本文旨在介绍一种基于超声成像的方法，该方法能够 体内 小鼠脑动脉血流成像。我们展示了该技术在蛛网膜下腔出血（SAH）小鼠模型中用于测定与血管痉挛相关的血流速度变化的应用。
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方法文章
利用高频经颅双功能超声分析小鼠蛛网膜下腔出血模型中的脑血管痉挛
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
蛛网膜下腔出血（一种出血性卒中）后数周内发生的脑血管痉挛，可导致迟发性脑缺血。在采用小鼠蛛网膜下腔出血模型进行实验研究时，面临的一个问题是现有方法在 体内 监测小鼠脑血管痉挛的方法尚不完善。本文展示了应用高频超声对小鼠进行经颅双功能多普勒超声检查的技术。利用该方法可识别出颈内动脉（ICA）。蛛网膜下腔出血（SAH）诱导后，颅内段ICA的血流速度显著增快，而颅外段ICA血流速度保持较低水平，提示发生脑血管痉挛。综上所述，本研究所展示的方法可实现功能性的、非侵入性 体内 监测小鼠蛛网膜下腔出血模型中的脑血管痉挛
引言
自发性蛛网膜下腔出血（SAH）是一种出血性卒中，主要由颅内动脉瘤破裂引起1。其神经功能预后主要受两个因素影响：早期脑损伤（EBI），由出血本身及其引起的短暂性全脑缺血所致；以及迟发性脑缺血（DCI），发生在出血后的数周内2,3。据报道，高达30%的SAH患者会出现DCI2。DCI的病理生理机制包括血管造影可见的脑血管痉挛、由微血管痉挛和微血栓形成导致的微循环障碍、皮质扩散性抑制以及炎症反应所引发的一系列效应4。遗憾的是，目前DCI的确切病理生理机制尚不明确，且尚无有效预防DCI的治疗方法3。因此，DCI已成为众多临床和实验研究的重点对象。
目前，大多数关于蛛网膜下腔出血（SAH）的实验研究均采用小型动物模型，尤其是小鼠5,6,7,8,9,10,11,12,13。在这些研究中，脑血管痉挛常被作为观察终点进行评估。目前通常采用离体方法测定血管痉挛的程度，原因是尚缺乏适用于活体检测脑血管痉挛的无创技术，这些理想方法应仅需短暂麻醉且对动物造成极少的应激反应。然而，若能在活体内进行脑血管痉挛的检测将更具优势，因为它可实现对小鼠血管痉挛的纵向活体研究（例如，在SAH诱导后的数天内不同时间点对脑血管痉挛进行成像观察），从而提高不同时间点所获取数据之间的可比性。此外，采用纵向研究设计也是一种减少实验动物使用数量的有效策略。
本文演示了使用高频经颅超声来测定小鼠脑动脉中的血流情况。我们表明，类似于临床实践中使用的经颅多普勒超声（TCD）或经颅彩色编码双功能超声（TCCD）14,15,16,17,18，该方法可用于监测蛛网膜下腔出血（SAH）诱导后小鼠模型颅内动脉的血流速度，从而评估脑血管痉挛。
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方案
动物实验经负责的动物护理委员会（Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz）批准，并依照德国《动物福利法》（TierSchG）进行。本研究遵循所有适用的国际、国家和机构关于动物护理与使用的指南。在本研究中，我们对11至12周龄、体重在19至21 g之间的雌性C57BL/6N小鼠的颅内和颅外动脉血流速度进行了测量。小鼠接受了SAH诱导或假手术处理，相关操作已在其他文献中详细描述10,12,13。
1. 材料准备
- 打开超声设备，并输入动物编号。
- 将超声系统的加热板预热至 37 °C，确保直肠温度探头处于可用状态。
- 使用水浴将超声耦合剂加热至 37 °C，准备好脱毛膏、电极接触膏和眼药膏。
2. 麻醉
- 将小鼠置于充满4%异氟烷和40% O2的麻醉室中1分钟以诱导麻醉。使用眼膏保护眼睛。待达到足够深的麻醉状态（对疼痛刺激无反应）后，方可继续操作。
- 在整个操作过程中，通过麻醉面罩持续给予1.5%异氟烷和40% O2以维持麻醉状态。
3. 采用经颅高频双功能超声检查测定颅内颈内动脉的血流速度
- 将小鼠俯卧位放置在超声系统加热板上，以维持其体温在 37 °C。
- 在动物四肢涂抹导电膏，并用胶带将其固定在电路板内置的 ECG 电极上。检查成像系统（例如 Vevo3100）屏幕是否正确显示生理参数（ECG、呼吸信号）。如有必要，调整麻醉深度，使目标心率达到 400–500 次/分钟（bpm）。
- 在直肠温度探头上涂抹润滑剂，小心插入以监测体温。如有需要，使用额外的加热灯。
- 首次检查前，使用脱毛膏在枕部进行化学脱毛。用棉签涂抹并揉搓脱毛膏 2 分钟，直至毛发开始脱落。
- 再等待 2 分钟后，用刮刀清除脱毛膏和脱落的毛发，并用酒精类皮肤消毒剂对皮肤进行消毒。涂抹已预热至 37 °C 的超声耦合剂。
