Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में

Published: February 10, 2021 doi: 10.3791/62166
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Cellular and Molecular Neurobiology, Zoological Institute, Technische Universität Braunschweig, 2Institute of Pathophysiology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University, 3Cell Physiology, Zoological institute, Technische Universität Braunschweig

Summary

यहां हम लार्वा और किशोर चरणों तक वीवो में जेब्राफिश भ्रूण मस्तिष्क की छवि के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोणों से अनुकूलित यह माइक्रोइनवेसिव प्रक्रिया परिपक्व न्यूरॉन के सेलुलर और उपकोशिक विवरण तक पहुंच प्रदान करती है और मस्तिष्क समारोह और दवा हस्तक्षेप की विशेषता के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स और न्यूरोफार्माकोलॉजिकल अध्ययनों के साथ जोड़ा जा सकता है।

Abstract

मस्तिष्क के विकास और परिपक्वता के दौरान होने वाले क्षणभंगुर परिवर्तनों को समझना सेलुलर और उपकोशिकीय संकल्प पर अंतरिक्ष और समय में विस्तृत उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग की आवश्यकता होती है। आणविक और इमेजिंग प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने हमें पारदर्शी ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में मस्तिष्क के विकास के सेलुलर और आणविक तंत्र में कई विस्तृत अंतर्दृष्टि प्राप्त करने की अनुमति दी है। हाल ही में, निषेचन के कई हफ्तों बाद लार्वा चरणों में होने वाले न्यूरोनल कनेक्टिविटी के शोधन की प्रक्रियाएं, जो उदाहरण के लिए सामाजिक व्यवहार, निर्णय लेने या प्रेरणा-चालित व्यवहार का नियंत्रण हैं, अनुसंधान के ध्यान में चले गए हैं। इन चरणों में, ज़ेब्राफ़िश त्वचा का पिगमेंटेशन मस्तिष्क के ऊतकों में प्रकाश प्रवेश के साथ हस्तक्षेप करता है, और भ्रूणीय चरणों के समाधान, उदाहरण के लिए, पिगमेंटेशन का औषधीय अवरोध, अब संभव नहीं है।

इसलिए, जाग जेब्राफिश के मस्तिष्क तक माइक्रोस्कोपी पहुंच के लिए एक न्यूनतम आक्रामक शल्य चिकित्सा समाधान प्रदान किया जाता है जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल दृष्टिकोण से प्राप्त होता है। टेलीओस्ट में, त्वचा और नरम खोपड़ी उपास्थि को इन परतों को माइक्रो-छीलने से सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है, जो अंतर्निहित न्यूरॉन्स और अक्षीय क्षेत्रों को नुकसान के बिना उजागर करता है। यह सिनैप्टिक संरचनाओं और उनकी आणविक सामग्री सहित न्यूरोनल आकृति विज्ञान को रिकॉर्ड करने और सीए2 + यात्रियों या इंट्रासेलुलर परिवहन घटनाओं जैसे शारीरिक परिवर्तनों के अवलोकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, औषधीय अवरोध या ऑप्टोजेनेटिक हेरफेर के माध्यम से इन प्रक्रियाओं से पूछताछ संभव है। यह मस्तिष्क जोखिम दृष्टिकोण न्यूरॉन्स में संरचनात्मक और शारीरिक परिवर्तनों के साथ-साथ मिनट या घंटों की सीमा में जीवित मस्तिष्क ऊतक में इन घटनाओं के सहसंबंध और परस्पर निर्भरता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। यह तकनीक निषेचन के बाद 30 दिनों तक जेब्राफिश लार्वा के वीवो ब्रेन इमेजिंग में उपयुक्त है, अब तक का नवीनतम विकासात्मक चरण परीक्षण किया गया है। इस प्रकार, यह सिनैप्टिक परिष्करण और स्केलिंग, अक्षीय और डेंड्रिटिक परिवहन, साइटोस्केलेल कार्गो या स्थानीय गतिविधि-निर्भर अभिव्यक्ति के सिनैप्टिक लक्ष्यीकरण जैसे महत्वपूर्ण प्रश्नों तक पहुंच प्रदान करता है। इसलिए, इस बढ़ते और इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एक व्यापक उपयोग का अनुमान लगाया जा सकता है।

Introduction

हाल के दशकों में, जेब्राफिश(डैनियो रेरियो)भ्रूण और लार्वा विकास अध्ययनों के लिए सबसे लोकप्रिय कशेरुकी मॉडल जीवों में से एक के रूप में विकसित हुआ है। जेब्राफिश मादाओं की बड़ी मलकंपना के साथ - साथ भ्रूण के तेजी से पूर्व गर्भाशय विकास और प्रारंभिक भ्रूणीय विकास के चरणों के दौरान इसकी पारदर्शिता केवल कुछ प्रमुख कारक हैं जो जेब्राफिश को विकासात्मक प्रश्नों को दूर करने के लिए एक शक्तिशाली आदर्श जीव बनाते हैं1। आणविक आनुवंशिक प्रौद्योगिकियों में प्रगति जो वीवो इमेजिंग अध्ययनों में उच्च संकल्प के साथ संयुक्त रूप से विकास प्रक्रियाओं में अंतर्निहित कोशिका जैविक तंत्र को संबोधित करने के लिए अनुमति दी गई2. विशेष रूप से, न्यूरोनल भेदभाव, शरीर विज्ञान, कनेक्टिविटी और फ़ंक्शन के क्षेत्र में, जेब्राफिश ने अभूतपूर्व विस्तार से आणविक गतिशीलता, मस्तिष्क कार्यों और ऑर्गेनिक व्यवहार के परस्पर क्रिया पर प्रकाश डाला है।

फिर भी, इन अध्ययनों के अधिकांश भ्रूण और प्रारंभिक लार्वा चरणों के विकास के पहले सप्ताह के दौरान प्रतिबंधित कर रहे है के रूप में तंत्रिका तंत्र के ऊतकों की पारदर्शिता उत्तरोत्तर खो दिया है । इन चरणों में, मस्तिष्क के ऊतकों को खोपड़ी भेदभाव और पिगमेंटेशन 3 द्वारा परिरक्षित होने वाले उच्च रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोणों द्वारा पहुंच से रोकाजाताहै।

