Summary
该协议描述了一种使用探针尖端超声处理产生大量脂质封装的十氟丁烷微气泡的方法，然后使用高压挤出和机械过滤将它们冷凝成相移纳米滴。
Abstract
有许多方法可用于生产用于成像和治疗的可蒸发相移液滴。每种方法都使用不同的技术，并且在价格，材料和目的方面有所不同。许多这些制造方法导致具有不均匀激活阈值的多分散群体。此外，控制液滴大小通常需要稳定的全氟碳液体，其高活化阈值在体内是不切实际的。使用低沸点气体产生均匀的液滴尺寸将有利于体内成像和治疗实验。本文介绍了一种简单而经济的方法，用于形成具有低沸点十氟丁烷（DFB）的尺寸过滤脂质稳定的相移纳米滴。描述了产生脂质微气泡的常用方法，以及一种在单个步骤中用高压挤出冷凝它们的新方法。该方法旨在节省时间，最大限度地提高效率，并使用许多生物实验室中的常见实验室设备为各种应用生成更大体积的微气泡和纳米滴解决方案。
Introduction
超声造影剂（UCA）在成像和治疗应用中迅速普及。微气泡是最初的UCAs，目前是临床诊断应用中使用的主流药物。微气泡是充满气体的球体，通常直径为1-10μm，周围是脂质、蛋白质或聚合物壳1。然而，它们的大小和体内稳定性会限制它们在许多应用中的功能。相移纳米滴含有过热的液芯，由于其尺寸更小，循环寿命更高，因此可以克服其中一些限制2。当暴露于热或声能时，过热的液芯蒸发形成气体微气泡2，3，4，5。由于汽化阈值与液滴大小5，6直接相关，因此配制大小均匀的液滴悬浮液对于实现一致的活化阈值是非常理想的。产生均匀液滴尺寸的配方方法通常复杂且成本高昂，而更具成本效益的方法则会产生多分散解决方案7。另一个限制是能够产生具有低沸点全氟化碳（PFC）气体的稳定相移液滴，这对于体内高效活化至关重要8。在这份手稿中，描述了一种方案，用于产生稳定的过滤的低沸点可汽化相移液滴，用于体内成像和治疗应用。
生产单分散亚微米相移液滴的方法有很多7。控制尺寸的最可靠方法之一是使用微流体装置。这些设备可能成本高昂，液滴产生速度慢（约104-106滴/秒）7，并且需要广泛的培训。微流体装置通常还需要高沸点气体，以避免系统自发汽化和堵塞7。然而，de Gracia Lux等人最近的一项研究表明，如何使用低沸点十氟丁烷（DFB）或八氟丙烷（OFP）冷却微流体来产生高浓度的亚微米相移（1010-1012 / mL）。
通常，低沸点气体（如DFB或OFP）使用预制气泡更容易处理。前体脂质稳定的气泡可以通过使用低温和高压冷凝气体来产生可蒸发的液滴5，10。使用该方法产生的液滴浓度取决于前体微气泡浓度和气泡转化为液滴的效率。据报道，从接近1010 MB / mL11的尖端超声处理 >中报告了浓缩微气泡，而另一项研究报告了来自冷凝的OFP和DFP气泡的约1-3 x1011 液滴浓度12。当单分散液滴不是问题时，冷凝方法是使用低沸点PFC产生脂质稳定相移液滴的最直接，成本最低的方法。在冷凝前产生均匀尺寸气泡的方法可以帮助创建更多的单分散液滴群。然而，产生单分散的前体气泡也很困难，需要更昂贵的方法，如微流体或重复的差异离心技术11。最近发表了一种使用脂质体中液滴的自发成核来生产DFB和OFB纳米滴的替代方法13。这种方法利用"茴香烈酒"效应，是一种产生低沸点PFC液滴的简单方法，无需冷凝气泡。PFC液滴的大小分布可以通过精细滴定和混合用于启动液滴成核的PFC，脂质和乙醇组分来控制。同样值得注意的是，全氟化合物的混合可用于控制纳米滴的稳定性和活化阈值14，15。Shakya等人最近的工作证明了如何通过乳化碳氢化合物内骨骼中的高沸点PFC来调节纳米液滴活化，以促进液滴核心内的异质成核16，这是一种可以与其他形式的液滴尺寸过滤一起考虑的方法。
一旦形成，相移液滴可以在形成后挤出，以产生更多的单分散种群。事实上，Kopechek等人之前已经发表了与这里描述的方法类似的协议，使用 高沸点十二氟戊烷（DDFP）作为液滴核心。希望使用具有高沸点全氟化碳（在室温下稳定）的相移液滴的读者应参考上述文章。产生和挤出具有低沸点气体的液滴（如DFB和OFP）更为复杂，最好通过冷凝预制气泡来处理。
在该协议中，描述了使用探针尖端超声处理用DFB气芯生成预制脂质微气泡的常用方法。接下来，使用商用挤出机将预制的微气泡冷凝成亚微滴（图1）。然后，产生的液滴可以通过热和超声波激活。与传统的缩合方法相比，该方法可以产生更大体积的纳米滴溶液，具有更窄的尺寸分布，而无需昂贵的微流体装置。生产具有窄尺寸分布的纳米滴溶液可能会产生更均匀的汽化阈值。这将最大限度地发挥它们在成像、消融、药物递送和栓塞等众多应用中的潜力1，3，4，6。
