减少到适当程度时，蛹会侧卧，便于观察眼睛的荧光信号以及两性异形的生殖结构（图4DE）。
      注意：确保蛹不发生干燥。若残留水量过少，显微镜灯热源可能导致水分进一步蒸发，并在不同蛹群之间分布不均。必要时需使用3 mL巴斯德移液管向目标组别补充适量水分。
  2. 蛹中荧光标记的鉴定
    注意：使用低倍体视显微镜可实现大视野快速筛选；也可在倒置复合显微镜下进行分选，但必须逐个操作。
    1. 在筛选荧光标记时，首先必须明确预期的表达模式和遗传规律。需考虑以下因素：
      1. 颜色：确定用于观察表达所需的滤光片。
      2. 时空表达模式：明确预期在哪个部位及哪个发育阶段出现表达。
      3. 不同表型的比例：明确群体中应有多少比例个体携带目标标记。
    2. 在黑暗环境中进行荧光筛选，因为即使微弱的环境光也可能干扰荧光信号的分辨。但在需要进行其他操作时，可在体视显微镜旁使用照明灯。
      注意：关闭灯光前，务必确保荧光体视显微镜周围工作区域已清理干净。
    3. 打开荧光灯并按制造商推荐时间预热（通常为10–15分钟）。选择荧光体视显微镜上所需的滤光片，并检查是否有可见的彩色光束照射到载物台中心。若无光束或光束极弱，可能是荧光灯尚未充分预热、快门关闭，或显微镜光路未对准。
    4. 使用白光将蛹置于视野中央并调焦。切换不同滤光片时，可能需要根据荧光强度调整放大倍数。
    5. 使用细毛笔确保待检蛹之间不重叠。
    6. 关闭体视显微镜的白光，使用微调焦将携带目标表型的蛹区域调至清晰。此时应可见荧光信号。3xP3启动子调控的荧光示例见图3。
      1. 采用能够可靠区分荧光阳性与阴性个体的最低放大倍数。
      2. 对于荧光较强的品系，在筛选时可同时使用低强度明场光照，前提是荧光信号仍能清晰识别。
      3. 完成初步筛选后，迅速在其他滤光片下扫描群体，以检测潜在污染。
        注意：已分选的蛹群之间应保持足够距离，防止因蛹移动造成交叉污染。需注意，随着性别鉴定的进行，各组数量会发生变化；且在放大观察时，距离可能显得更大。当各组不在同一视野内时，应格外小心。

荧光蛋白表达分析；YFP、dsRed、CFP；显微镜图像、基因表达。
图3 — 在3xP3启动子驱动下表达荧光标记的冈比亚按蚊蛹：(A) eYFP，(B) dsRed 和 (C) eCFP。 放大倍数：A=16X，B、C=20X。

  1. 蛹的性别鉴定
    1. 收集蛹；去除多余水分，但保留足够水分使肛鳍与生殖器略微分离，以利于观察和形态学鉴定图 4D，E).
    2. 若存在未侧放的蛹，可用精细的细节画笔轻轻翻转蛹体，并调整其肛鳍，以便识别外部生殖器。
    3. 根据外部生殖器的显著特征将蛹分开；雄性个体从最后一节背段伸出一根长约肛叶一半的细长管状结构图4B）。雌性蛹的外生殖器明显较短且呈分叉状（图 4A).
      注意：偶尔情况下，如果 4th 龄幼虫的外骨骼仍附着或外部生殖器受损（图4C），准确鉴定性别较为困难。当蛹的性别不明确时，最佳做法是将其弃置。若需保留该个体，应让蛹在隔离环境中羽化，并利用成虫的形态特征来确定其性别。如果其生殖器受损，该个体可能无法成功交配。
    4. 在培养皿的两端分别建立按性别分类的果蝇蛹池，与未分性别的蛹池相对放置，使用细头绘图笔将已鉴定性别的蛹转移至相应位置。在培养皿底部标记两个蛹池的位置，以便后续识别。
    5. 当需要同时进行性别鉴定和荧光筛选时，应先进行荧光筛选，因为该步骤比两者中更为快速。