इसलिए, न्यूरोनल भेदभाव, परिपक्वता और प्लास्टिसिटी के प्रमुख प्रश्न जैसे न्यूरोनल कनेक्टिविटी या सिनैप्टिक स्केलिंग का शोधन अध्ययन करना मुश्किल है। इन सेलुलर प्रक्रियाओं के क्रम में सेलुलर तंत्र ड्राइविंग को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, उदाहरण के लिए, सामाजिक व्यवहार, निर्णय लेने, या प्रेरणा आधारित व्यवहार, क्षेत्रों के लिए जो कई हफ्तों के पुराने लार्वा पर ज़ेब्राफिश अनुसंधान हाल ही में व्यवहार अध्ययन के आधार पर महत्वपूर्ण निष्कर्षों का योगदान दिया है4।

कई हफ्तों तक जेब्राफिश लार्वा में पिगमेंटेशन को रोकने के लिए औषधीय दृष्टिकोण बमुश्किल संभव हैं या हानिकारक प्रभाव भी पैदा कर सकते हैं5,6,7,8. विशिष्ट पिगमेंटेशन दोषों जैसे कैस्पर9 या क्रिस्टल10के साथ डबल या ट्रिपल उत्परिवर्ती उपभेद, काफी मूल्यवान उपकरण बन गए हैं, लेकिन प्रजनन में श्रमसाध्य हैं, कुछ संतान प्रदान करते हैं, और अत्यधिक प्रजनन के कारण आनुवंशिक विकृतियों को जमा करने का खतरा पैदा करते हैं।

यहां, एक विकल्प के रूप में एक न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया प्रदान की जाती है जो किसी भी जेब्राफिश तनाव पर लागू होती है। इस प्रक्रिया को इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों से जीवित और जागते जेब्राफिश लार्वा में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए अनुकूलित किया गया था। टेलीओस्ट में, त्वचा और नरम खोपड़ी उपास्थि को इन परतों को माइक्रो-छीलने से सावधानीपूर्वक हटाया जा सकता है, क्योंकि वे मस्तिष्क वैक्यूलेचर के साथ कसकर नहीं बुने जाते हैं। यह बिना किसी क्षति के न्यूरॉन्स और अक्षीय क्षेत्रों वाले मस्तिष्क के ऊतकों को उजागर करने और सिनैप्टिक संरचनाओं और उनकी आणविक सामग्री सहित न्यूरोनल आकृति विज्ञान को रिकॉर्ड करने के लिए अनुमति देता है, जिसमें बदले में कई घंटों तक सीए2 + यात्रियों या इंट्रासेलुलर परिवहन घटनाओं जैसे शारीरिक परिवर्तनों का अवलोकन शामिल है। इसके अलावा, वर्णनात्मक लक्षणों से परे, मस्तिष्क के ऊतकों तक सीधी पहुंच न्यूरोफार्माकोलॉजिकल पदार्थ प्रशासन और ऑप्टोजेनेटिक दृष्टिकोणों के माध्यम से परिपक्व न्यूरोनल कार्यों से पूछताछ में सक्षम बनाती है। इसलिए, इस मस्तिष्क जोखिम रणनीति का उपयोग कर किशोर ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में सही संरचना समारोह संबंधों को प्रकट किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

यहां वर्णित सभी पशु कार्य कानूनी नियमों (ईयू-निर्देश 2010/63) के अनुसार है । रखरखाव और मछली की हैंडलिंग स्थानीय अधिकारियों द्वारा और टेकनीश Universität Braunschweig के पशु कल्याण प्रतिनिधि द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. कृत्रिम सेरेब्रो स्पाइनल फ्लूइड (ACSF) की तैयारी, कम पिघलने वाली एगर उठे और तेज ग्लास सुई

  1. आसुत जल में निम्नलिखित सांद्रता पर सूचीबद्ध रसायनों को भंग करके ACSF तैयार करें। 134 mM NaCl (58.44 ग्राम/मोल), 2.9 mM KCl (74.55 g/mol), 2.1 mM CaCl2 (110.99 g/mol), 1.2 एमएमएम एमजीसीएल2 6x एच2ओ (203.3 ग्राम/मोल), 10 एमएम एचईपीई (238.31 ग्राम/मोल), और 10 एमएम डी-ग्लूकोज (180.16 ग्राम/मोल) ।
    नोट: एमजीसीएल2,सीएसीएल2और केसीएल के लिए, 1 एम स्टॉक समाधान डेसाल्टेड बाँझ पानी में तैयार किए जाते हैं और बाद में ताजा ACSF तैयार करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किए जाते हैं। ग्लूकोज, HEPES, और NaCl ताजा ACSF समाधान में ठोस यौगिकों के रूप में भंग कर रहे हैं । रसायनों को भंग करने के लिए, निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
  2. 10 एम नाओह के साथ 7.8 करने के लिए ACSF के पीएच समायोजित करें। ACSF की तैयारी के लिए रसायनों के सटीक माप और पीएच के ठीक समायोजन की आवश्यकता होती है क्योंकि यह मस्तिष्क की रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ को बदल देता है और न्यूरॉन्स के लिए आवश्यक शारीरिक स्थितियों को पूरी तरह से कार्यात्मक बनाए रखता है और यह मस्तिष्क के गलत कार्य और न्यूरोनल मौत का कारण बन सकता है।
  3. हौसले से तैयार एसीएसएफ को अधिकतम 4 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। काम करने की स्थिति के लिए, दिन/प्रयोग के लिए ACSF की आवश्यक मात्रा और 25-28 डिग्री सेल्सियस पर प्रीवार्म (और वैकल्पिक रूप से इसे ऑक्सीजन, चरण 2.5)
    नोट: हौसले से तैयार ASCF 1 दिन के लिए ठीक है । यदि कई दिनों से इसका उपयोग करने की योजना बना रहे हैं, तो ACSF को बाँझ फ़िल्टर करने की आवश्यकता है।
  4. लार्वा के बाद के संज्ञाहरण के लिए, आसुत पानी में डी-ट्यूबोकुरीन का 50 mm स्टॉक समाधान तैयार करें और समाधान को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और आवश्यकता होने तक फ्रीजर में 100 माइक्रोन एलिकॉट के रूप में।
  5. मछली को एम्बेड करने के लिए, 50 एमएल एएससीएफ में 1.25 ग्राम एलएम-एगर(सामग्री की तालिका)को भंग करके 2.5% कम पिघलने (एलएम) तैयार करें और तब तक उबालें जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, एलएम-एगर उठे की उच्च या कम सांद्रता का उपयोग प्रयोगात्मक सेट-अप के आधार पर किया जा सकता है। हालांकि, अगर एगर उठे भी नरम हैं, तो यह खोपड़ी खोलते समय मछली को स्थिति में नहीं पकड़ पाएगा।
  6. जमना से बचने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस वाटरबाथ पर एगरेज़ को स्टोर करें और क्योंकि यह तापमान एम्बेड करते समय लार्वा को भी नुकसान नहीं पहुंचाएगा। उबले हुए एगरॉज़ को वाटरबाथ में 37 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने के बाद, 10 माइक्रोन की कामकाजी एकाग्रता तक पहुंचने के लिए दिन के लिए आवश्यक एलिकोटेड एगर उठे में डी-ट्यूबोक्यूराइन की आवश्यक मात्रा जोड़ें। भविष्य के उपयोग के लिए, प्रदूषण से बचने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लेफ्ट-ओवर एगर को स्टोर करें।
  7. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ माइक्रोपिपेट खींचने वाले का उपयोग करके ग्लास केशिकाओं(पूरक चित्रा 1)से तेज और पतली कांच की सुई तैयार करें।
    1. पुलर I, केशिका प्रकार 1: हीट 1: 65.8; हीट 2: 55.1; 2-चरण खींच
      पुलर द्वितीय, केशिका प्रकार 2: हीट = 700; फिल = 4; वेल = 55; डेल = 130; पुल = 55; 1-कदम खींच।
      नोट: इकाइयां क्रमशः यहां उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक खींचक और ग्लास केशिका के लिए विशिष्ट हैं (सामग्री की तालिकादेखें)। कांच की सुइयों को तैयार करने के लिए अन्य केशिकाओं और पुलर्स का भी इस्तेमाल किया जा सकता है। लेकिन कांच की सुइयों को बहुत पतला नहीं होना चाहिए क्योंकि खोपड़ी के संपर्क में आने पर वे टूट सकते हैं। केशिका: लंबाई: 100 मिमी (4 इंच); ओडी: 1.5 मिमी; आईडी: 0.84 मिमी; फिलामेंट: हां