图1：用于将预制微气泡冷凝成相移纳米滴的高压挤出装置示意图。 微气泡溶液被添加到挤出机腔室中并包含在挤出机腔室中，并且从氮气罐中通过腔室进气阀施加250 psi。氮气将推动微气泡溶液通过腔室底部的过滤器，将样品冷凝成纳米滴。溶液最终通过样品出口管被挤出机推出并收集。 请点击此处查看此图的放大版本。
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Protocol
1. 制作脂质薄膜
- 使用90%DSPC和10%DSPE-PEG2K制备用于微气泡生成的脂质薄膜，方法是使用以下方向以正确的比例混合脂质：
- 在氯仿中制造DSPC和DSPE-PEG2K的储备脂质。在单独的小瓶中称量50mg每种脂质粉末。使用1 mL玻璃注射器向每个小瓶中加入1 mL氯仿。
- 使用玻璃注射器将287μLDSPC储备液和113μLDSPE-PEG2K储备液（均为50mg / mL）加入20mL闪烁小瓶中。
- 用氮气干燥混合脂质以除去氯仿。使用与室内氮气连接的适当长度的管道，在混合时在小瓶的顶部空间上轻轻流动氮气。继续直到没有观察到氯仿，剩余的脂质膜开始变白。使用聚丙烯螺旋盖，盖上样品，同时在顶空引入氮气。
- 使用真空干燥器将小瓶置于真空下过夜，以除去任何残留的氯仿。将保留一层薄薄的半透明薄膜，覆盖小瓶的底部。
- 将小瓶储存在-20°C直至需要。
2. 从脂质薄膜产生微气泡
- 为了产生微气泡，将10 mL含有20%v / v丙二醇和20%v v甘油（最终pH 7.2-7.4）的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）加入干燥的脂质膜中。
- 将样品重新盖上盖子，并将样品加热到65°C，在加热块（或热水浴）上30分钟。
- 当样品变暖时，通过将浴温升高至65°C来准备浴超声仪。
注意：如果在放入浴超声仪之前，将水在微波炉或电炉中预热，则此过程会更快。 - 将含有加热样品的闪烁小瓶置于浴超声仪中，以便只有含有脂质溶液的小瓶部分浸没在水浴中。
- 超声处理温脂溶液至少15分钟。确保水温保持在65°C。 继续以10-15分钟的间隔超声处理，直到溶液完全清除（图2）。
注意：如果没有浴液超声仪，可以以10%的功率对溶液进行超声处理，直到变清。但是，微尖端会磨损得更快，更换成本更高。
图2：水合脂质膜的示例。 水合脂膜（A）在浴超声处理前和（B）浴后形成单层囊泡的例子。在浴超声处理后，脂质溶液应从更不透明溶液转变为半透明溶液。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 在仍然温暖时，取下盖子并将小瓶夹入超声仪的隔音外壳中，以便声波器的微针接头浸没在空气/液体界面下方（图3）。
- 将十氟丁烷罐放在超声仪的隔音外壳旁边。
- 准备一个冰浴，并将其放在隔音外壳旁边。这将在后面的步骤 2.14 中使用。
- 打开声波器的电源开关。
- 系统启动后，将功率级别设置为 70%。使用微针接头不要超过70%的振幅。此时不要启动超声仪。
- 安装适当长度的管子，将气体从DFB罐出口引导到外壳中保存的温脂溶液中。管子应刚好放入小瓶的颈部，以使气体在超声处理期间流入顶部空间（图3）。
- 缓慢打开罐阀，直到可以看到气体流过脂质溶液。这将在液体表面引起轻微的涟漪。如果气体流量过高，溶液将在微气泡形成过程中溢出。
- 启动超声仪并连续运行10秒以产生微气泡。如果气泡溶液在超声处理过程中开始溢出，请立即停止超声处理器。
- 关闭声波器并立即关闭 DFB 罐阀。
- 快速盖上微气泡溶液并将小瓶浸没在冰浴中，将样品冷却到55°C以下（DSPC的玻璃化转变温度）
- 将微气泡样品留在冰浴中，直到需要。
图3：将探针尖端置于脂质溶液中以优化微气泡形成。 注意不要让探头的尖端接触玻璃。 请点击此处查看此图的放大版本。
3. 制备挤出机进行微气泡冷凝
- 使用200 nm陶瓷过滤器（由制造商提供）组装用户手册中详述的高压挤出机。
- 将挤出机放在水密容器的中心，使样品出口管不会压在侧面或卷曲。
- 使用制造商提供的适配器将挤出机连接到氮气罐。
- 使用400mL水和10g氯化钠在挤出机周围的水密容器中进行-2°C盐渍冰浴。
- 将出口管的末端置于闪烁小瓶中以收集挤出的样品。
注意：如果管子没有平放或留在小瓶内，请用胶带将管子固定在容器上。
4. 启动挤出机以进行微气泡冷凝
- 打开和关闭释放阀，以确保挤出机内没有压力。
