Summary
Her presenterer vi en metode for å avbilde sebrafisk embryonal hjerne in vivo upto larval og juvenile stadier. Denne mikroinvasive prosedyren, tilpasset elektrofysiologiske tilnærminger, gir tilgang til cellulære og subcellulære detaljer om moden nevron og kan kombineres med optogenetikk og nevrofarmakologiske studier for karakterisering av hjernefunksjon og legemiddelintervensjon.
Abstract
Å forstå de flyktige endringene som oppstår under hjerneutvikling og modning krever detaljert høyoppløselig avbildning i rom og tid ved cellulær og subcellulær oppløsning. Fremskritt innen molekylære og avbildningsteknologier har gjort det mulig for oss å få mange detaljerte innsikter i cellulære og molekylære mekanismer for hjerneutvikling i det gjennomsiktige sebrafiskembryoet. Nylig har prosesser for raffinering av nevronforbindelse som oppstår på senere larvestadier flere uker etter befruktning, som for eksempel er kontroll over sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsdrevet oppførsel, beveget seg i fokus for forskning. På disse stadiene forstyrrer pigmentering av sebrafiskhuden lysinntrengning i hjernevev, og løsninger for embryonale stadier, for eksempel farmakologisk hemming av pigmentering, er ikke mulig lenger.
Derfor er en minimalt invasiv kirurgisk løsning for mikroskopitilgang til hjernen til våken sebrafisk gitt som er avledet fra elektrofysiologiske tilnærminger. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, og utsetter underliggende nevroner og axonale trakter uten skade. Dette gjør det mulig å registrere nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, og observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser. I tillegg er avhør av disse prosessene ved hjelp av farmakologisk inhibering eller optogenetisk manipulasjon mulig. Denne hjerneeksponeringsmetoden gir informasjon om strukturelle og fysiologiske endringer i nevroner, samt korrelasjon og gjensidig avhengighet av disse hendelsene i levende hjernevev i løpet av minutter eller timer. Teknikken er egnet for in vivo hjerneavbildning av sebrafisk larver opptil 30 dager etter befruktning, det siste utviklingsstadiet testet så langt. Det gir dermed tilgang til slike viktige spørsmål som synaptisk raffinement og skalering, axonal og dendritisk transport, synaptisk målretting av cytoskeletal last eller lokalt aktivitetsavhengig uttrykk. Derfor kan en bred bruk for denne monterings- og bildemetoden forventes.
Introduction
I løpet av de siste tiårene har sebrafisken (Danio rerio) utviklet seg som en av de mest populære virveldyrmodellorganismer for embryonale og larveutviklingsstudier. Den store fecundity av sebrafisk kvinner kombinert med den raske ex utero utviklingen av embryoet og dets gjennomsiktighet i tidlige embryonale utviklingsstadier er bare noen få nøkkelfaktorer som gjør sebrafisk til en kraftig modellorganisme for å kle opp utviklingsspørsmål1. Fremskritt innen molekylær genetisk teknologi kombinert med høyoppløselige in vivo-avbildningsstudier tillatt for å adressere cellebiologiske mekanismer som ligger til grunn for utviklingsprosesser2. Spesielt innen nevronal differensiering, fysiologi, tilkobling og funksjon har sebrafisk kastet lys over samspillet mellom molekylær dynamikk, hjernefunksjoner og organismisk oppførsel i enestående detalj.
Likevel er de fleste av disse studiene begrenset til embryonale og tidlige larvestadier i løpet av den første uken av utviklingen, da gjennomsiktigheten av nervesystemvevet gradvis går tapt. På disse stadiene forhindres hjernevev fra tilgang ved høyoppløselige mikroskopi tilnærminger blir skjermet av hodeskalledifferensiering og pigmentering3.
Derfor er viktige spørsmål om nevronal differensiering, modning og plastisitet som raffinement av nevrontilkobling eller synaptisk skalering vanskelig å studere. Disse cellulære prosessene er viktige for å definere cellulære mekanismer som driver, for eksempel sosial atferd, beslutningstaking eller motivasjonsbasert oppførsel, områder som sebrafiskforskning på flere uker gamle larver nylig har bidratt med viktige funn basert på atferdsstudier4.
Farmakologiske tilnærminger for å hemme pigmentering i sebrafisk larver i flere uker er knapt mulig eller kan til og med forårsake skadelige effekter5,6,7,8. Doble eller tredoble mutantstammer med spesifikke pigmenteringsfeil, som casper9 eller krystall10, har blitt enormt verdifulle verktøy, men er arbeidskrevende i avl, gir få avkom og utgjør faren for å akkumulere genetiske misdannelser på grunn av overdreven innavl.