2. लार्वा की संज्ञाहरण और एम्बेडिंग की तैयारी

  1. दिन के लिए प्रयोग शुरू करते समय, प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ 90 मिमी व्यास पेट्री डिश में आवश्यक जानवरों को स्थानांतरित करें, जो या तो दानीऊ (लार्वा के लिए जो अभी भी दानीउ के साथ पेट्री डिश में रखे जाते हैं) या मछली सुविधा से पानी (लार्वा के लिए जो 7 डीपीएफ से अधिक पुराने हैं और मछली सुविधा में रखे जाते हैं)।
    1. 2 सप्ताह से अधिक उम्र की मछली को पाइपिंग करते समय, सुनिश्चित करें कि पिपेट का उद्घाटन काफी बड़ा है ताकि उन्हें स्थानांतरित करते समय मछली को घायल करने से बचा जा सके। नेट का उपयोग न करें क्योंकि यह शारीरिक रूप से विशेष रूप से छोटे लार्वा को नुकसान पहुंचाएगा।
  2. पेट्री डिश में रखे लार्वा के आकार के लिए अनुकूल रोटीफेरा या आर्टेमिया नॉपली जोड़ें, ताकि भोजन और लार्वा की अधिकतम स्वास्थ्य स्थिति सुनिश्चित की जा सके और तनाव को कम किया जा सके।
  3. एम्बेडिंग के लिए, चयनित लार्वा को एसीएसएफ से भरे 35 मिमी व्यास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। 10 माइक्रोन की एक कामकाजी एकाग्रता/प्रभावी खुराक तक पहुंचने के लिए डी-ट्यूबोकुरीन की आवश्यक मात्रा जोड़ें और कुछ मिनटों के लिए प्रतीक्षा करें जब तक कि लार्वा पूरी तरह से स्थिर न हो जाए11।
    नोट: जब मछली बड़ी हो जाती है या यदि एक तेजी से पूर्ण संज्ञाहरण (5 मिनट के तहत) की आवश्यकता होती है, तो डी-ट्यूबोकुरीन (चूहों के लिएएलडी 50 0.13 मिलीग्राम/किलो नसों में12)की एकाग्रता बढ़ाना संभव है। एक अलग एनेस्थेटिक का उपयोग करना भी संभव है, जैसे α-बंगारोटॉक्सिन (काम करने वाली एकाग्रता: 1 मिलीग्राम/एमएल), जिसका प्रभाव क्यूरे के समान होता है और मस्तिष्क को पूरी तरह से सक्रिय भी रखता है13। यदि ब्याज के विषय के लिए पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क आवश्यक नहीं है, तो गैर-घातक खुराक (0.02%) में ट्राइकेन लार्वा को पूरी तरह से एनेस्थेटाइज करने का विकल्प भी है। हालांकि, ट्राइकेन सोडियम-चैनलों को ब्लॉक करता है, जिससे मस्तिष्क गतिविधि14ख़राब हो जाती है।
  4. 35 मिमी व्यास पेट्री डिश का ढक्कन लेकर बढ़ते चैंबर को तैयार करें, ढक्कन को उल्टा करें, और ढक्कन के नीचे एक स्क्वायर ग्लास कवरलिप (24 x 24 मिमी) रखें। इन चरणों के एक योजनाबद्ध विवरण के लिए चित्रा 1 (ऊपरी भाग) देखें। कांच की चिकनी सतह एगर उठे ब्लॉक के दूर फिसलने से रोकती है, जिसमें खोपड़ी खोलने की प्रक्रिया के दौरान लार्वा होता है।
  5. एक उपयुक्त शीशी (जैसे, 50 एमएल ट्यूब, बीकर, शॉट बोतल, आदि) में दिन के लिए आवश्यक ACSF की मात्रा को अलीकोट करें और इसे कार्बोजन (5% सीओ2,95% ओ2)के साथ ऑक्सीजनेट करें। यदि इमेजिंग केवल आकृति विज्ञान (जैसे, फ्लोरेसेंस पैटर्न) ACSF अभी भी मस्तिष्क की अखंडता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है और कोशिकाओं को नकारात्मक रूप से ऑस्मोलैरिटी प्रभाव से प्रभावित नहीं कर रहे हैं, लेकिन ACSF के ऑक्सीजन की जरूरत नहीं है । यह कदम केवल तभी किया जाना चाहिए जब इमेजिंग के लिए पूर्ण मस्तिष्क गतिविधि आवश्यक हो।
    नोट: माध्यम के इष्टतम ऑक्सीजन संतृप्ति के लिए, कार्बोजन ट्यूब के अंत में एक एयर स्टोन जोड़ें। पर्याप्त रूप से उच्च ऑक्सीजन स्तर की गारंटी देने के लिए, इमेजिंग कक्षों में एसीएसएफ को हर 20-60 मिनट में ताजा ऑक्सीजनित एसीएसएफ के साथ एक्सचेंज करना आवश्यक है, जो एक ही इमेजिंग कक्ष में एम्बेडेड लार्वा की संख्या और उम्र के आधार पर (उदाहरण के लिए, हर घंटे एक एम्बेडेड लार्वा एसीएसएफ एक्सचेंज के लिए पर्याप्त है। समानांतर में एम्बेडेड 14 डीपीएफ से पुराने छह लार्वा के लिए, हर 20 मिनट में ACSF का आदान-प्रदान करना आवश्यक है) इसलिए नियोजित प्रयोग के अनुसार ऑक्सीजन संतृप्त ACSF की आवश्यक मात्रा की योजना बनाएं।