- 取下腔室盖，将 5 mL 1x PBS 加入挤出机腔室。
- 盖上盖子，确保盖子牢固地卡回原位。
- 打开氮气罐，使压力表读数为250 psi。确保压力控制阀处于关闭位置。
- 关闭气罐并打开挤出机腔进气阀。PBS溶液将通过系统推出，并从样品出口管中进入闪烁小瓶。
- 当只有气体离开管道时，打开释放阀，让压力降至0 psi。
- 取出闪烁小瓶。
5. 挤出前冷却微泡
- 打开和关闭释放阀，以确保挤出机内没有压力。在出口管的末端放置一个新的闪烁小瓶。
- 用2-甲基丁烷填充钢制容器，并加入干冰，将温度降至-18°C。
- 将微气泡溶液插入冷却的2-甲基丁烷中，使样品浸没2分钟。在整个2分钟内移动闪烁小瓶以轻轻混合气泡。根据需要加入干冰，以保持温度在-15至-18°C之间。 注意不要超过-20°C，否则赋形剂溶液会冻结并破坏气泡样品。
注意：步骤5.2和5.3也可以通过在实验室冰箱中冷却气泡样品更长的时间来完成。但是，应谨慎地仔细监测冰箱的温度，避免冻结样品。 - 2分钟后，从冷却的2-甲基丁烷中除去微气泡，轻轻摇动小瓶以混合微气泡，并使用冷却的10 mL注射器将溶液转移到挤出机中。
- 取下挤出机腔室盖，通过缓慢推动注射器上的柱塞，将微气泡溶液添加到腔室中。更换挤出机盖，确保其卡回原位。
- 验证挤出机的压力控制阀和释放阀是否处于关闭位置。
- 打开氮气罐，直到压力表读数为250 psi，关闭气罐，然后将压力控制阀旋转到打开位置。
- 当溶液在出口管处填充闪烁小瓶，并且只有气体离开管时，慢慢打开压力释放阀，让压力下降到0 psi。
- 将闪烁小瓶放入冰浴或冰箱中储存。
- 为了长期储存并最大限度地减少自发汽化，请将样品储存在标准冰箱中。确保温度为-20°C或更高，以避免冻结样品（20%PPG和20%甘油的赋形剂溶液将防止样品在大多数实验室冷冻室中冻结）。
6. 通过离心从脂质体中分离液滴
- 将10mL挤出的液滴溶液转移到15mL离心管中。
- 在4°C下以1，500× g 离心挤出的样品10分钟。 由DFB纳米滴组成的沉淀将在管的底部明显（图4）。自发汽化的液滴将出现在溶液的顶部，应丢弃。
图4：离心后相移DFB液滴沉淀的示例。 DFB纳米滴比脂质体更致密，并将聚集在离心管底部的沉淀中（红色盒子）。 请点击此处查看此图的放大版本。
- 除去上清液并将沉淀重悬于2 mL的1x PBS中，其中含有20%甘油和20%丙二醇。
- 轻轻混合管以获得均匀的溶液，并将液滴转移到较小的2mL离心管中。
- 在2 mL离心管中再洗涤样品两次。
- 最后一次洗涤后，将沉淀重悬于100μL1x PBS与20%甘油和20%丙二醇中，并储存在冰上或冰箱中直到需要。
7. 液滴汽化的显微镜验证
- 通过将2.5μl浓缩液滴加入7.5μl1x PBS中来制备稀释的液滴溶液。
- 用10μl稀释的样品制备显微镜载玻片。使用40倍物镜观察样品并保存图像。
- 从显微镜中取出载玻片并将其放在65°C的加热板上1分钟，以将纳米滴蒸发成微气泡。
- 使用相同的40x物镜在加热后观察样品，以验证液滴汽化。
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Representative Results
使用动态光散射（DLS）和可调阻脉冲检测（TRSP）分析，包括尺寸分布的代表性结果。图5显示了有和不带挤出的冷凝气泡溶液的尺寸分布。在没有挤出的情况下，实验方案在步骤5.3结束。冷却的气泡通过在冷时将样品排放到大气压来冷凝。仅浓缩的样品具有更宽的分布，集中在400nm附近。挤出的样品具有较窄的分布，集中在200nm处。两个样本都包括脂质体和液滴，使用DLS无法识别。图6显示了通过离心洗涤以除去过量脂质体后的相移液滴的代表性样品（步骤6.7）。TRPS用于该分析，以单独评估液滴的大小分布和浓度。与DLS类似，TRPS显示液滴大小接近200nm。在1 mL中重悬所有100μL最终液滴溶液后，浓度范围为每mL1011-1012液滴。TRPS数据是每个样品三次测量的平均值。
图7显示了加热时纳米滴蒸发的代表性显微镜数据。在 图7A （汽化前）中，一些微气泡在视野中很明显（白色箭头）。这是由于过热的纳米滴管在室温下制备和成像显微镜载玻片时自发汽化。加热后，观察到大的微气泡（图7B）。这里的数据不会在汽化后立即捕获气泡。气泡的聚结很可能发生在汽化之后，然后才能重新成像。该策略可用于在TRPS施胶或在体内使用之前确认纳米滴的存在。