Her er en minimal invasiv prosedyre som et alternativ gitt som gjelder for enhver sebrafiskstamme. Denne prosedyren ble tilpasset fra elektrofysiologiske studier for å registrere nevronal aktivitet i levende og våken sebrafisk larver. I teleoster kan hud og myk hodeskallebrusk forsiktig fjernes ved mikroskalling av disse lagene, fordi de ikke er tett vevd sammen med hjernens vaskulatur. Dette gjør det mulig å eksponere hjernevev som inneholder nevroner og axonale trakter uten skade og for registrering av nevronal morfologi, inkludert synaptiske strukturer og deres molekylære innhold, som igjen inkluderer observasjon av fysiologiske endringer som Ca2 + transienter eller intracellulære transporthendelser i opptil flere timer. Videre, utover beskrivende karakteriseringer, muliggjør direkte tilgang til hjernevev forhør av modne nevronfunksjoner ved hjelp av nevrofarmakologisk substansadministrasjon og optogenetiske tilnærminger. Derfor kan ekte strukturfunksjonsrelasjoner avsløres i den juvenile sebrafiskhjernen ved hjelp av denne hjerneeksponeringsstrategien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt dyrearbeid som er beskrevet her er i samsvar med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63). Vedlikehold og håndtering av fisk er godkjent av lokale myndigheter og av dyrevelferdsrepresentanten for Technische Universität Braunschweig.
1. Fremstilling av kunstig cerebro spinalvæske (ACSF), lav smeltende agarose og skarpe glassnåler
- Forbered ACSF ved å oppløse de oppførte kjemikaliene ved å følge konsentrasjoner i destillert vann. 134 mM NaCl (58,44 g/mol), 2,9 mM KCl (74,55 g/m/m), 2,1 mM CaCl2 (110,99 g/mol), 1,2 mM MgCl2 6x H2O (203,3 g/mol), 10 mM HEPES (238,31 g/mol) og 10 mM d-glukose (180,16 g/mol).
MERK: For MgCl2, CaCl2og KCl fremstilles 1 M lagerløsninger i avsaltet sterilt vann og lagres ved 4 °C for senere tilberedning av fersk ACSF. Glukose, HEPES og NaCl oppløses som faste forbindelser i den ferske ACSF-løsningen. Følg produsentens anvisninger for å løse opp kjemikalier. - Juster pH på ACSF til 7,8 med 10 M NaOH. Forberedelse av ACSF krever presis måling av kjemikalier og finjustering av pH da det erstatter cerebro spinalvæsken og opprettholder de fysiologiske forholdene som kreves for at nevroner skal være fullt funksjonelle, ellers kan det føre til hjernefeil og nevronal død.
- Oppbevar den nylagde ACSF ved 4 °C i maksimalt 4 uker. For arbeidsforhold, aliquot det nødvendige volumet av ACSF for dagen / eksperimentet og førkrig ved 25-28 °C (og eventuelt oksygenere det, trinn 2.5)
MERK: Nylaget ASCF er greit i 1 dag. Hvis du planlegger å bruke den over flere dager, må ACSF filtreres sterilt. - For senere anestesi av larver, lag en 50 mM lagerløsning av d-Tubocurarine i destillert vann og lagre løsningen ved -20 °C som 100 μL aliquots i fryseren til det er nødvendig.
- For å legge inn fisken, lag 2,5% lavsmelting (LM) agarose ved å oppløse 1,25 g LM-agarose (Tabell over materialer) i 50 ml ACSF og kok til agarose er helt oppløst.
MERK: Alternativt kan høyere eller lavere konsentrasjoner av LM-agarose brukes avhengig av det eksperimentelle oppsettet. Men hvis agarose er for myk, vil den ikke kunne holde fisken på plass når du åpner skallen. - Oppbevar agarose ved 37 °C vannbad, for å unngå størkning, og fordi denne temperaturen heller ikke vil skade larvene ved innbygging. Etter at den kokte agarose er avkjølt ned til 37 °C i vannbadet, tilsett den nødvendige mengden d-Tubocurarine til den alisiterte agaroseen som trengs for at dagen skal nå en arbeidskonsentrasjon på 10 μM. For fremtidig bruk, oppbevar den venstre agarose ved 4 °C for å unngå forurensning.
- Forbered skarpe og tynne glassnåler fra glasskapillærer (Tilleggsfigur 1) ved hjelp av en mikropipettetrekker med følgende innstillinger.
- Puller I, Kapillær type 1: Varme 1: 65,8; Varme 2: 55.1; 2-trinns trekking
Puller II, Kapillær type 2: Varme = 700; Fil = 4; Vel = 55; DEL = 130; = 55; 1-trinns trekking.