3. लार्वा का एम्बेडिंग

  1. पूरी तरह से एनेस्थेटाइज्ड लार्वा को प्लास्टिक पाश्चर पिपेट के साथ (चरण 2.4 में) तैयार बढ़ते कक्ष में स्थानांतरित करें। इसके बाद एलएम-एगरे को कमजोर करने से बचने के लिए अतिरिक्त माध्यम को सावधानी से निकाल दें। सभी निम्नलिखित चरणों को पर्याप्त आवर्धन के साथ स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत किया जाना चाहिए।
    नोट: बढ़ते कक्ष झुकाव पूरी तरह से माध्यम को दूर करने में मदद कर सकते हैं ।
  2. जानवरों को सूखने से बचाने और अनावश्यक तनाव को कम करने के लिए लार्वा (लगभग 1 मिलीएल, लार्वा के आकार के आधार पर) के शीर्ष पर पर्याप्त रूप से बड़े एलएम-एगरॉर्ज्ड ड्रॉप जोड़कर अगले चरण में तुरंत आगे बढ़ें।
  3. एगर उठे जमने से पहले स्थिति में लार्वा उन्मुख करें। सुनिश्चित करें कि लार्वा के पृष्ठीय भाग को ऊपर की ओर निर्देशित किया जाता है। इसके अलावा, लार्वा को यथासंभव एगर उठी की सतह के करीब एम्बेड करना सुनिश्चित करें।
    नोट: एक ही समय में एम्बेड करने की योजना बनाई लार्वा के आकार और संख्या के आधार पर, एगर उठे एकाग्रता को समायोजित करना संभव है। उदाहरण के लिए, 1-3 लार्वा के लिए जो 30 डीपीएफ पुराने हैं, 1.8%-2% एलएम-एगर उठे की एकाग्रता की सिफारिश की जाती है। 1-4 लार्वा जो 7 डीपीएफ पुराने हैं, 2.5% एलएम-एगर उठे का उपयोग करना सबसे व्यावहारिक है, जबकि 5-8 लार्वा के लिए, 2% अधिक अनुकूल है। यदि पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क की आवश्यकता होती है, तो लार्वा को संचालित करने के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए केवल एक ही समय में तीन मछली को एम्बेड करने की सिफारिश की जाती है। सामान्य तौर पर, लार्वा को प्राप्त करने वाले पुराने (1.8%-2%) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है या अधिक लार्वा को एक ही समय में एम्बेडेड करने की योजना बनाई जाती है।
  4. यदि छवियों को एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करके रिकॉर्ड किया जाएगा, तो लार्वा वाले एगरेग्मेंट ब्लॉक को एक छोटे क्यूबोइड आकार में ट्रिम करें। बाद में इमेजिंग चैंबर में लार्वा स्थानांतरित करने के लिए यह महत्वपूर्ण है। यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो इस तरह की ट्रिमिंग आवश्यक नहीं है, क्योंकि बढ़ते कक्ष का उपयोग इमेजिंग चैंबर के रूप में भी किया जा सकता है। चित्रा 1 (ऊपरी भाग) में, कोई भी इन चरणों का योजनाबद्ध विवरण पा सकता है।

4. मस्तिष्क को उजागर करना

नोट: लार्वा को अनावश्यक रूप से घायल न करने के लिए सभी निम्नलिखित चरणों को सबसे बड़ी सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। यदि प्रयोग के लिए पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क की आवश्यकता होती है, तो ध्यान रखें कि हर सेकंड के साथ गुजरता है, जबकि मछली अभी भी पूरी तरह से एगर उठे में घुड़सवार है और ऑक्सीजनयुक्त ACSF के बिना एक खुली खोपड़ी है, मस्तिष्क ऑक्सीजन की कमी से पीड़ित होगा और सूख भी जाएगा। ऑक्सीजन की कमी का प्रभाव और भी नाटकीय हो जाएगा, पुराने एम्बेडेड लार्वा हैं। इसलिए, न केवल कम से कम संभव समय के भीतर सर्जरी करना महत्वपूर्ण है, बल्कि सुई के साथ यांत्रिक मस्तिष्क क्षति पैदा नहीं करने के लिए अधिकतम परिशुद्धता के साथ भी। प्रशिक्षित होने पर, कदम 4.2-4.4 मछली प्रति 30 एस से अधिक नहीं लेना चाहिए।