在冷凝之前冷却气泡是最大化液滴产量的关键步骤。 图8 显示了汽化后液滴的代表性图像，当不进行冷却时（图8A），挤出机冷却至0°C，但微气泡未冷却至-18°C（图8B），以及当精确遵循协议时（图8C）。
正如所写的那样，该协议也被实施，以冷凝低沸点OFP气泡。 图9 显示了从热中汽化之前和之后的OFP液滴的代表性图像。与DFB液滴一样，加热后可能会产生大量的聚结。因此，气泡大小不太可能代表汽化时的初始液滴或气泡。造粒和显微镜检查确实证实了相移OFP液滴的存在和活性。
图 5：动态光散射数据比较液滴悬浮液与（实线）和不具有（虚线）挤出。 使用DLS光散射系统在冷凝和挤出后立即测量样品。此处显示的数据是每个样品三次测量的平均值。在洗涤之前进行分析。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6：来自TRPS分析的过滤的十氟丁烷液滴的尺寸分布。 数据来自单个样品的三次测量的平均值。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7：汽化前后的相移十氟丁烷液滴的示例显微镜图像。 （A）在汽化之前可以观察到一些气泡，可能是由于低沸点DFB液滴自发汽化成气泡（在室温下进行显微镜检查）。（B）加热后观察到微气泡显着增加。比例尺为10μm， 请单击此处查看此图的放大版本。
图 8：在不同温度下冷凝的相移液滴汽化后的显微镜图像示例。 （A） 微气泡直接插入挤出机，无需预冷。（B）挤出机在冰浴中冷却至0°C，微气泡插入腔室中并使其平衡2分钟。（C）挤出机在冰浴中冷却至0°C，微气泡在放入挤出机之前预冷却至-18°C2分钟。预冷的微气泡通常具有较小的尺寸和更高的液滴产量。比例尺为10μm， 请点击此处查看此图的放大版本。
图9：汽化前后相移八氟丙烷液滴的显微镜图像示例。 比例尺为10μm， 请单击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
有一套全面的文献，讨论了微气泡和相移液滴在体内成像和治疗中的配方、物理原理和潜在应用。该讨论明确涉及产生脂质微气泡，并使用低沸点DFB气体和高压挤出将其转化为亚微米相移液滴。这里概述的方法旨在通过将先前的微气泡缩合方法与液滴挤出相结合，提供一种相对简单的生产大量脂质微气泡和DFB相移液滴的方法。这种方法具有产生高浓度气泡的优点，用于形成基于过滤器选择的具有窄尺寸分布的DFB液滴。由于产生的样品汽化阈值一致，因此尺寸分布狭窄。与用于生成窄大小分布的其他常用方法相比，此方法更简单且成本更低。此外，溶液的潜在体积大于其他可比方法。该协议可分为三大类：（1）产生脂质微气泡，（2）冷凝和挤出微气泡，（3）通过离心从脂质体中分离相移液滴。
使用探针尖端超声处理产生微气泡是制造脂质微气泡的更常见方法之一。有许多出版物描述了此过程。该协议改编自Feshitan等人11 ，并经过优化以制造10 mL微气泡溶液，这是台式挤出机的最大容量。该方法还可以通过去除微量滴定附并将脂质溶液体积增加到100 mL或更多来放大以产生更大体积的脂质微气泡溶液，如Feshitan等人11所示。同样，可容纳100 mL至800 mL体积的大型商业规模挤出机可用于容纳增加的微气泡体积，从而最大限度地提高液滴产量。该方法的结果仅受所用设备的限制，可以对其进行修改以相应地增加体积。由于蒸发阈值更均匀，尺寸过滤液滴生产对各种应用都有好处。可以对方案进行未来的修改，以针对特定需求对结果进行个性化，例如将微气泡和液滴壳功能化以用于抗体负载和分子靶向。
这里使用的挤出方法通常用于单分散脂质体制备。过去也使用过类似的方法，使用较高沸点的DDFP液滴17生成相移液滴。该描述的方法存在一些关键差异，即（1）用低沸点气体（DFB）产生预成型微气泡，（2）冷却气泡溶液和挤出机系统以有效形成液滴和（3）快速施加压力以最大限度地提高液滴冷凝效率并避免气泡气体溶解10。
冷却微气泡样品以进行挤出是产生高浓度稳定DFB液滴的关键步骤。在该协议中，将整个挤出机置于含有冰浴的盐中并保持在-2°C。 挤出机具有用于循环流体的入口和出口口，以实现更高效，更快速的冷却，需要循环泵。对于DFB液滴生产，可以在没有循环水系统的情况下产生高浓度的液滴（1011-1012液滴/ mL）。然而，通过包括冷循环浴，可以进一步提高液滴生产效率，从而减少冷却的等待时间。这种确切的协议也用于OFP微气泡。有趣的是，当使用显微镜观察时，OFP气泡似乎更多，更小（图9），尽管洗涤和收集颗粒后液滴的产量明显较低。进一步冷却挤出机并增加氮气罐的压力可能会改善OFP液滴的产生。众所周知，OFP液滴也非常不稳定，需要轻柔处理和适当的储存条件，以尽量减少自发汽化。