MERK: Enhetene er spesifikke for henholdsvis hver puller og glasskapillær som brukes her (se Materialtabell). Andre kapillærer og trekkere kan også brukes til å forberede glassnålene. Men glassnålene bør ikke være for tynne, da de kan bryte når de kommer i kontakt med skallen. Kapillær: lengde: 100 mm (4 tommer); OD: 1,5 mm; ID: 0,84 mm; filament: Ja
- Puller I, Kapillær type 1: Varme 1: 65,8; Varme 2: 55.1; 2-trinns trekking
2. Anestesi av larver og preparater for innebygging
- Når du starter eksperimentet for dagen, overfør dyrene som trengs med en plast Pasteur pipette til en 90 mm diameter Petri-tallerken, som er fylt med enten Danieau (for larver som fortsatt holdes i en Petri-tallerken med Danieau) eller vann fra fiskeanlegget (for larver som er eldre enn 7 dpf og holdes i fiskeanlegget).
- Ved pipettering av fisk eldre enn 2 uker, sørg for at åpningen av pipetten er stor nok til å unngå å skade fisken når du overfører dem. Ikke bruk et nett fordi det vil fysisk skade spesielt de yngre larver.
- Tilsett rotifera eller artemia nauplii egnet for størrelsen på larvene som holdes i Petri-parabolen, for å sikre fri tilgang til mat og maksimal helsestatus for larver og for å redusere stress.
- For innebygging, overfør de valgte larver til en 35 mm diameter Petri-tallerken fylt med ACSF. Tilsett det nødvendige volumet av d-Tubocurarine for å nå en arbeidskonsentrasjon / effektiv dose på 10 μM og vent i noen minutter til larvene er helt immobiliserte11.
MERK: Når fisken blir eldre eller hvis en raskere full anestesi er nødvendig (under 5 min), er det mulig å øke konsentrasjonen av d-Tubocurarine (LD50 for mus er 0,13 mg / kg intravenøst12). Det er også mulig å bruke et annet bedøvelsesmiddel, for eksempel α-bungarotoxin (arbeidskonsentrasjon: 1 mg / ml), som har samme effekt som curare og også holder hjernen fullt aktiv13. Hvis en fullt aktiv hjerne ikke er nødvendig for emnet av interesse, er Tricaine i en ikke-dødelig dose (0,02%) også et alternativ for å bedøve larver fullt ut. Tricaine blokkerer imidlertid natriumkanaler, og dermed svekker hjerneaktiviteten14. - Forbered monteringskammeret ved å ta lokket på Petri-parabolen med 35 mm diameter, snu lokket opp ned og legg en firkantet glassdeksle (24 x 24 mm) på undersiden av lokket. Se figur 1 (øvre del) hvis du vil ha en skjematisk beskrivelse av disse trinnene. Glassets glattere overflate forhindrer at den glir bort fra agaroseblokken, som inneholder larver under skallens åpningsprosedyre.
- Aliquot mengden ACSF som trengs for dagen i et passende hetteglass (f.eks. 50 ml rør, beger, Schott-flaske, etc.) og oksygener det med karbogen (5% CO2,95% O2). Hvis avbildning bare morphology (f.eks fluorescens mønstre) ACSF er fortsatt nødvendig for å sikre integriteten til hjernen og at celler ikke er negativt påvirket av osmolaritet effekter, men oksygenering av ACSF er ikke nødvendig. Dette trinnet trenger bare å utføres når full hjerneaktivitet er nødvendig for avbildning.
MERK: For optimal oksygenmetning av mediet, tilsett en luftstein i enden av karbogenrøret. For å garantere et tilstrekkelig høyt oksygennivå, er det nødvendig å bytte ACSF i bildekamrene med fersk oksygenert ACSF hver 20-60 min, avhengig av antall og alder av larver innebygd i samme bildekammer (f.eks. for en enkelt innebygd larve ACSF-utveksling hver time er tilstrekkelig. For seks larver eldre enn 14 dpf innebygd parallelt, er det nødvendig å utveksle ACSF hver 20 min) så planlegg den nødvendige mengden oksygenmettet ACSF i henhold til det planlagte eksperimentet.
3. Innebygging av larver
- Overfør de fullt bedøvede larver med en plast Pasteur pipette til (i trinn 2.4) forberedt monteringskammer. Fjern deretter overflødig medium forsiktig for å unngå fortynning av LM-agarose. Alle følgende trinn skal utføres under et stereomikroskop med tilstrekkelig forstørrelse.
MERK: Ved å vippe monteringskammeret kan det bidra til å fjerne mediet helt. - Fortsett umiddelbart til neste trinn, ved å legge til en tilstrekkelig stor LM-agarose dråpe på toppen av larver (ca. 1 ml, avhengig av larvens størrelse) for å beskytte dyrene mot uttørking og for å redusere unødvendig stress.
- Orienter larvene på plass før agarose størkner. Forsikre deg om at larvenes dorsale del er rettet oppover. Sørg også for å legge inn larver så nær overflaten av agarose som mulig.