  1. जैसे ही एगर उठे सर्जरी शुरू करें। सबसे पहले, सिर और एक स्पष्ट काम करने की जगह के लिए मुफ्त पहुंच प्राप्त करने के लिए ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र से ऊपर अतिरिक्त agarose के सभी दूर ट्रिम । यदि सिर का पृष्ठीय हिस्सा पहले से ही एगर उठे से चिपका हुआ है, तो इस चरण को छोड़ दें।
  2. ब्याज के क्षेत्र के आधार पर, सर्जरी के साथ शुरू करने के लिए एक जगह चुनें। कांच की सुई लें और त्वचा के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाएं लेकिन ऊतक में बहुत गहरी मर्मज्ञ के बिना। यह ओवरलेइंग त्वचा को छीलने के लिए प्रारंभिक बिंदु होगा।
    नोट: इष्टतम परिणामों के लिए, महत्वपूर्ण संरचनाओं को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करने के लिए ब्याज के क्षेत्र से सीधे ऊपर कभी न शुरू करें। यदि आवश्यक हो, तो हिंडब्रेन के पीछे भी शुरू करना संभव है और वहां से त्वचा के अवांछित क्षेत्र को छीलने तक आगे काम करते हैं।
  3. त्वचा के हिस्से के साथ बहुत छोटे कटौती के साथ जारी रखें मुश्किल से सतह के नीचे सुई चलती द्वारा हटाने के लिए लक्ष्य । अधिकांश समय मस्तिष्क के चारों ओर पूरी तरह से स्थानांतरित करना और त्वचा और खोपड़ी के सर्कल जैसे टुकड़े को काटना आवश्यक नहीं है, बल्कि सिर्फ सिर के साथ दो चीरे बनाते हैं और फिर त्वचा को एक या दूसरे पक्ष में धकेलते हैं। चित्रा 2 सेरिबैलम तक मुफ्त पहुंच प्राप्त करने के लिए इष्टतम काटने की रणनीति का एक योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है।
    नोट: यह माइक्रो सर्जरी एक नाजुक प्रक्रिया है और यह सबसे अधिक संभावना अंतर्निहित मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाए बिना त्वचा को पूरी तरह से हटाने के लिए कुछ प्रशिक्षण की आवश्यकता होगी । ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के लिए इष्टतम काटने की रणनीति का पता लगाने और प्रयोग की अवधि के लिए इसके साथ रहने की भी सिफारिश की जाती है।
  4. सभी एम्बेडेड लार्वा से त्वचा को हटाने के तुरंत बाद, अवांछित त्वचा कणों और रक्त को दूर करने और मस्तिष्क को पूरी तरह से सक्रिय रखने और इसे सूखने से बचाने के लिए एगरे पर (ऑक्सीजनयुक्त) ACSF डालकर आगे बढ़ें।
    नोट: यदि प्रयोग के लिए एक स्वस्थ मस्तिष्क की आवश्यकता है, तो एक समय में अधिकतम तीन मछलियों के लिए जाने की सिफारिश की जाती है।
  5. यदि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर रहे हैं, तो सीधे इमेजिंग के साथ शुरू करें।
    1. उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करते समय, क्यूबॉइड एगर उठे ब्लॉक (चरण 3.4) के नीचे एक छोटे से स्पैटुला को स्लाइड करें।
    2. इमेजिंग चैंबर (जैसे, ग्लास-बॉटम डिश) के नीचे एलएम-एगर उठी की एक छोटी सी बूंद जोड़ें और तुरंत 180 डिग्री के लिए स्पैटुला के साथ लार्वा युक्त एगर उठे ब्लॉक को फ्लिप करें और धीरे-धीरे इसे इमेजिंग चैंबर के नीचे धकेल दें, जबकि तरल एगर उठे ड्रॉप गोंद के रूप में कार्य करता है।
    3. जब agarose जम गया है, (ऑक्सीजनयुक्त) ACSF के साथ इमेजिंग चैंबर को भरने, तो इमेजिंग शुरू करते हैं । एक योजनाबद्ध विवरण के लिए चित्रा 1 (निचला हिस्सा) देखें।
  6. जब प्रयोग के लिए पूर्ण मस्तिष्क गतिविधि की आवश्यकता होती है, तो हमेशा यह सुनिश्चित करें कि इमेजिंग कक्ष में ACSF में पर्याप्त रूप से उच्च ऑक्सीजन स्तर हो। यह सुनिश्चित करने के लिए, हर 20-60 मिनट (मछली की संख्या और आकार, आकार और इमेजिंग चैंबर की सतह, और इमेजिंग अवधि) के आधार पर संभव होने पर हौसले से ऑक्सीजनित ACSF के साथ ध्यान से माध्यम का आदान-प्रदान करें।