显示按蚊蛹雌雄形态差异的显微镜示意图。
图4 —冈比亚按蚊蛹的性别鉴定。 单个蛹显示其外部生殖器：（A）雌性，（B）雄性，以及（C）因幼虫外骨骼未完全脱落而难以明确识别的个体。下方为放大图像，突出显示外部生殖器。图中带有♀（雌性）和♂（雄性）标记的蛹分别显示：（D）约50%蛹体浸没在水中，以及（E）完全去除水分后的情况，以突出外部生殖器可视化的难易差异。放大倍数：A、B、C = 40×，D、E = 30×。 请点击此处查看该图的高清版本。

  1. 成虫性别确认
    1. 在证明错误率极低之前，需通过成虫羽化后的形态学特征确认蛹期的性别鉴定结果。将已按性别分离的蛹每10只或更少分组，放入装有数毫升水的透明20 mL试管中，用一团棉絮封口，并标记预期性别，过夜让其羽化。
      注意：由于次日早晨即转移成虫，因此无需为正在羽化的成虫提供食物。
    2. 次日利用形态学特征确认已羽化成虫的性别。
    3. 若在雌性群体中发现任何雄性个体，应丢弃全部雌虫，以防已发生交配。
    4. 若在雄性群体中发现雌性个体，应移除该雌性并保留雄性用于后续杂交。
  2. 建立GAL4-UAS系统杂交
    1. 从步骤2.4中的试管中吸取所需数量的成年雄虫和雌虫，转移至按标准方式设置的饲养笼或小桶中，用于An. gambiae的常规饲养。
      注意：转移过程中需小心操作，避免损伤成虫。
    2. 当需要获得约2000只子代成虫时，使用约50只雌虫与等量雄虫进行杂交。
      注意：若需多次饲血以产生多批后代，可在30 cm × 30 cm × 30 cm的笼中设置最多200只每种性别的成虫。当可用于杂交的雌虫数量较少（<20只）时，建议加入约4倍数量的雄虫，以提高成功交配的概率。
    3. 对杂交后的雌虫进行血液饲喂，并按照标准方案26将子代培养至适当阶段，用于表型评估（如杀虫剂抗性、媒介能力及适合度代价测定）。
    4. 若转基因表达可能存在母体效应，应设置驱动系与响应系之间的反交实验，并检测预期表型。
      注意：使用“杂合”或混合群体的驱动系与响应系进行杂交时，子代将产生四种可能的基因型。这可同时提供野生型、仅含UAS、仅含GAL4的对照组，以及用于表型分析的双杂合子GAL4-UAS个体。若使用纯合群体进行杂交，需额外设置对照杂交以提供合适的表型比较。子代应如上所述，根据是否携带两种、仅一种标记或无标记进行分选，用于表型评估。
  3. 通过携带不同荧光标记的RCME品系建立纯合群体
    注意：两个品系的荧光标记必须位于相同的基因组位置，且彼此完全可区分。
    1. 根据上述方法，通过筛选正确荧光信号和性别的个体，设置亲本杂交，使用约200只成虫，其中一种品系的雄虫与另一种品系的雌虫数量相等。约一周后，按照既定方案26对杂交群体进行血液饲喂。
      1. 按照标准方案将F1子代培养至蛹期，并按前述方法收集蛹。
    2. 筛选荧光信号，选择同时携带双亲标记的个体（即双杂合子），用这些蛹设置F1代互交。
    3. 一周后，对F1代雌虫进行血液饲喂，并按照标准方案将子代培养至蛹期。
    4. 筛选F2代蛹，选择仅显示单一标记的个体。这些个体将对该插入位点呈纯合状态。每种插入位点的纯合子仅占子代总数的25%，因此必须确保培育足够数量的子代以建立种群饲养笼（400–500只）。
      注意：对双杂合子子代的筛选必须严格彻底，否则会导致过程污染，无法实现完全纯合。请仔细复核所有用于F1互交的子代个体。