MERK: Avhengig av størrelsen og antall larver som er planlagt å legge inn samtidig, er det mulig å justere agarosekonsentrasjonen. For eksempel, for 1-3 larver som er 30 dpf gamle, anbefales en konsentrasjon på 1,8%-2% LM-agarose. For 1-4 larver som er 7 dpf gamle, er det mest praktisk å bruke 2,5% LM-agarose, mens for 5-8 larver er 2% mer egnet. Hvis en fullt aktiv hjerne er nødvendig, anbefales det å bare legge inn tre fisk samtidig for å redusere tiden som trengs for å betjene larver. Generelt anbefales det å bruke lavere konsentrasjoner (1,8%-2%) jo eldre larvene blir eller jo flere larver er planlagt å bli innebygd samtidig. - Hvis bilder vil bli tatt opp ved hjelp av et invertert mikroskop, trim agaroseblokken som inneholder larver i en liten cuboid form. Dette er viktig for å overføre larver til bildekammeret senere. Hvis du bruker et oppreist mikroskop, er det ikke nødvendig med slik trimning, fordi monteringskammeret også kan brukes som bildekammer. I figur 1 (øvre del) finner man en skjematisk beskrivelse av disse trinnene.
4. Utsette hjernen
MERK: Alle følgende trinn bør utføres med største forsiktighet for ikke unødvendig å skade larver. Hvis en fullt aktiv hjerne er nødvendig for eksperimentet, husk at med hvert sekund som går, mens fisken fortsatt er fullt montert i agarose og har en åpen skalle uten oksygenert ACSF, vil hjernen lide av mangel på oksygen og også tørke ut. Effekten av oksygenmangel vil bli enda mer dramatisk, jo eldre er de innebygde larver. Derfor er det viktig å utføre operasjonen ikke bare innen kortest mulig tid, men også med maksimal presisjon for ikke å fremkalle mekanisk hjerneskade med nålen. Når du er trent, bør trinn 4.2-4.4 ikke ta mer enn 30 s per fisk.
- Start operasjonen så snart agarose har størknet. Trim først bort alt overskuddet som oppsto over hjerneregionen av interesse for å få fri tilgang til hodet og et klart arbeidsområde. Hvis den dorsale delen av hodet allerede stikker ut av agarose, hopp over dette trinnet.
- Avhengig av interesseområdet, velg et sted å begynne med operasjonen. Ta glassnålen og lag et lite snitt gjennom huden, men uten å trenge for dypt inn i vevet. Dette vil være utgangspunktet for å skrelle bort den overliggende huden.
MERK: For optimale resultater må du aldri starte rett over interesseområdet for å redusere risikoen for å skade viktige strukturer. Om nødvendig er det mulig å til og med starte bakre til hindbrain og derfra jobbe fremover til det uønskede hudområdet er skrelt bort. - Fortsett med svært små kutt langs den delen av huden som tar sikte på å fjerne ved knapt å bevege nålen like under overflaten. Mesteparten av tiden er det ikke nødvendig å bevege seg helt rundt hjernen og kutte ut et sirkellignende stykke hud og hodeskalle, men heller bare lage to snitt langs hodet og deretter skyve huden bort til den ene eller den andre siden. Figur 2 viser en skjematisk fremstilling av den optimale skjærestrategien for å få fri tilgang til cerebellum.
MERK: Denne mikrooperasjonen er en delikat prosedyre, og det vil mest sannsynlig trenge litt trening for å fjerne huden perfekt uten å skade den underliggende hjernen. Det anbefales også å finne ut den optimale skjærestrategien for hjerneregionen av interesse og holde seg til den i løpet av eksperimentet. - Umiddelbart etter å ha fjernet huden fra alle innebygde larver, fortsett ved å helle (oksygenert) ACSF over agarose for å oversvømme uønskede hudpartikler og blod og for å holde hjernen fullt aktiv og beskytte den mot uttørking.
MERK: Hvis en sunn hjerne er nødvendig for eksperimentet, anbefales det å gå for maksimalt tre fisk om gangen. - Hvis du bruker et oppreist mikroskop, start direkte med avbildning.
- Når du bruker et invertert mikroskop, skyver du en liten slikkepott under den cuboid agarose blokken (trinn 3.4).
- Tilsett en liten dråpe LM-agarose på bunnen av bildekammeret (f.eks. glassbunnsfat) og vend umiddelbart agaroseblokken som inneholder larver med slikkepotten i 180° og skyv den forsiktig til bunnen av bildekammeret, mens væskeagarosedråpen fungerer som lim.
- Når agarose har størknet, fyll opp bildekammeret med (oksygenert) ACSF, og begynn deretter avbildningen. Se figur 1 (nedre del) for en skjematisk beskrivelse.