Figure 1
चित्रा 1:एक स्टेपवाइज तरीके से वीवो इमेजिंग में खुली खोपड़ी जेब्राफिश की तैयारी के लिए योजनाबद्ध प्रक्रिया। विभिन्न चरणों के लिए काम करने के निर्देश ग्राफिक में ही पाए जा सकते हैं। फ्लोरियन हेट्सच द्वारा डिजाइन किया गया ग्राफिक और पॉल श्राम द्वारा अनुकूलित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सूक्ष्म सर्जरी का विस्तृत योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र के ऊपर त्वचा और खोपड़ी के टुकड़ों को हटाने के लिए किया जाता है। लाल घेरे उस स्थान को चिह्नित करता है जहां पहली कटौती किए जाने की आवश्यकता है। लाल-बिंदीदार रेखा सुई के साथ काटने के लिए इष्टतम पथ को चित्रित करती है ताकि इसे नुकसान पहुंचाए बिना सेरिबैलम तक मुफ्त पहुंच प्राप्त की जा सके। हरे तीर उस दिशा को चिह्नित करते हैं जिसमें अत्यधिक त्वचा और खोपड़ी के टुकड़ों को आसानी से दूर धकेला जा सकता है। पूरी प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों में प्रवेश कभी न करें। सफलतापूर्वक त्वचा को छीलने के बाद, ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र (यहां, सेरिबैलम) वीवो इमेजिंग में किसी भी प्रकार के उच्च-संकल्प के लिए स्वतंत्र रूप से सुलभ होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 3ए,ग ट्रांसजेनिक लाइन टीजी [-7.5Ca8: GFP] का 14 डीपीएफ लार्वा दिखाएंbz12[15] खोपड़ी के साथ अभी भी बरकरार है। ओवरलेइंग त्वचा में वर्णक कोशिकाओं को पूरे सिर पर वितरित किया जाता है और ब्याज के क्षेत्र में फ्लोरेसेंस सिग्नल के साथ हस्तक्षेप कर रहे हैं (यहां, सेरिबैलम)। इस स्थिति में लार्वा के साथ, मस्तिष्क की उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करना संभव नहीं है। चित्रा 3B खुली खोपड़ी सर्जरी करने के बाद एक ही ट्रांसजेनिक लाइन का लार्वा दिखाता है। ब्याज का क्षेत्र अब उत्तेजन लेजर और उत्सर्जित फ्लोरेसेंस प्रकाश के लिए स्वतंत्र रूप से सुलभ है ताकि बिखरे हुए और परिलक्षित होने के बिना ऊतक में प्रवेश किया जा सके। इस लार्वा के रिकॉर्ड किए गए चित्रों के परिणामस्वरूप विस्तृत उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां होंगी (चित्रा 3डी), एक अलग मस्तिष्क की छवियों के साथ तुलनीय है, लेकिन लाभ के साथ कि मस्तिष्क अभी भी पूरी तरह से सक्रिय है। इसके अतिरिक्त, मस्तिष्क किसी भी फ्लोरेसेंस तीव्रता को खो नहीं रहा है जो आम तौर पर पैरा-फॉर्मलडिहाइड के साथ निर्धारण के कारण होगा, जैसा कि एक निश्चित और निकाले गए मस्तिष्क के लिए मामला होगा। एक खुली खोपड़ी के साथ एक लार्वा में और, इसलिए, पूरी तरह से सक्रिय न्यूरॉन्स के साथ एक स्वतंत्र रूप से सुलभ मस्तिष्क, जो अभी भी सभी शारीरिक कनेक्शन को प्रस्तुत करता है और संवेदी प्रणाली से सामान्य इनपुट प्राप्त करता है, यह भी अल्पकालिक घटनाओं का निरीक्षण करना संभव होगा, उदाहरण के लिए, सिंप्टोजेनेसिस, रीढ़ की वृद्धि, dendritic/axonal प्रवास या स्थानीय mRNA अभिव्यक्ति16 शारीरिक परिस्थितियों में। इस विधि का एक और लाभ यह है कि त्वचा और खोपड़ी या रक्त मस्तिष्क बाधा के कारण होने वाली प्रसार समस्याओं के बिना जीवित लार्वा पर प्रभाव की जांच करने के लिए विभिन्न औषधीय पदार्थों के आवेदन के लिए अनुकूल है, जो आम तौर पर मस्तिष्क में प्रवेश करने के लिए पदार्थों को बाधित करेगा (चित्रा 3E). यह प्रदर्शित करने के लिए कि, एक खुली खोपड़ी के साथ 14 डीपीएफ लार्वा को 10 मिनट के लिए Hoechst-33342 (ACSF में 5 μg/mL) के साथ इनक्यूबेटेड किया गया था और फिर इमेजेड (चित्रा 3F-मैं). चित्रा 4A,, बी खोपड़ी खोलने से पहले और बाद में 30 डीपीएफ पुराने लार्वा दिखाएं। यह इस विधि के लिए अब तक का सबसे उन्नत टाइमपॉइंट परीक्षण किया गया है। यहां तक कि लार्वा के इस विकास स्तर पर, यहां वर्णित विधि का उपयोग करके एकल न्यूरॉन्स और उपकोशिकीय डिब्बों की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को प्राप्त करना संभव है (चित्रा 4C,, डी). इन 30 डीपीएफ पुराने लार्वा इमेजिंग के 1 घंटे के बाद गतिविधि घाटा नहीं दिखा रहे थे । इस विधि का उपयोग 30 डीपीएफ पुराने लार्वा के इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल पैच क्लैंप विश्लेषण के लिए भी किया जाता है और एक खुली खोपड़ी के साथ एम्बेडेड होने के पहले 60 मिनट के दौरान पुरकिंजे कोशिकाओं (अभी तक सतह के करीब कोशिकाएं नाजुक और कमजोर होती हैं) में न्यूरोनल गतिविधि के नुकसान के लिए कोई संकेत नहीं है। नियमित रूप से रक्त प्रवाह की मात्रा का निरीक्षण करके, यह सत्यापित करना संभव है कि लार्वा अभी भी स्वस्थ स्थिति में है। दीर्घकालिक छवि रिकॉर्डिंग के दौरान नियमित रूप से एसीएसएफ का आदान-प्रदान या ऑक्सीजन करके इस स्थिति को बनाए रखा जा सकता है। इसलिए यह मान्य करना काफी सरल है कि क्या एक लार्वा अभी भी कार्यात्मक मस्तिष्क अध्ययन के लिए अनुकूल है। यह साबित करने के लिए कि सूक्ष्म सर्जरी के दौरान कोई महत्वपूर्ण रक्त वाहिकाओं को क्षतिग्रस्त नहीं किया जाता है और यह भी दिखाना है कि यह विधि मस्तिष्क के ऊतकों में उत्तेजन लेजर प्रकाश के बहुत गहरे प्रवेश और फोटॉनों के प्रतिबिंब-कम उत्सर्जन की अनुमति देती है, ट्रांसजेनिक स्ट्रेन टीजी (flk1:mCherry) का 10 डीपीएफ पुराना लार्वाy206Tg17 इस विधि से विश्लेषण किया गया था। इन मछलियों में एंडोथेलियल कोशिकाओं में लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन रीचरी की अभिव्यक्ति के कारण मस्तिष्क में फ्लोरोसेंट वैक्यूलेचर होता है। गहराई में 245 माइक्रोन को कवर करने वाले छवि स्टैक का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण मध्य और हिंडब्रेन के माध्यम से रक्त वाहिकाओं के जटिल नेटवर्क का पता चलता है (चित्रा 5A). इसके अलावा, छवि स्टैक के गहराई मूल्यों की रंग कोडिंग दर्शाता है कि लगभग 250 माइक्रोन पर मस्तिष्क में गहराई से रक्त वाहिकाओं को भी स्पष्ट रूप से दिखाई और ट्रेस किया जाता है (चित्रा 5B). अनुपूरक वीडियो 1A पर्याप्त रक्त की आपूर्ति के साथ एक स्वस्थ मस्तिष्क से पता चलता है, जबकि अनुपूरक वीडियो 1B ACSF के आदान-प्रदान की कमी और मध्यम ऑक्सीजन की कमी के कारण समझौता रक्त प्रवाह के साथ एक मस्तिष्क से पता चलता है ।