- 使用 38 MHz 线性阵列换能器，帧率设置为高于 200 帧/秒，以采集超声图像，并将探头固定在机械臂上。将换能器置于枕部，向后倾斜 30°。
- 采用亮度（B）模式和彩色波（CW）多普勒模式，观察右侧颅内颈内动脉，并通过控制单元前后移动换能器，直至找到动脉的最大血流信号。
- 为获取解剖学信息，使用传统的 B 模式和 CW 多普勒模式，点击采集按钮开始采集。
- 为记录颅内血管的血流特征，点击脉冲波（PW）多普勒按钮，将取样容积置于血管中心，采集一段时长超过 3 秒的动态图像序列。
- 以相同方法对左侧进行操作。
- 继续检查颅外颈动脉。
4. 采用高频双功能超声检查测定颅外颈内动脉的血流速度
- 将小鼠仰卧位放置在超声系统加热板上，以维持其体温在 37 °C。
- 在动物四肢涂抹导电膏，并用胶带将其固定在电路板内置的 ECG 电极上。再次检查屏幕上生理参数是否正确显示。
- 首次检查前，使用脱毛膏按上述方法对颈部前方进行化学脱毛。将预热至 37 °C 的超声耦合剂涂抹于颈部前方。
- 采用 38 MHz 线阵探头，帧率设置为高于 200 帧/秒，以获取超声图像。将探头平行于动物体位放置，并调整位置，以获得右侧颈动脉的纵向图像。
- 使用亮度（B）模式和彩色多普勒（CW）模式观察右侧颈动脉。图像应包含右侧颈总动脉（RCC）、右侧颈内动脉（RICA）和右侧颈外动脉（RECA）。
- 为采集解剖学信息，使用传统的 B 模式和 CW 多普勒模式，点击 采集 按钮开始采集。
- 为记录颈外段颈动脉的血流特征信息，点击 脉冲波（PW）多普勒 按钮，将取样容积置于颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉的中段中心位置，并采集时长超过 3 秒的动态图像序列。
- 以相同方法对左侧进行操作。
- 终止麻醉，将动物从加热板上取出，放入置于 37 °C 恒温箱中的笼内，持续 1 小时，以防止低体温，并观察其完全恢复。
5. 超声数据的处理
- 使用外部工作站对高频超声数据进行后处理。导出 B 模式、连续波多普勒模式（CW-Doppler）和脉冲波多普勒模式（PW-Dop勒）图像及动态视频。
- 打开导出的超声检查数据。选择一只动物，打开其颅内颈动脉的脉冲波多普勒动态视频。本方案中通常记录 7 到 8 个心动周期及其相应的血流速度曲线。
- 暂停动态视频，点击 测量 按钮。选择 血管测量包，然后点击 RICA PSV 以测量收缩期峰值速度（PSV）。用鼠标左键点击速度曲线上峰值处，并将直线拉至零基线，再通过右键单击确定测量结果。
- 接着选择 RICA EDV 以测量舒张末期速度（EDV）。用鼠标左键点击舒张末期速度曲线的最低点，将直线垂直拉至零基线，再通过右键单击确定测量值。
- 选择 RICA VTI 以测量速度时间积分（VTI）。用鼠标左键在速度曲线的起点处点击，随后沿曲线移动鼠标直至舒张期平台末尾，再次右键单击以完成测量。
- 通过报告按钮导出颅内颈内动脉的数据。点击 导出 ，并将数据保存为 VSI 报告文件。
- 采用相同方法测量右侧颅外颈内动脉的 PSV、EDV 和 VTI，并相应导出数据。
- 对左侧颈动脉采取完全相同的操作步骤。
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结果
在6只小鼠中，其中3只通过血管内丝线穿孔法诱导蛛网膜下腔出血（SAH），另外3只接受假手术，分别于术前1天以及术后1、3和7天测定颅内颈内动脉（ICA）和颅外颈内动脉的血流速度。测量作为另一项研究中经胸超声心动图检查的一部分，在异氟烷麻醉下进行，同时将体温维持在37 °C19。
术前，SAH 动物与假手术动物的颅外和颅内血流速度以及颅内与颅外血流的比值相似。SAH 诱导后的第一天，颅内和颅外血流速度或颅内与颅外血流的比值均无显著变化。
在第3天和第7天，2只蛛网膜下腔出血（SAH）动物的颈内动脉（ICA）颅内血流速度明显升高，提示SAH后出现脑血管痉挛。由于颅外血流速度基本保持不变，SAH动物在第7天的颅内/颅外血流速度比值也显著升高，提示存在脑血管痉挛。
颅内和颅外ICA的代表性双功能超声多普勒记录如图所示 图1血流速度的变化过程如图所示
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讨论
据我们所知，本研究首次提出了一种利用高频经颅彩色多普勒超声在小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型中监测脑血管痉挛的实验方案。我们证实，该方法能够检测到小鼠在诱导SAH后颅内血流速度的升高。在人类医学中，这一现象已被广泛认知3,15。多项临床研究显示，颅内大动脉的血流速度升高以及颅内与颅外血流速度比值的增加，是血管狭窄的功能性表现，并与血管造影所见的血管痉挛相关（详见综述15）。因此，在临床实践中，通常采用经颅多普勒超声（TCD）或经颅彩色多普勒超声（TCCD）对SAH后脑血管痉挛进行无创性床旁监测3,15。