- Når full hjerneaktivitet er nødvendig for eksperimentet, må du alltid sørge for at ACSF i bildekammeret har et tilstrekkelig høyt oksygennivå. For å sikre dette, bytt mediet forsiktig med fersk oksygenert ACSF når det er mulig hver 20-60 min (avhengig av antall og størrelse på fisken, størrelsen og overflaten av bildekammeret og bildebehandlingsvarigheten).
Figur 1: Skjematisk prosedyre for fremstilling av åpen hodeskalle sebrafisk for in vivo avbildning på en trinnvis måte. Arbeidsinstruksjonene for de forskjellige trinnene finner du i selve grafikken. Grafikk designet av Florian Hetsch og tilpasset av Paul Schramm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Detaljert skjematisk fremstilling av mikrokirurgien som utføres for å fjerne hudstykker og hodeskaller over hjerneregionen av interesse. Den røde sirkelen markerer stedet der det første kuttet må gjøres. Den rødprikkede linjen avgrenser den optimale banen for å kutte sammen med nålen for å få fri tilgang til cerebellum uten å skade den. Den grønne pilen markerer retningen der overdreven hud og hodeskallestykker lett kan skyves bort. Pass på at du aldri trenger inn i hjernevevet under hele prosedyren. Etter vellykket peeling bort huden, hjerneregionen av interesse (her, cerebellum) vil være fritt tilgjengelig for noen form for høyoppløselig in vivo avbildning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3A,C vise en 14 dpf larve av den transgene linjen Tg[-7.5Ca8:GFP]bz12[15] med skallen fortsatt intakt. Pigmentcellene i overleggshuden fordeles over hele hodet og forstyrrer fluorescenssignalet i interesseområdet (her cerebellum). Med larven i denne tilstanden er det ikke mulig å oppnå høyoppløselige bilder av hjernen. Figur 3B viser en larve av samme transgene linje etter å ha utført den åpne skalleoperasjonen. Interesseområdet er nå fritt tilgjengelig for eksitasjonslaseren og avgitt fluorescenslys for å trenge inn i vevet uten å bli spredt og reflektert. Bilder tatt av denne larven vil resultere i detaljerte høyoppløselige bilder (Figur 3D), sammenlignbar med bilder av en isolert hjerne, men med den fordelen at hjernen fortsatt er fullt aktiv. I tillegg mister hjernen ingen fluorescensintensitet som normalt ville være forårsaket av fiksering med para-formaldehyd, som det ville være tilfelle for en fast og utplantet hjerne. I en larve med en åpen hodeskalle og derfor en fritt tilgjengelig hjerne med fullt aktive nevroner, som fortsatt utgjør alle fysiologiske forbindelser og mottar normale innspill fra det sensoriske systemet, vil det også være mulig å observere kortsiktige hendelser, for eksempel synaptogenesis, ryggradsvekst, dendritisk / axonal migrasjon eller lokalt mRNA-uttrykk.16 under fysiologiske forhold. En annen fordel med denne metoden er at den er egnet for bruk av forskjellige farmakologiske stoffer for å undersøke effektene på den levende larven uten diffusjonsproblemene forårsaket av hud og hodeskalle eller blodhjernebarrieren, noe som normalt ville hindre stoffer å trenge inn i hjernen (Figur 3E). For å demonstrere det ble en 14 dpf larve med en åpen skalle inkubert med Hoechst-33342 (5 μg / ml i ACSF) i 10 minutter og deretter avbildet (Figur 3F-Jeg). Figur 4A,B vis 30 dpf gamle larver før og etter åpning av skallen. Det er det mest avanserte tidspunktet som er testet så langt for denne metoden. Selv på dette utviklingsstadiet av larven er det mulig å oppnå høyoppløselige bilder av enkle nevroner og også subcellulære rom ved hjelp av metoden beskrevet her (Figur 4C,D). Disse 30 dpf gamle larver viste ikke aktivitetsunderskudd etter 1 t bildebehandling. Denne metoden brukes også til elektrofysiologisk patch clamp analyse av 30 dpf gamle larver, og det er ingen tegn til tap av nevronaktivitet i Purkinje-celler (men celler nær overflaten er delikate og sårbare) i løpet av de første 60 min av å være innebygd med en åpen skalle. Ved regelmessig å inspisere mengden blodstrøm, er det mulig å validere at larven fortsatt er i en sunn status. Denne statusen kan opprettholdes ved regelmessig utveksling eller oksygenering av ACSF under langvarig bildeopptak. Det er derfor ganske enkelt å validere om en larve fortsatt er egnet for funksjonelle hjernestudier. For å bevise at ingen viktige blodkar er skadet under mikrokirurgien og også for å vise at denne metoden tillater mye dypere penetrasjon av eksitasjonslaserlyset i hjernevev og refleksjonsreduserende utslipp av fotoner, en 10 dpf gammel larve av den transgene stammen Tg (flk1:mCherry)y206Tg17 ble analysert ved hjelp av denne metoden. Disse fiskene inneholder en fluorescerende vaskulatur i hjernen på grunn av uttrykket av det røde fluorescerende proteinet mCherry i endotelceller. En maksimal intensitetsprojeksjon av en bildestabel som dekker 245 μm i dybden avslører det intrikate nettverket av blodkarene som bukter seg gjennom midt- og bakbrain (Figur 5A). Videre viser fargekoding av dybdeverdier i bildestakken at selv blodkar dypt burried i hjernen på nesten 250 μm er tydelig synlige og sporbare (Figur 5B). Supplerende video 1A viser en sunn hjerne med tilstrekkelig blodtilførsel, mens Supplerende video 1B viser en hjerne med kompromittert blodstrøm på grunn av mangel på utveksling av ACSF og mangel på middels oksygenering.