3. An. gambiae 胚胎透明化方案

  1. 血液喂养与维持
    1. 后部 An. gambiae 蚊虫至成虫阶段，遵循标准操作规程（例如，MR4)
    2. 对5至7日龄的雌性成虫进行血液饲喂，确保大多数个体完全吸血。
      注意：在整个操作过程中，快速操作至关重要，以确保卵子不会干燥。
  2. 诱导产卵
    1. 在吸血后第3天通过诱导产卵收集卵。
    2. 组装产卵室。
      1. 将产卵盆加水至水深约5 mm。将该盆连接到一根50 mL聚丙烯管的一端，该管此前已用钢锯切割，使两端开口。（我们使用一种塑料圆盘作为产卵盆（图5）；但也可使用试管的原始管盖。
      2. 用材料（软管/紧身袜）或乳胶手套片覆盖聚丙烯管的另一端，并用橡皮筋固定，以便引入成虫但防止其逃逸（图5）。其他可选的产卵室设计也存在，可根据需要选用26.
    3. 小心地将10–15只雌蚊（已在步骤3.1.2中饲喂血液）引入产卵室。盖上产卵室以营造黑暗环境，静置20分钟。
      注意：一旦产卵完成，应避免移动产卵容器，以防卵被孤立或干燥。
    4. 小心地将50 mL聚丙烯管从产卵罐中取下，注意不要让蚊子逸出。此时应可见白色虫卵。检查所产卵的数量是否满足预定实验需求，必要时重复操作。
    5. 用盖子盖住容器（以防灰尘污染），并让卵发育至目标发育阶段。
    6. 使用细部细节画笔从容器中拾取卵，并将其放置在40 mm的水中2 挖出的玻璃块

静力平衡实验装置，使用试管盖和橡皮筋；图示为逐步组装示意图。
图 5 — 卵产装置示例：（A）拆解状态以突出显示各组件，（B）组装完成状态。 请点击此处查看本图的放大版本。

  1. 胚胎固定
    注意：由于使用甲醛，所有固定步骤（步骤 3.3）必须在通风橱中进行。
    1. 按照 Kaiser 等（2014）22 所述方法配制 FAA 溶液。FAA 溶液包含 3.6 M 甲醛、0.87 M 乙酸和 8.5 M 无水乙醇，用去离子水（dH2O）定容至所需体积。
      1. 配制 10 mL FAA 溶液时，将 2.68 mL 的 13.42 M 甲醛、4.96 mL 的 17.14 M 乙醇、0.5 mL 的 17.4 M 乙酸与 1.86 mL 去离子 H2O 混合。固定液可保存至少 3 个月，需置于密封良好的玻璃容器中，并存放于指定的化学品柜内。
    2. 用移液器小心吸去玻璃块中的水，加入 500 µL FAA 溶液覆盖卵，置于室温下在旋转摇床上轻柔振荡（约 25 RPM）30 分钟。此时无明显颜色变化。
    3. 用去离子水彻底冲洗卵。共冲洗 15 次，以彻底去除残留甲醛。使用 1000 µL 移液器，每次加入并吸出 1 mL dH2O，操作过程中注意避免损伤卵。
    4. 将冲洗产生的废液收集于指定的甲醛废液容器中，按照安全规范进行处理。
    5. 此时，固定后的卵可在水中于 4 °C 下短期保存过夜，以保持其湿润状态。
  2. 胚胎漂白
    注意：由于次氯酸钠与乙酸混合可能释放氯气，所有漂白步骤（步骤 4）必须在通风橱中进行。
    1. 配制漂白液（Trpiš 溶液——Trpiš（1970）21 中描述，并根据 Kaiser 等（2014）22 进行改良）。Trpiš 溶液为 0.59 M 次氯酸钠和 0.35 M 乙酸溶于去离子 H2O 中。
      1. 配制 10 mL Trpiš 溶液时，将 2.68 mL 的 2.2 M 次氯酸钠和 0.2 mL 的 17.4 M 乙酸与 7.12 mL 去离子 H2O 混合。
        注意：Trpiš 溶液可保存至少 3 个月，需置于密封良好的玻璃容器中，并存放于安全的化学品柜内。溶液储存后可能需要涡旋混匀，且开启时必须在通风橱中操作，以防氯气释放。
    2. 用 1 mL Trpiš 溶液覆盖已固定的卵，室温孵育 30 分钟。约 5 分钟后卵表面开始出现浅色斑块，最终变为乳白色透明状态。
    3. 参照步骤 3.3.3 的方法冲洗卵，以去除 Trpiš 溶液。
    4. 将废液收集于指定废液容器中，可与过量水一同排入下水道处理。
  3. 保存
    1. 将卵保存于 500 µL dH2O 中，置于 2–8 °C 下可保存数天。在进行批量观察和成像前，小心吸除大部分液体，但需保留少量水以防止卵干燥，可在表面皿中留有微量液体。此操作不会影响卵的拍照。单个卵可转移至显微镜载玻片上，用于高倍成像。