快速施加压力是该程序中的另一个关键步骤。在该协议中使用挤出取决于压力的积累以及该压力的立即施加到挤出机腔室中的微气泡上。在标准脂质挤出方案中，压力缓慢增加，直到样品开始通过膜过滤器。实验观察表明，缓慢施加压力可能导致气体从气泡芯中溶解，而不是将气泡冷凝成液滴。因此，决定通过关闭进气阀并将罐压设置为250 psi，用氮气"预处理"挤出机进气管。然后，在打开挤出机的进气阀之前，必须关闭罐体。不遵循这部分程序将导致快速排出和样品从挤出机的出口丢失。即使罐正确关闭，高于250 psi的压力也可能导致样品损失，因为样品快速排出。在准备、完成步骤或以任何方式使用挤出机时，应注意检查压力表和阀门。如果压力没有降至零或溶液没有像预期的那样离开挤出机，首先检查所有阀门是否处于正确的位置;压力释放阀始终可以打开以释放压力，而不会影响腔室内容物。同样重要的是，当压力施加到挤出机上时，要注意逸出的气体并观察压力表。通常，如果施加压力，则溶液将开始从出口管中出来，或者系统中存在泄漏。在向腔室中添加微气泡溶液之前，请务必确保对系统进行预处理，以确保挤出机正确组装。随着时间的推移，O形圈会磨损并阻止系统正确密封。为获得最佳效果，请确保所有部件正常工作并形成紧密密封。在这里概述的协议中，只进行了一次挤出。通过将液滴样品重新引入挤出机并执行多个挤出步骤（通常在5到10之间），可以进一步缩小尺寸分布。多次挤出可能会降低液滴的总产量。考虑到DLS和TRSP的尺寸分布，对于大多数应用来说，单个挤出可能就足够了。最后，该协议已针对200 nm滤光片进行了优化。压力可能需要针对更大或更小的过滤器尺寸进行优化。
样品成功挤出后，应进行测试，以检查气泡是否正确凝结成液滴。使用标准光成像技术看不到亚微米级液滴，因此必须首先将其蒸发才能变得更加可见6。在汽化之前对样品进行成像以验证是否存在微气泡或在加热液滴之前确定自发汽化水平仍然很重要。成像软件可用于计算和调整图像中的微气泡，以间接提供有关纳米滴的数据。但是，应该注意的是，在汽化之后，气泡将在变暖过程中迅速凝聚。因此，显微镜分析的气泡大小和计数可能无法反映初始液滴的大小和浓度。如果可用，最好使用可调谐电阻脉冲检测（TRPS）直接测量液滴分布和浓度。已经提供了来自TRSP的代表性液滴分布数据（图6）。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢Ken Hoyt博士实验室的Dominique James为可蒸发的相移纳米滴提供TRSP分析。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Falcon | 352095 | Collecting and centrifuging droplets |
| 200 nm polycarbonate filter | Whatman | 110606 | Extruder filters |
| 2-methylbutane | Fisher Chemical | 03551-4 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| 3-prong clamps X2 | Fisher | 02-217-002 | Holding scintilation vials in place for probe tip sonication |
| 400W Analog Probe Tip Sonicator with Horn | Branson | 101-063-198R | Used to generate lipid microbubbles from lipid solution |
| Bath Sonicator | Fisher Scientific | 15337402 | Used to help breakdown liposomes into unilamellar vesicles |
| Chloroform | Fisher Bioreagents | C298-4 | Used to make lipid film for microbubble preperation |
| Decafluorobutane (Perfluorobutane) Gas | FluoroMed L.P. | 1 kg | generating microbubbles via probe tip sonication |