Figur 3: Hudskalling i sebrafisklarver gir optimal tilgang for in vivo hjerneavbildning. Confocal mikroskopi analyse av 14 dpf gamle transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12 larver. Oversikt over midt- og bakbrain av ikke-skrellede (A, C) og hudskallede (B,D) prøver ved henholdsvis 20x og 40x forstørrelse. I sistnevnte forbedrer mangelen på pigment tydelig bildekvaliteten og gir mulighet for detaljert bildeopptak av fluorescerende Purkinje-celler i cerebellum. Subcellulær avbildning og enkel sammensatt administrering til hjernen er demonstrert ved en 10 min inkubasjonsperiode med nukleinsyre fluorescerende farging ved hjelp av Hoechst-33342 (5 μg / ml i ACSF). Mens bare hudceller inkorporerer dette fargestoffet i ikke-skrellede larver (E), viser prøver med løftet hud intens merking av kjernene i hele hjernen (F) som gjør det mulig å visualisere individuelle kjerner (G) av GFP-fluorescerende Purkinje-nevroner (H, fusjonert bilde vist i I, 63x optisk og 4x digital forstørrelse). Skalastenger: A-F: 100 μm, G-I: 5 μm. Larver ble innebygd med hodet til venstre, dorsal er oppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Hudavskalling utvider tilgangen for in vivo hjerneavbildning til juvenil sebrafisk. Confocal mikroskopi analyse av 30 dpf gamle transgene Tg(-7.5ca8:GFP]bz12Tg ungdommer. Oversikt over mellom- og bakbrain av ikke-skrellede (A) og hudskallede prøver ved henholdsvis 10x (B) og 40x (C) og 63x optisk forstørrelse med henholdsvis 4x digital zoom (D). Fjerning av pigmentert hud muliggjør visualisering av cellulær organisering av det kontinuerlige cerebellar Purkinje cellelaget og å skildre projeksjoner av individuelle nevroner (D, hvite piler). Skalastenger: A-C: 100 μm, D: 5 μm. Larver ble innebygd med hodet til venstre, dorsal er oppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hudfjerning tillater rekonstruksjon av hjernevaskulatur ved utvidet dybde i en 10 dpf gammel Tg(flk1:mCherry)y206Tg sebrafisklarve. (A) Maksimal intensitetsprojeksjon av en stabel med bilder (245 bilder av en tykkelse på 1 μm i total avstand på 245 μm, 20x optisk forstørrelse) viser et kontinuerlig nettverk av blodkar i disse hjerneområdene. (B) Dybdefargekoding viser at dette nettverket av blodårer kan overvåkes i dybden på 200 μm og utover. For å fjerne autofluorescence og refleksjon ble øynene maskert av svart farge. Skala bar: 100 μm. Larver ble innebygd med hodet til venstre, dorsal er oppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Nåler laget av glasskapillærer. (A) To nåletyper hentet fra to forskjellige nåletrekkere vises. Det er viktig at spissen ikke er for lang til å gi den tilstrekkelig stabilitet og unngå at de brekker når de kommer i kontakt med huden/skallen. Likevel er det nødvendig med tilstrekkelig skarphet for å tillate kutt med rene kanter. (B) Et bilde av kapillæren som er lastet inn i nåletrekkerne, vises. Skala bar er 250 μm. Kapillær lengde: 100 mm; OD: 1,5 mm: ID: 0,84 mm; filament: yeah. Klikk her for å laste ned denne figuren.