DCI 是影响非创伤性蛛网膜下腔出血（SAH）后神经功能预后的重要因素2,3。由于 ...
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者谨此感谢Stefan Kindel为视频中插图的准备工作。PW、MM和SHK的研究得到了德国联邦教育与研究部（BMBF 01EO1503）的支持。本工作还获得了德国研究基金会大型仪器资助项目（DFG INST 371/47-1 FUGG）的支持。MM还获得了Else Kröner-Fresenius基金会资助（2020_EKEA.144）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 巴莉亚脱毛膏 | Balea; Germany | ASIN B0759XM39V | 脱毛膏 |
| C57BL/6N 小鼠 | Janvier; Saint-Berthevin Cedex, France | n.a. | 小鼠 |
| 科尼瑞洁 | Bausch&Lomb; Rochester, NY, USA | REF 81552983 | 眼膏，润滑剂 |
| 棉签 | Hecht Assistent; Sondenheim vor der Röhn, Germany | REF 44302010 | 棉签 |
| Ecco-XS 剃须刀 | Tondeo; Soligen, Germany | DE 28693396 | 剃须刀 |
| 电极膏 | GE; Boston, MA, USA | REF 21708318 | 导电糊 |
| 加热板 | Medax; Kiel, Germany | 2005-205-01 | |
| 异氟烷 | Abvie; Wiesbaden, Germany | n.a. | 挥发性麻醉剂 |
| 白固敷 | BSN medical; Hamburg, Germany | REF 02137-00 | 胶带 |
| 机械臂 + 微操作器 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11277 | |
| 美可百抗菌擦拭布 | Paul Hartmann AG; Hamburg, Germany | REF 981387 | 抗菌擦拭布 |
| MZ400，38 MHz 线性阵列换能器 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51068-30 | 超声换能器 |
| 索诺赛德 | ASID Bonz GmbH; Herrenberg, Germany | REF 782010 | 超声耦合剂 |
| 带加热板和心电图记录功能的超声平台 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | P/N 11179 | |
| UniVet-Porta | Groppler; Oberperasberg, Germany | S/N BKGM0437 | 异氟烷蒸发器 |
| Vevo3100 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | REF 51073-45 | 超声成像设备 |
| VevoLab 软件 | VisualSonics; FujiFilm, Toronto, CA | n.a. | 分析软件 |
参考文献
- Macdonald, R. L., Schweizer, T. A. Spontaneous subarachnoid haemorrhage. Lancet. 389 (10069), 655-666 (2017).
- Macdonald, R. L. Delayed neurological deterioration after subarachnoid haemorrhage. Nature Reviews Neurology. 10 (1), 44-58 (2014).
- Francoeur, C. L., Mayer, S. A. Management of delayed cerebral ischemia after subarachnoid hemorrhage. Critical Care. 20 (1), 277(2016).
- van Lieshout, J. H., et al. An introduction to the pathophysiology of aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurosurgical Review. , (2017).
- Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J Neurosci Methods. 183 (2), 136-140 (2009).
- Momin, E. N., et al. Controlled delivery of nitric oxide inhibits leukocyte migration and prevents vasospasm in haptoglobin 2-2 mice after subarachnoid hemorrhage. Neurosurgery. 65 (5), 937-945 (2009).
- Froehler, M. T., et al. Vasospasm after subarachnoid hemorrhage in haptoglobin 2-2 mice can be prevented with a glutathione peroxidase mimetic. Journal of Clinical Neuroscience. 17 (9), 1169-1172 (2010).
- Provencio, J. J., Altay, T., Smithason, S., Moore, S. K., Ransohoff, R. M. Depletion of Ly6G/C(+) cells ameliorates delayed cerebral vasospasm in subarachnoid hemorrhage. Journal of Neuroimmunology. 232 (1-2), 94-100 (2011).
- Kamp, M. A., et al. Evaluation of a murine single-blood-injection SAH model. PLoS One. 9 (12), 114946(2014).
- Luh, C., et al. The Contractile Apparatus Is Essential for the Integrity of the Blood-Brain Barrier After Experimental Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. A Volumetric Method for Quantification of Cerebral Vasospasm in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Journal of Visualized Experiments. (137), (2018).
- Neulen, A., et al. Large Vessel Vasospasm Is Not Associated with Cerebral Cortical Hypoperfusion in a Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage. Translational Stroke Research. , (2018).
- Neulen, A., et al. Neutrophils mediate early cerebral cortical hypoperfusion in a murine model of subarachnoid haemorrhage. Scientific Reports. 9 (1), 8460(2019).
- Neulen, A., et al. Volumetric analysis of intracranial vessels: a novel tool for evaluation of cerebral vasospasm. Int J Comput Assist Radiol Surg. 14 (1), 157-167 (2019).
- Washington, C. W., Zipfel, G. J. Participants in the International Multi-disciplinary Consensus Conference on the Critical Care Management of Subarachnoid, H. Detection and monitoring of vasospasm and delayed cerebral ischemia: a review and assessment of the literature. NeuroCritical Care. 15 (2), 312-317 (2011).
- Greke, C., et al. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of defined segments of intracranial arteries. Journal of Neurosurgical Anesthesiology. 25 (1), 55-61 (2013).
- Neulen, A., Prokesch, E., Stein, M., Konig, J., Giese, A. Image-guided transcranial Doppler sonography for monitoring of vasospasm after subarachnoid hemorrhage. Clinical Neurology and Neurosurgery. 145, 14-18 (2016).
- Neulen, A., et al. Image-Guided Transcranial Doppler Ultrasound for Monitoring Posthemorrhagic Vasospasms of Infratentorial Arteries: A Feasibility Study. World Neurosurgery. 134, 284-291 (2020).
- Neulen, A., et al. Correlation of cardiac function and cerebral perfusion in a murine model of subarachnoid hemorrhage. Scientific Reports. 11 (1), 3317(2021).
- Neulen, A., et al. A segmentation-based volumetric approach to localize and quantify cerebral vasospasm based on tomographic imaging data. PLoS One. 12 (2), 0172010(2017).
- Marbacher, S., et al. Systematic Review of In Vivo Animal Models of Subarachnoid Hemorrhage: Species, Standard Parameters, and Outcomes. Translational Stroke Research. , (2018).
- Figueiredo, G., et al. Comparison of digital subtraction angiography, micro-computed tomography angiography and magnetic resonance angiography in the assessment of the cerebrovascular system in live mice. Clinical Neuroradiology. 22 (1), 21-28 (2012).
- Lindegaard, K. F., Nornes, H., Bakke, S. J., Sorteberg, W., Nakstad, P. Cerebral vasospasm diagnosis by means of angiography and blood velocity measurements. Acta Neurochirurgica. 100 (1-2), 12-24 (1989).
- Cassia, G. S., Faingold, R., Bernard, C., Sant'Anna, G. M. Neonatal hypoxic-ischemic injury: sonography and dynamic color Doppler sonography perfusion of the brain and abdomen with pathologic correlation. American Journal of Roentgenology. 199 (6), 743-752 (2012).
- Shen, Q., Stuart, J., Venkatesh, B., Wallace, J., Lipman, J. Inter observer variability of the transcranial Doppler ultrasound technique: impact of lack of practice on the accuracy of measurement. Journal of Clinical Monitoring and Computing. 15 (3-4), 179-184 (1999).
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