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结果

3xP3 启动子驱动的 eYFP、dsRed 和 eCFP 表达可在An. gambiae蛹的眼部和腹神经节中产生可靠且易于区分的标记，从而准确识别携带这些标记基因的个体（图3）。雄性和雌性外部生殖器在形态上的差异可用于性别鉴定，图4展示了这一特征及一个无法识别性别的蛹样例。去除蛹体表面所有水分会增加性别鉴定难度，因为肛门桨状结构会遮挡生殖器的观察（图4D、E）。双组分GAL4-UAS系统可实现基因表达的时空特异性调控，通过将泛表达驱动系（图6A、C）和油胞细胞特异性驱动系（图6B、D）与响应子品系UAS-mCD8:mCherry10杂交，可直观观察到基因表达...

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讨论

了解蚊子基因功能对于开发控制 Anopheles 并影响疟疾传播的新方法至关重要。本文所述的GAL4-UAS系统是一种多功能且强大的候选基因功能分析工具，迄今为止，我们已利用该系统研究了杀虫剂抗性的遗传基础17 以及表皮碳氢化合物的产生15,23，同时还实现了对不同蚊子细胞群体的荧光标记8。目前，响应子构建体主要通过限制性内切酶克隆方法插入含有多个克隆位点的质粒中，该位点位于UAS下游（图1、表1）。然而，由于这些构建体具有模块化特征，包含多个元件（attB位点、 3xP3-YFP和gypsy绝缘子序列），因此可采用更为现代的技术来构建新的响应子质粒。通常，过表达序列可通过PCR从cDNA或gDNA中扩增获得，但商业合成有时可减少构建新载体所需的人力和时间。在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢LSTM和IVCC（Adriana Adolfi）、BBSRC（新研究者奖，AL）、MRC（BCP博士生奖学金：MR/P016197/1）以及Wellcome（Sir Henry Wellcome博士后奖学金，LG：215894/Z/19/Z）提供的资助，这些资助项目均在提案中纳入了Gal4UAS分析。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
100 x 15 mm 塑料培养皿SLS2175546每包 10 个
1000 µL Gilson 移液器GilsonF144059P
20/25 mL 通用管StarlabE1412-3020每包 400 个
3 mL 巴斯德吸管SLSG612398Greiner 3 mL 无菌独立包装巴斯德吸管
50 mL Falcon 管Fisher Scientific11512303
无水乙醇Fisher ScientificBP2818-500500 mL
乙酸SLS45726-1L-F1 L
饲养笼SLSE609930x30x30 带筛网接口
细毛画笔AmazonUKDPB66KOLAMOON 9 件套细节绘画笔套装，适用于水彩、丙烯、油画（酒红色）
鱼食AmazonTetra Min 鱼食，适用于所有热带鱼的全面营养食品，促进健康、体色和活力，10 L 
甲醛溶液Sigma AldrichF8775
口吸管John Hock612
池塘盐AmazonBlagdon Guardian 池塘保健盐，用于鱼类健康、水质调节、通用补剂、pH 缓冲，9.08 kg，可处理 9,092 L 水量 
蛹盒Cater4youSP8OZ250 个带盖蛹盒
小型塑料桶Amazon2.5 L 白色塑料桶，配白色盖（每包 10 个） 
次氯酸钠Fisher ScientificS25552

参考文献

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