Supplerende video 1: Bildebehandling 7dpf gammel larve. (A) Filmopptak i sanntid (30 fps) fra en 7 dpf gammel larve 10 min etter at huden over hjernen er fjernet. Den levende blodstrømmen indikerer en sunn tilstand med tilstrekkelig blodtilførsel. (B) Filmopptak i sanntid (30 fps) fra samme 7 dpf gamle larve vist i Supplementary Video 1A, 2 h etter mikrokirurgi uten utveksling av ACSF og mangel på middels oksygenering. Skalalinje: 100 μm. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte metoden gir en alternativ tilnærming til hjerneisolasjon eller behandling av sebrafisk larver med legemidler som hemmer pigmentering for registrering av høyoppløselige bilder av nevroner i deres in vivo-miljø. Kvaliteten på bilder som er tatt med denne metoden, kan sammenlignes med bilder fra utplantede hjerner, men under naturlige forhold.
Videre unngås et tap i intensitet av fluorescens, fordi det ikke er behov for behandling med fikseringer18. Denne metoden er heller ikke så invasiv som å isolere en hjerne, og den består bare av ett avgjørende skritt som kan føre til feil, så sjansene for et vellykket preparat er høyere sammenlignet med hjerneutvisning. Den viktigste fordelen er at denne metoden er egnet for in vivo-bildeopptak. Forutsatt at hodeskalleåpningen utføres nøyaktig, rask og vellykket, og oksygenmetning av ACSF overvåkes regelmessig, bør hjernen være fullt funksjonell og levedyktig i flere timer. Basert på elektrofysiologiske opptak, blodsirkulasjon, pust og overlevelse av fisk i flere dager, anser vi det som sannsynlig at hud- og hodeskallefjerning ikke i stor grad er skadelig for den generelle helsen. Dermed kan denne metoden brukes til sanntidsavbildning av cellulære og subcellulære prosesser i en sunn og funksjonell hjerne uten bildeforseendende pigmentering. Denne metoden er en standard prosedyre som brukes til elektrofysiologiske registreringer av nevronal aktivitet in vivo i laboratoriet vårt og er også godt etablert i andre elektrofysiologiske laboratorier rundt om i verden19,20,21,22, som beviser at hjernens funksjon ikke er svekket av mikrokirurgi. En ulempe som må nevnes er at denne tilnærmingen bare er egnet for avbildning av dorsale og laterale hjerneregioner og ikke kan utføres gjentatte ganger med samme prøve.
Men hvis en fullt funksjonell hjerne er nødvendig for eksperimentet, bør oksygenmetningen overvåkes permanent, og om nødvendig bør ACSF i bildekammeret byttes med fersk oksygenert ACSF. Dette betyr at for langsiktige opptak må det være et alternativ å bytte den brukte ACSF med oksygenmettet ACSF uten å forstyrre bildebehandlingsprosedyren som kan løses ved hjelp av en miniatyrpumpe.
Vær oppmerksom på at hvis mikrooperasjonen ikke utføres riktig eller upresis, vil det føre til hjerneskade eller hjerneblødning som resulterer i kompromittert hjernefysiologi. Også en lav oksygenmetning i ACSF (se Supplerende video 1) eller for mye stress for larver under hele denne prosedyren kan påvirke hjernen23,24negativt . Derfor er denne metoden ikke egnet for høygjennomstrømningsanalyse, men heller for langsgående eller svært detaljert bildeopptak av bare noen få larver per tidspunkt. Derfor bør denne metoden ikke være rettet mot legemiddelscreening ved høy gjennomstrømning, men den kan brukes til å karakterisere eller validere lovende farmakologiske forbindelser i detalj, der høyoppløselig avbildning er informativ og nødvendig. For å sikre riktig hjernehelsestatus anbefales det å ikke overstige antall tre larver per studie.