| Dry Ice | - | - | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion |
| DSPC Lipid Powder | NOF America | COATSOME MC-8080 | Component of lipid film |
| DSPE-PEG-2K Lipid Powder | NOF America | SUNBRIGHT DSPE-020CN | Component of lipid film |
| General Thermometer | - | - | Used to measure ice bath temperature and 2-methylbutane temperature ( needs to accommodate -20C temperatures) |
| Glass Syringes | Hamilton | 81139 | Used to mix lipids in chloroform |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Heating Block | VWR Scientific Products | Heating lipid films and vaporizing droplets | |
| Lipex 10 mL Extruder | Evonik | Commercial high-pressure extrusion system | |
| Mini Vortex Mixer | Fisher brand | 14-955-151 | Used to remove excess chloroform from lipid films |
| Nitrogen Tank | - | - | Used to operate extruder |
| Phosphate Buffer Saline | Fisher Scientific | Hydrate lipid films and washing droplets | |
| Polyester Drain Disk | Whatman | 230600 | Provides support for polycarbonate filter |
| Polypropylene Caps | Fisher Scientific | 298417 | Used for solution storage |
| Propylene Glycol | Fisher Chemical | P355-1 | Reduces freezing temperature of PBS solution |
| Scintiliation Vials | DWK Life Sciences Wheaton | 986532 | Used for lipid films and microbubble generation |
| Small hammer | - | - | Used to break apart dry ice for cooling methylbutane |
| Sonicator Microtip Attachment | Branson | 101148070 | Used to generate microbubbles from lipid solution |
| Steel Container | Medegen | 79310 | Rapid precooling of microbubble solution prior to extrusion ( any container rated to -20C will work) |
| Vacuume Dessicator | Bel-Art SP Scienceware | 08-648-100 | Removes excess chloroform from lipid films |
| 2mL Centrifuge Tube | Fisher | 02682004 | Used for concentrating nanodroplets |
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