Figure 3
चित्र 3:जेब्राफिश लार्वा में त्वचा छीलने वीवो ब्रेन इमेजिंग में इष्टतम पहुंच प्रदान करता है। 14 डीपीएफ पुराने ट्रांसजेनिक टीजी (-7.5ca8:GFP]bz12 लार्वा का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। क्रमशः 20x और 40x आवर्धन पर गैर-खुली(ए, सी)और त्वचा-खुली(बी, डी)नमूनों के मध्य और हिंडब्रेन का अवलोकन। उत्तरार्द्ध में, वर्णक की कमी स्पष्ट रूप से छवि की गुणवत्ता में सुधार करती है और सेरिबैलम में फ्लोरोसेंट पुरकिंजे कोशिकाओं की विस्तृत छवि रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देती है। सबसेलुलर इमेजिंग और मस्तिष्क के लिए यौगिक प्रशासन की आसानी को 10 मिनट इनक्यूबेशन की अवधि के साथ न्यूक्लिक एसिड फ्लोरोसेंट धुंधला के साथ प्रदर्शित किया जाता है जो होचस्ट-33342 (5 μg/mL ACSF में) का उपयोग कर रहा है। जबकि केवल त्वचा कोशिकाओं गैर खुली लार्वा(ई)में इस डाई को शामिल, उठाया त्वचा के साथ नमूने मस्तिष्क भर में अपने नाभिक की तीव्र लेबलिंग प्रदर्शित(एफ)GFP-फ्लोरोसेंट Purkinje न्यूरॉन्स(एच,विलय छवि मैंमें दिखाया गया है, 63x ऑप्टिकल और 4x डिजिटल आवर्धन) के व्यक्तिगत नाभिक(जी)की कल्पना के लिए अनुमति देता है । स्केल बार: ए-एफ: 100 माइक्रोन, जी-1: 5 माइक्रोन। लार्वा को उनके सिर के साथ बाईं ओर एम्बेडेड किया गया था, पृष्ठीय ऊपर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:त्वचा छीलने के लिए वीवो ब्रेन इमेजिंग में किशोर जेब्राफिश के लिए उपयोग का विस्तार । 30 डीपीएफ पुराने ट्रांसजेनिक टीजी (-7.5ca8:GFP]bz12Tg किशोरों का कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण। क्रमशः 10x (B) और 40x(C)और 63x ऑप्टिकल आवर्धन के साथ 10x(बी)और 63x ऑप्टिकलआवर्धन पर गैर-खुली(ए)और त्वचा के छिलके वाले नमूनों के मध्य और हिंडब्रेन पर अवलोकन करें। वर्णक त्वचा को हटाने से निरंतर सेरिबेलर पुरकिंजे सेल परत के सेलुलर संगठन के दृश्य और व्यक्तिगत न्यूरॉन्स(डी,सफेद तीर) के अनुमानों को चित्रित करने में सक्षम बनाता है। स्केल बार: ए-सी: 100 माइक्रोन, डी: 5 माइक्रोन। लार्वा को उनके सिर के साथ बाईं ओर एम्बेडेड किया गया था, पृष्ठीय ऊपर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:त्वचा हटाने के एक 10 dpf पुराने टीजी (flk1: mCherry)y206Tg ज़ेब्राफिश लार्वा में विस्तारित गहराई पर मस्तिष्क संवहनी पुनर्निर्माण की अनुमति देता है । (क)छवियों के ढेर का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण (245 माइक्रोन की कुल दूरी पर 1 माइक्रोन की मोटाई की 245 छवियां, 20x ऑप्टिकल आवर्धन) इन मस्तिष्क क्षेत्रों में रक्त वाहिकाओं का एक सतत नेटवर्क प्रदर्शित करता है। (ख)डेप्थ कलर कोडिंग से पता चलता है कि रक्त वाहिकाओं के इस नेटवर्क पर 200 माइक्रोन और उससे आगे की गहराई पर नजर रखी जा सकती है। ऑटोफ्लोरेसेंस और रिफ्लेक्शन को हटाने के लिए आंखें काले रंग से नकाबपोश थीं । स्केल बार: 100 माइक्रोन। लार्वा को उनके सिर के साथ बाईं ओर एम्बेडेड किया गया था, पृष्ठीय ऊपर है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक चित्र 1: कांच के केशिकाओं से बनी सुई। (क)दो सुई खींचने वालों से प्राप्त दो सुई प्रकार दिखाए जाते हैं । यह महत्वपूर्ण है कि टिप भी यह पर्याप्त स्थिरता के साथ प्रदान करने के लिए और त्वचा के संपर्क में आने पर उनके तोड़ने से बचने के लिए लंबे समय तक नहीं है/ अभी तक एक पर्याप्त तीखापन साफ किनारों के साथ कटौती करने के लिए अनुमति देने की जरूरत है । (ख)सुई खींचने वालों में भरी हुई केशिका की एक छवि दिखाई जाती है । स्केल बार 250 माइक्रोन है। केशिका की लंबाई: 100 मिमी; ओडी: 1.5 मिमी: आईडी: 0.84 मिमी; फिलामेंट: हां। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक वीडियो 1: इमेजिंग 7dpf पुराने लार्वा। (A)दिमाग के ऊपर की त्वचा को हटा दिए जाने के बाद 7 डीपीएफ पुराने लार्वा 10 मिनट से रियल टाइम मूवी रिकॉर्डिंग (30 एफपीएस) । ज्वलंत रक्त प्रवाह पर्याप्त रक्त आपूर्ति के साथ एक स्वस्थ राज्य को इंगित करता है। (ख)रियल टाइम मूवी रिकॉर्डिंग (30 एफपीएस) उसी 7 डीपीएफ पुराने लार्वा में दिखाया गया है, जो पूरक वीडियो 1ए में दिखाया गया है, जो एसीसीएफ के आदान-प्रदान और मध्यम ऑक्सीजन की कमी के बिना माइक्रोसर्जरी के बाद 2 घंटे है । स्केल बार: 100 माइक्रोन करें. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

प्रस्तुत विधि मस्तिष्क अलगाव या फार्मास्यूटिकल्स के साथ जेब्राफिश लार्वा के उपचार के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करती है जो वीवो वातावरण में न्यूरॉन्स की उच्च रिज़ॉल्यूशन छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए पिगमेंटेशन को बाधित करती है। इस विधि के साथ दर्ज छवियों की गुणवत्ता अभी तक प्राकृतिक परिस्थितियों में, explanted दिमाग से छवियों के बराबर है ।

इसके अलावा, फ्लोरेसेंस की तीव्रता में नुकसान से बचा जाता है, क्योंकि फिक्सेटिव्स18के साथ उपचार की कोई आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, यह विधि मस्तिष्क को अलग-थलग करने के रूप में आक्रामक नहीं है और इसमें केवल एक महत्वपूर्ण कदम होता है जो विफलता का कारण बन सकता है, इसलिए मस्तिष्क के निष्कासन की तुलना में सफल तैयारी की संभावना अधिक होती है। सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह विधि वीवो इमेज रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूल है। बशर्ते कि खोपड़ी खोलने ठीक, तेज और सफल प्रदर्शन किया है, और ACSF के ऑक्सीजन संतृप्ति नियमित रूप से निगरानी की है, मस्तिष्क पूरी तरह से कार्यात्मक और घंटे के लिए व्यवहार्य होना चाहिए । इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग, रक्त परिसंचरण, श्वास, और अतिरिक्त दिनों के लिए मछली के अस्तित्व के आधार पर, हम यह संभावना है कि त्वचा और खोपड़ी हटाने के समग्र स्वास्थ्य के लिए मुख्य रूप से हानिकारक नहीं है पर विचार करें । इस प्रकार, इस विधि का उपयोग छवि-परेशान पिगमेंटेशन के बिना स्वस्थ और कार्यात्मक मस्तिष्क में सेलुलर और उपकोशिकीय प्रक्रियाओं की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए किया जा सकता है। यह विधि हमारी प्रयोगशाला में वीवो में न्यूरोनल गतिविधि की इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग की जाने वाली एक मानक प्रक्रिया है और यह दुनिया भर की अन्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी प्रयोगशालाओं में भी अच्छी तरह से स्थापित है19,20,21,22,यह साबित करता है कि मस्तिष्क का कार्य सूक्ष्म-सर्जरी से बिगड़ा नहीं है। एक नुकसान जिसका उल्लेख करने की आवश्यकता है वह यह है कि यह दृष्टिकोण केवल पृष्ठीय और पार्श्व मस्तिष्क क्षेत्रों की इमेजिंग के लिए अनुकूल है और एक ही नमूने के साथ बार-बार प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है।