Gjennom den åpne skallen er det til og med mulig å direkte bruke stoffer på hjernevevet uten å ha dem til å passere gjennom blod-hjernebarrieren. Totalt sett er metoden beskrevet her - for tiden anvendt for in vivo elektrofysiologi - en teknikk med høyt potensial i et svært bredt felt av in vivo hjerneavbildning og optogenetikk i sebrafisk larver og juveniler og kan kombineres med nevrofarmakologiske tilnærminger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker spesielt Timo Fritsch for utmerket dyrepleie og Hermann Döring, Mohamed Elsaey, Sol Pose-Méndez, Jakob von Trotha, Komali Valishetti og Barbara Winter for deres hjelpsomme støtte. Vi er også takknemlige til alle de andre medlemmene av Köster-laboratoriet for deres tilbakemeldinger. Prosjektet ble delvis finansiert av det tyske forskningsstiftelsen (DFG, KO1949/7-2) prosjektet 241961032 (til RWK) og Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF; Era-Net NEURON II CIPRESS prosjekt 01EW1520 til JCM) er anerkjent.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium chloride | Roth | A119.1 | |
| Confocal Laser scanning microscope | Leica | TCS SP8 | |
| d-Glucose | Sigma | G8270-1KG | |
| d-Tubocurare | Sigma-Aldrich | T2379-100MG | |
| Glass Capillary type 1 | WPI | 1B150F-4 | |
| Glass Capillary type 2 | Harvard Apparatus | GC100F-10 | |
| Glass Coverslip | deltalab | D102424 | |
| HEPES | Roth | 9105.4 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen (Thermo Fischer) | H3570 | |
| Imaging chamber | Ibidi | 81156 | |
| Potassium chloride | Normapur | 26764298 | |
| LM-Agarose | Condalab | 8050.55 | |
| Magnesium chloride (Hexahydrate) | Roth | A537.4 | |
| Microscope Camera | Leica | DFC9000 GTC | |
| Needle-Puller type 1 | NARISHIGE | Model PC-10 | |
| Needle-Puller type 2 | Sutter Instruments | Model P-2000 | |
| Pasteur-Pipettes 3ml | A.Hartenstein | 20170718 | |
| Sodium chloride | Roth | P029.2 | |
| Sodium hydroxide | Normapur | 28244262 | |
| Tricain | Sigma-Aldrich | E10521-50G | |
| Waterbath | Phoenix Instrument | WB-12 | |
| 35 mm petri dish | Sarstedt | 833900 | |
| 90 mm petri dish | Sarstedt | 821473001 |
References
- Hill, M. A. Embryology. Zebrafish Development. , Available from: https://embryology.med.unsw.edu.au/embryology/index.php/Zebrafish_Development (2020).
- Sassen, W. A., Köster, R. W. A molecular toolbox for genetic manipulation of zebrafish. Advances in Genomics and Genetics. Dove Medical Press. 2015 (5), 151-163 (2015).
- Singh, A. P., Nüsslein-Volhard, C. Zebrafish stripes as a model for vertebrate colour pattern formation. Current Biology. 25 (2), 81-92 (2015).
- Kalueff, A. V., et al. Time to recognize zebrafish 'affective' behavior. Brill: Behaviour. 149 (10-12), 1019-1036 (2012).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. -E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3, 522-527 (2001).
- Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling. PloS One. 6, 22991 (2011).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212, 593-598 (2003).
- Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C. F., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (Danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
- White, R., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2, 183-189 (2008).
- Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Scientific Reports. 6, 29490 (2016).
- Burr, S. A., Leung, Y. L. Curare (d-Tubocurarine). Encyclopedia of Toxicology (3rd Edition). , 1088-1089 (2014).
- Gesler, H. M., Hoppe, J. 3,6-bis(3-diethylaminopropoxy) pyridazine bismethiodide, a long-acting neuromuscular blocking agent. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 118 (4), 395-406 (1956).
- Furman, B. Alpha Bungarotxin. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2018).
- Attili, S., Hughes, S. M. Anaesthetic tricaine acts preferentially on neural voltage-gated sodium channels and fails to block directly evoked muscle contraction. PLoS One. 9 (8), 103751 (2014).
- Namikawa, K., et al. Modeling neurodegenerative spinocerebellar ataxia type 13 in zebrafish using a Purkinje neuron specific tunable coexpression system. Journal of Neuroscience. 39 (20), 3948-3969 (2019).
- Hennig, M. Theoretical models of synaptic short term plasticity. Frontiers in Computational Neuroscience. 7 (45), (2013).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Hobro, A., Smith, N. An evaluation of fixation methods: Spatial and compositional cellular changes observed by Raman imaging. Vibrational Spectroscopy. 91, 31-45 (2017).
- Knogler, L. D., Kist, A. M., Portugues, R. Motor context dominates output from purkinje cell functional regions during reflexive visuomotor behaviours. eLife. 8, 42138 (2019).
- Hsieh, J., Ulrich, B., Issa, F. A., Wan, J., Papazian, D. M. Rapid development of Purkinje cell excitability, functional cerebellar circuit, and afferent sensory input to cerebellum in zebrafish. Frontier in Neural Circuits. 8 (147), (2014).
- Scalise, K., Shimizu, T., Hibi, M., Sawtell, N. B. Responses of cerebellar Purkinje cells during fictive optomotor behavior in larval zebrafish. Journal of Neurophysiology. 116 (5), 2067-2080 (2016).
- Harmon, T. C., Magaram, U., McLean, D. L., Raman, I. M. Distinct responses of Purkinje neurons and roles of simple spikes during associative motor learning in larval zebrafish. eLife. 6, 22537 (2017).
- Zehendner, C. M., et al. Moderate hypoxia followed by reoxygenation results in blood-brain barrier breakdown via oxidative stress-dependent tight-junction protein disruption. PLoS One. 8 (12), 82823 (2013).
- Dhabhar, F. S. The short-term stress response - mother nature's mechanism for enhancing protection and performance under conditions of threat, challenge, and opportunity. Frontiers of Neuroendocrinology. 49, 175-192 (2018).