हालांकि, यदि प्रयोग के लिए पूरी तरह से कार्यात्मक मस्तिष्क आवश्यक है, तो ऑक्सीजन संतृप्ति की स्थायी रूप से निगरानी की जानी चाहिए, और यदि आवश्यक हो, तो इमेजिंग कक्ष में ACSF को हौसले से ऑक्सीजनयुक्त ACSF के साथ आदान-प्रदान किया जाना चाहिए। इसका मतलब यह है, दीर्घकालिक रिकॉर्डिंग के लिए, इमेजिंग-प्रक्रिया को परेशान किए बिना ऑक्सीजन-संतृप्त ACSF के साथ इस्तेमाल किए गए ACSF का आदान-प्रदान करने के लिए एक विकल्प की जरूरत है जिसे एक लघु पंप का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है।

ध्यान दें, यदि माइक्रो सर्जरी सही ढंग से या गलत तरीके से नहीं की जाती है, तो इससे मस्तिष्क की चोट या सेरेब्रल हेमरेज होगा जिसके परिणामस्वरूप मस्तिष्क शरीर विज्ञान समझौता हो जाएगा। इसके अलावा , एसीएसएफ में कम ऑक्सीजन संतृप्ति (पूरक वीडियो 1देखें ) या इस पूरी प्रक्रिया के दौरान लार्वा के लिए बहुत अधिक तनाव मस्तिष्क23,24को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है । इसलिए, यह विधि उच्च-थ्रूपुट विश्लेषण के लिए अनुकूल नहीं है, बल्कि प्रति समय बिंदु केवल कुछ लार्वा की देशांतर या अत्यधिक विस्तृत छवि रिकॉर्डिंग के लिए है। इसलिए, इस विधि को उच्च थ्रूपुट पर दवा स्क्रीनिंग के उद्देश्य से नहीं किया जाना चाहिए, लेकिन इसका उपयोग आशाजनक औषधीय यौगिकों को विस्तार से चित्रित या मान्य करने के लिए किया जा सकता है, जहां उच्च संकल्प इमेजिंग जानकारीपूर्ण और आवश्यक है। उचित मस्तिष्क स्वास्थ्य की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, प्रति परीक्षण तीन लार्वा की संख्या से अधिक नहीं होने की सिफारिश की जाती है।

खुली खोपड़ी के माध्यम से, रक्त-मस्तिष्क बाधा से गुजरने के लिए बिना मस्तिष्क के ऊतकों पर सीधे पदार्थों को लागू करना भी संभव है। कुल मिलाकर, यहां वर्णित विधि - वर्तमान में वीवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में लागू - वीवो ब्रेन इमेजिंग और जेब्राफिश लार्वा और किशोरों में ऑप्टोजेनेटिक्स के बहुत व्यापक क्षेत्र में उच्च क्षमता वाली तकनीक है और इसे न्यूरोफार्मामोलॉजिकल दृष्टिकोणों के साथ जोड़ा जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम विशेष रूप से उत्कृष्ट पशु देखभाल और हरमन Döring, मोहंमद एल्से, सोल मुद्रा-Méndez, जैकब वॉन Trotha, कोमली Valishetti और बारबरा शीतकालीन उनके सहायक समर्थन के लिए के लिए Timo Fritsch शुक्रिया अदा करते हैं । हम उनकी प्रतिक्रिया के लिए कोस्टर लैब के अन्य सभी सदस्यों के आभारी भी हैं। इस परियोजना को जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, KO1949/7-2) परियोजना 241961032 (आरडब्ल्यूएके लिए) और बुंडेमिनिस्ट्रियम फ्यूर बिलडुंग एंड फोर्स्चुंग (बीएमबीएफ) द्वारा वित्त पोषित किया गया था; युग-नेट न्यूरॉन द्वितीय CIPRESS परियोजना 01EW1520 जेसीएम के लिए) स्वीकार किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Calcium chloride Roth A119.1
Confocal Laser scanning microscope Leica TCS SP8
d-Glucose Sigma G8270-1KG
d-Tubocurare Sigma-Aldrich T2379-100MG
Glass Capillary type 1 WPI 1B150F-4
Glass Capillary type 2 Harvard Apparatus GC100F-10
Glass Coverslip deltalab D102424
HEPES Roth 9105.4
Hoechst 33342 Invitrogen (Thermo Fischer) H3570
Imaging chamber Ibidi 81156
Potassium chloride Normapur 26764298
LM-Agarose Condalab 8050.55
Magnesium chloride (Hexahydrate) Roth A537.4
Microscope Camera Leica DFC9000 GTC
Needle-Puller type 1 NARISHIGE Model PC-10
Needle-Puller type 2 Sutter Instruments Model P-2000
Pasteur-Pipettes 3ml A.Hartenstein 20170718
Sodium chloride Roth P029.2
Sodium hydroxide Normapur 28244262
Tricain Sigma-Aldrich E10521-50G
Waterbath Phoenix Instrument WB-12
35 mm petri dish Sarstedt 833900
90 mm petri dish Sarstedt 821473001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
  2. Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
  3. Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
  4. Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
  5. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
  6. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
  7. Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
  8. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  9. White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
  10. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
  11. Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
  12. Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
  13. Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
  14. Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
  15. Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
  16. Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
  17. Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
  18. Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
  19. Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
  20. Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
  21. Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
  22. Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
  23. Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
  24. Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).

Tags

न्यूरोसाइंस अंक 168 जेब्राफिश डैनियो रेरियो,वीवो इमेजिंग माइक्रो सर्जरी ओपन खोपड़ी सेरिबैलम न्यूरॉन्स पुरकिंजे कोशिकाओं मस्तिष्क पिगमेंटेशन में
जाग ज़ेब्राफिश लार्वा और खोपड़ी और त्वचा हटाने द्वारा किशोरों में पूरी तरह से सक्रिय मस्तिष्क ऊतक के वीवो इमेजिंग में
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J.… More

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Köster, R. W. In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal. J. Vis. Exp. (168), e62166, doi:10.3791/62166 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter